Количественное Цитозольные против вакуолярной<em&gt; Сальмонелла</em&gt; В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Резюме

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Аннотация

Внутриклеточные бактериальные патогены могут размножаться в цитоплазме или в специализированных патогенов, содержащих вакуолей (PCVs). Чтобы добраться до цитозоль, бактерии, как Shigella Флекснера и Francisella novicida нужно вызвать разрыв фагосомы. В отличие, сальмонелла Typhimurium реплицируется в вакуолярной купе, известный как Salmonella -содержащего вакуоли (SCV). Однако некоторые мутанты Salmonella не поддерживать SCV целостность и, таким образом, выпущен в цитозоль. Процент цитозольного против вакуолярных бактерий на уровне отдельных бактерий может быть измерена дифференциальной проницаемости, также известный как фагосомы-анализ защиты. Подход делает использование имущества моющего средства дигитонина селективно связываться холестерина. Поскольку плазматической мембраны содержит больше холестерина, чем других клеточных мембран, дигитонин может быть использован, чтобы селективно проницаемыми плазматическую мембрану, оставляя внутриклеточных мембранбез изменений. Короче говоря, после инфицирования патогеном, экспрессирующих флуоресцентный белок-маркер (например mCherry среди прочих), плазматической мембраны клеток-хозяев в проницаемыми с короткой инкубации в дигитонин, содержащей буфер. Затем клетки промывали и инкубировали с первичным антителом (соединенный с флуорофора выбора), направленный против бактерии выбора (например, анти-Salmonella -FITC) и снова промывают. Если немаркированных бактерии используется дополнительная стадия может быть сделано, в котором все мембраны проницаемыми и все бактерии окрашивали с соответствующим антителом. После окрашивания, процент вакуолярных и цитоплазмы бактерий может быть количественно FACS или микроскопа путем подсчета одинарные или двойные-положительных событий. Здесь мы предлагаем экспериментальные детали для использования этой техники с бактерией Salmonella Typhimurium. Преимущество такого анализа является то, что, в отличие от других анализа, он обеспечивает количественную на уровне одного bacteРИА, и если анализировали с помощью микроскопии обеспечивает точное число цитозольного и вакуолярных бактерий в данной клетке.

Введение

Внутриклеточные бактериальные патогены репликации либо непосредственно в цитозоль клетки-хозяина, или в специализированных вакуолярных отсеков ^1. Во время начальной стадии инфекции большинство патогенных микроорганизмов получают усвоены либо фагоцитоза специализированных клеток (например, макрофагов), либо активно продвигает свою собственную поглощение в не-фагоцитирующих клеток. В фагоцитирующих клеток, как правило, фагосомы сливается с лизосомы сформировать деструкции отсек, где фагоцитированы частицы переваренной. Специализированный цитозольные бактерии, такие как Francisella novicida или Shigella Флекснера, бежать деградации phagosomal, вызывая разрыв фагосомы и впоследствии бежать в цитозоле ^2,3. Это требует вирулентности-ассоциированных механизм таких как Francisella острова патогенности (FPI) или Shigella Флекснера T3SS, который впрыскивает эффекторные белки, которые способствуют вакуолярной разрыв ^2-4. Особенности клетка-хозяин цитозольныеКоличество сохраняемых распознающих рецепторов, которые обычно признают наличие возбудителей и вызывают иммунной сигнализации ^5. Кроме того, xenophagy, антимикробное форма аутофагии может ухудшить бактерии, которые попадают в цитозоль. Цитозольные бактерии, как правило, хорошо приспособлены к притупить или обойти эти ответы с помощью различных стратегий. Например, Francisella изменяет свои LPS, чтобы избежать признания хоста и шигеллы предотвращает набор аутофагии с помощью секретируемых белков эффекторные ^6,7.

Другая стратегия, чтобы избежать деградации лизосомами используется в модели вакуолярный возбудителя Salmonella enterica серовар Typhimurium, после называют Salmonella Typhimurium. Сальмонелла использует T3SS чтобы придать эффекторы, что переделывать первоначальный фагосомы в его внутриклеточной ниши, сальмонеллы -содержащего вакуоли (ПЗК) ^8,9. Непрерывная манипуляции принимающих путей являетсянеобходимо сохранить эту вакуоль по вербовке липидов и других питательных веществ в вакуоли. Действительно, SIFA мутант Salmonella не удается поддерживать стабильность вакуолярной, и входит в цитозоле клеток-хозяев в течение нескольких часов после заражения, что приводит к активации врожденного иммунитета путей и аутофагии набора ^8. Вакуолярной побег Salmonella варьируется в зависимости от типа клеток, что является исследования, и несколько отчетов показали, что в эпителиальных клетках даже БТ Сальмонелла может избежать SCV и hyperreplicate в цитозоле ^10. Последние отчеты показывают, что врожденная иммунная обнаружения патогенов вакуолярных также зависит от способности хозяина, чтобы признать и дестабилизировать патогенов, содержащий вакуоли (PCVs) ^11-14.

Учитывая, что оба хоста или бактерии генотип может влиять на распределение внутриклеточных бактерий между вакуолярную и цитозольной отсека, необходимо определить число вакуоли VS.цитозольные бактерии. Так, в большинстве экспериментальных установок клетки-хозяева инфицированы более чем одной бактерии, и в дальнейшем может питать несколько бактерий в различных субклеточных отсеков, метод необходим, что позволяет количественной на уровне отдельных бактерий. Дифференциальный пермеабилизации (также известный как защита phagosomal анализа) обеспечивает эту резолюцию ^2,4,10,12. Анализ основан на селективной проницаемости мембраны клетки-хозяина плазмы с моющим средством дигитонин, что оставляет нетронутыми вакуоли мембраны и, таким образом, позволяет избирательно окрашивание цитоплазмы бактерии с антителами. Здесь мы предлагаем два протокола для количественного определения цитозольного и вакуолярной Salmonella Typhimurium, используя дифференциальный пермеабилизации. Принцип этого метода описан в рисунке 1: костный мозг, полученные макрофаги (BMDMs) заражены стационарной фазы mCherry-выражения сальмонеллы. Стационарная фаза сальмонеллы нужно тО быть использованы, потому что они подавляют экспрессию SPI-1 T3SS, чья деятельность в противном случае будут признаны инфламмасома NLRC4 и вызывают быструю смерть клеток (pyroptosis) в BMDMs ^15. После инфекции клетки промывают и обрабатывают 50 мкг / мл дигитонина в течение 1 минуты. Клетки снова промывают сразу и инкубировали с анти-антител сальмонеллы, соединенных с FITC, чтобы отметить бактерии с доступом в цитозоль. После дополнительного этапа промывки клетки лизируют и процент mCherry + (вакуоли) и FITC + / + mCherry (цитозольного) бактерий определяется FACS. Мы также сообщают об адаптации этого метода, которые могут быть использованы, если нет флуоресцентные штаммы, экспрессирующие белок не доступны (рисунок 2). Дополнительные шаги вводятся после FITC маркировки, в котором клетки фиксированной и полностью проницаемыми. После этого все бактерии окрашивали анти Salmonella антител и соответствующих вторичных антител. Detотражения затем сделать с помощью микроскопии вместо анализа FACS.

протокол

1. дигитониновым Проба с mCherry-выражения сальмонеллы (FACS-анализа на основе)

1. Подготовка бактерии
   Примечание: Salmonella дикого типа SL1344 (Стрептомицин устойчива) выражают mCherry из плазмиды, кодирующей (pFPV mCherry под РПСМ промотора) используется в данном анализе. Бактериальный фагоцитоз и пролиферация, где не меняется при конститутивной экспрессии mCherry (данные не показаны) ^16.
   1. Инокуляции деформации за 1 день до инфекции в 3 мл LB среды с добавлением стрептомицина (90 мкг / мл) и ампициллином (100 мкг / мл, экспрессирующих вектора mCherry) в шейкере при 37 ° CO / N.
2. Покрытие клетки для инфекции.
   1. BMDMs семян дикого типа в 24-луночный планшет при плотности 1,25 × 10 ⁵ клеток / лунку в 1 мл первичной макрофагов среде Игла (DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS, инактивированной нагреванием, 56 ° С, 30 мин ), 1% HEPES, 1% заменимых аминокислот (NEA), 1% L-глутамина и 10% L929 супернатант (кондиционированную среду из макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) получение клеток L929). Семенной скважины в соответствии с таблицей 1 для учета индивидуальных условий. Добавить покровные для скважин, используемых в качестве контроля (таблица 1).
   2. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО _2.

			Пермеабилизирующего		Окрашивание
	Стекло покровное	Сальмонелла	Дигитониновым	Сапонины	анти-сальмонелла	анти-калнексину	анти-PDI
А1 (образец)	- / + *	+	+		+
А2 (образец)	- / + *	+	+		+
А3 (образец)	- / + *	+	+		+
А4 (без управления пермеабилизации)	- / + *	+			+
А5 (полный контроль пермеабилизации)	- / + *	+		+	+
В1 (окрашивали калнексину)	+					+
В2 (окрашивали калнексину)	+		+			+
В3 (окрашивали калнексину)	+			+		+
С1 (окрашенныхдля PDI)	+						+
С2 (окрашивали PDI)	+		+				+
С3 (окрашивали PDI)	+			+			+

Таблица 1: Схема Покрытие для костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) в формате 24-луночного для последующего инфицирования Salmonella, проницаемости и окрашивания * В зависимости от того, протокол 1 или протокол 2 делается..

3. Подготовка бактерии инфекции.
   1. На следующий день, определения концентрации Salmonella в течение ночи культуры путем разбавления культуры 1:10 в PBS и измерения OD ₆₀₀ против единственного управления PBS. Это гарантирует, что OD ₆₀₀ измеряется в лInear диапазон спектрофотометра.
   2. Рассчитайте концентрацию Salmonella на миллилитр. OD600 1 соответствует 1 · 10 ⁹ бактерий.
   3. Развести бактерии в среде макрофагов, чтобы достичь концентрации Salmonella 1,25 × 10 ⁶ клеток / мл.
4. Заражение клеток Salmonella.
   1. Удалить из среды BMDMs. Добавить 1 мл среды для макрофагов неинфицированных контрольных скважин (B1-B3, C1-C3). Добавить 1 мл суспензии Salmonella скважин А1 - А5, чтобы достичь множественность заражения (МВД) 10 бактерий на клетку.
   2. Центрифуга пластины в течение 15 мин при 300 х г при 37 ° С, чтобы синхронизировать инфекцию. Передача пластины в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
5. Убийство внеклеточный сальмонеллы с гентамицином.
   1. В 1 час после заражения, снимите пластину из инкубатора и добавить 0,1 мл макрофагов среде, содержащей 0,1 мг / мл гентамицинаубить внеклеточные бактерии. Добавить гентамицин для всех скважин, даже неинфицированных управления, чтобы убедиться, что все клетки обрабатывают таким же образом. Передача пластины в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
6. Промывания клеток.
   1. В 2 ч после инфекции, удалить пластину из инкубатора и промыть все лунки 2x 1 мл простого DMEM (предварительно нагревают до 37 ° С) и заменить его макрофагов среды (предварительно нагревают до 37 ° С), содержащую 10 мкг / мл   Гентамицин, чтобы предотвратить рост всех оставшихся внеклеточных бактерий. Передача пластины в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
7. Подготовка свежие буферы с моющими средствами и антител.
   1. Перед желаемой временной точке анализа, подготовить свежий исходный раствор дигитонина в дозе 1 мг / мл в буфере (KHM 110 мМ ацетата калия, 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl _2, рН 7,3). Фильтр акции и развести в кхм буфер для рабочего концентрации50 мкг / мл дигитонином. Кроме того, готовят раствор 0,1% сапонина в KHM буфера, анти-Salmonella антитела, соединенного с FITC (CSA-1-FITC) в 1/500, анти-калнексину на 1/100 или анти-PDI на 1/100 в КГМ буфере с добавлением 3% BSA.
8. Сотовый пермеабилизации.
   1. Удаление пластины из инкубатора и промывки 3x скважины с 0,5 мл буфера KHM (предварительно нагревают до 37 ° С). Удалить кхм буфер и добавить 0,25 мл равнине КГМ буфер скважин A4 и B1 / C1, KHM буфера дигитонином для скважин А1 - А3 и В2 / С2 или КГМ буфера с сапонина в лунки A5 и B3 / C3 (согласно таблице 1). Инкубировать ровно 1 мин при комнатной температуре и сразу же мыть все скважины 3x 0,5 мл KHM буфера (предварительно нагревают до 37 ° С).
9. Первичная окрашивание антитела.
   1. Извлеките Khm буфере и добавить первичного антитела решения (Козы против сальмонеллы -FITC, 250 мкл / лунку, 0,1 мкг / мл) в соответствующие лунки (фиг.1 , таблица 1). Инкубируют планшет в течение 15 мин в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
   2. Вымойте клетки 1x с 1 мл PBS.
10. Зараженные клетки (колодцы А1 - А5): анализ FACS
    1. Промывают клетки 3x с PBS и добавить 0,5 мл ледяной PBS, содержащим 0,1% Тритон. Трансфер в 5 мл FACS трубы с сотового фильтра крышкой, чтобы разбить клеточных агрегатов. Хранить образцы на льду.
    2. Проанализируйте образцы в FACS. Использование полностью проницаемыми управления, установите ворота для полных бактерий на основе вперед и боковой разброс (FSC / SSC) первого и сигнал mCherry (610 нм ± 20 нм фильтр).
    3. Далее, анализировать сигнал FITC в общей бактериальной популяции, используя в полной мере проницаемыми и не проницаемыми управления, чтобы установить ворота для бактерий цитозольными (FITC +, mCherry +) и вакуолярной бактерии (FITC-, mCherry +) (Рисунок 3).
    4. С установить ворота, анализировать образцы и определить процент цитозольном VS.вакуолярной бактерии, использующие программное обеспечение FlowJo в соответствии с протоколом производителя.
11. Неинфицированные управляет пермеабилизирующего (колодцы В1 - В3, С1 - С3): микроскопия
    1. Фиксация
       1. Удалить PBS и добавить 250 мкл 4% PFA в PBS. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
       2. Промыть лунки 2x 1 мл PBS и добавляют 250 мкл 0,1 М глицина в PBS в течение 10 мин, чтобы погасить фиксатором. Вымойте скважин 2x 1 мл PBS.
    2. Вторичный окрашивание антитела.
       1. Пятно управления проницаемости в течение 1 часа при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами, соединенными с флуорофоров в ЗФР ​​с 0,1% сапонина и 3% BSA в полной мере проницаемыми клеток.
       2. Промыть покровные 3 раза 1 мл PBS и смонтировать покровные для анализа в монтажной среды с DAPI (1,5 мкг / мл).
    3. Микроскопия анализ.
       1. Анализ покровные с управления на 40Х или 63x увеличением с помощью конфокальной флуоресцентныхценция микроскоп. Если пермеабилизации работал, там не должно быть окрашивание непермеабилизированных клеток, окрашивание калнексину для обеих digitonin- и сапонины-проницаемыми клетки и ДПИ окрашивания только для сапонинов-проницаемыми клеток (рисунок 4).

2. дигитониновым Проба с Немеченому Salmonella (микроскопия на основе анализа)

1. Подготовка бактерии для вывода / N культур.
   1. Посев немеченого Salmonella дикого типа SL1344 (Стрептомицин устойчива) за 1 день до инфекции в 3 мл LB среды с добавлением стрептомицина (90 мкг / мл) в шейкере при 37 ° CO / N.
   2. Покрытие клетки для инфекции.
      1. Семенной BMDMs в 24-луночный планшет, содержащий стерильные покровные стекла при плотности 1,25 × 10 ⁵ клеток / лунку в 1 мл макрофагального среде (DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS, де-дополняется, 56 ° C,30 мин), 1% Hepes, 1% L-несущественной аминокислоты (NEAA), 1% L-глутамина и 10% L929 супернатанта). Семенной скважины в соответствии с таблицей 1 для учета индивидуальных условий.
      2. Инкубируйте клетки O / N в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
   3. Подготовка бактерии инфекции.
      1. На следующий день, определения концентрации Salmonella в O / N культуры путем разбавления культуры 1:10 в PBS и измерения OD ₆₀₀ против единственного управления PBS. Это гарантирует, что OD ₆₀₀ измеряется в линейном диапазоне спектрофотометра.
      2. Определить концентрацию Salmonella на миллилитр. ОД ₆₀₀ из 1 соответствует 1 · 10 ⁹ бактерий.
      3. Развести бактерии в среде макрофагов, чтобы достичь концентрации Salmonella 1,25 × 10 ⁶ клеток / мл.
   4. Заражение клеток Salmonella.
   5. Удалить среду из лунок. Добавить 1 мл обычной макрофагов среды неинфицированных скважин управления (В1 - В3, С1 - С3). Добавить 1 мл суспензии Salmonella скважин А1 - А5, чтобы достичь множественность заражения (МВД) 10 бактерий на клетку.
   6. Центрифуга пластины в течение 15 мин при 300 х г при 37 ° С, чтобы синхронизировать инфекцию. Передача пластины в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
2. Убийство внеклеточный сальмонеллы с гентамицин.
   1. В 1 час после заражения, снимите пластину из инкубатора и добавить 0,1 мл макрофагов среде, содержащей 1 мг / мл гентамицина, чтобы убить бактерии внеклеточные все лунки. Передача пластины в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
3. Промывания клеток.
   1. В 2 ч после инфекции, удалить пластину из инкубатора и промыть каждую лунку 3x с 1 мл свежей макрофагов среде, содержащей 10 мкг / мл Гентамицин, чтобы предотвратитьРост оставшихся внеклеточного бактерий. Передача пластины в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
4. Подготовка свежие буферы с моющими средствами и антител.
   1. Перед желаемой временной точке анализа, подготовить свежий исходный раствор дигитонина в дозе 1 мг / мл в буфере (KHM 110 мМ ацетата калия, 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl _2, рН 7,3). Фильтр запас и разбавить в KHM буфере до рабочей концентрации 50 мкг / мл дигитонинового.
   2. Кроме того, готовят раствор 0,1% сапонина в KHM буфера, анти- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 мкг / мл), анти-калнексину на 1/100 или анти-PDI на 1/100 в KHM буфере с добавлением 3% БСА (см таблицу материалов для концентрации антител).
5. Сотовый пермеабилизации.
   1. Удаление пластины из инкубатора и промывки 3x скважины с 0,5 мл буфера KHM (предварительно нагревают до 37 ° С). Удалить кхм буфер и добавить 0,25 мл равнине КГМ буфераУэллс A4 и B1 / C1, KHM буфера с дигитонина Уэллс A1 - A3 и B2 / C2 или КГМ буфера с сапонина в колодцах A5 и B3 / C3 (согласно таблице 1). Инкубировать ровно 1 мин при комнатной температуре и сразу же мыть все скважины 3x 0,5 мл KHM буфера (предварительно нагревают до 37 ° С).
6. Первичная окрашивание антитела.
   1. Извлеките Khm буфере и добавить первичного антитела решения (Козы против сальмонеллы CSA1-FITC, 250 мкл / лунку, 0,1 мкг / мл) в соответствующие лунки (рисунок 2, таблица 1). Инкубируют планшет в течение 15 мин в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2. Вымойте 3x с 1 мл PBS.
7. Фиксация.
   1. Удалить PBS и добавить 250 мкл 4% PFA в PBS. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
   2. Промыть лунки 2x 1 мл PBS и добавляют 250 мкл 0,1 М глицина в PBS в течение 10 мин, чтобы погасить фиксатором. Вымойте скважин 2x 1 мл PBS.
8. ОбщееСальмонелла окрашивание зараженных образцов.
   1. Промыть покровные 3 раза PBS с 0,1% сапонина / 3% BSA и инкубируют образцы с анти-антителом CSA1 (козье антитело против CSA1, 0,1 мкг / мл, мышиное анти-ЛПС работает так же, 0,1 мкг / мл) в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS с 0,1% сапонина / 3% BSA.
   2. Промыть 3 раза в PBS с 0,1% сапонина / 3% BSA. Инкубируйте свои образцы со средним анти-козьего антитела, связанного с флуорофором выбора в PBS с 0,1% сапонина / 3% BSA в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
   3. Промыть покровные 3 раза 1 мл PBS и смонтировать покровные для анализа в монтажной среды с DAPI (1,5 мкг / мл).
9. Микроскопия анализ.
   1. Приобретать данных с конфокальной микроскопии путем подсчета цитозольную сальмонеллы Salmonella (анти- -FITC положительный) и общее сальмонеллы (двойной положительный) (рисунок 5). Управления пермеабилизирующего не должны показать: нет окрашивания для непермеабилизированных клеток, калнексину сексодержащие по дигитониновых-проницаемыми клетки и PDI окрашивания для сапониновых-проницаемыми клеток (рисунок 4). Уэллс A4 и A5 будет служить внутреннего контроля для окрашивания Salmonella.

Результаты

На рисунке 1 и 2 приведены схемы дигитонинового анализа, описанные в протокол 1 и протокол 2, иллюстрирующий важные шаги в протоколе и полученные результаты. Рисунок 3 показывает типичные FACS результаты. Положительные и отрицательные элементы управления используются для ?...

Обсуждение

Дифференциальный пермеабилизации это легко и надежный метод для анализа и количественной оценки субклеточную распределение бактериальных патогенов между вакуолярных отсеков и цитозоле. Анализ же успешно используется такими бактериями, как Francisella novicida ^2,4 и шигеллы Флекс...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	Sigma	D5628	50 μg/ml
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100 μg/ml and 10 μg/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63X
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm