Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Resumo

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Resumo

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares podem replicar no citosol ou no vacúolo contendo agentes patogénicos especializados (PCVs). Para atingir o citossol, bactérias como Shigella flexneri e Francisella novicida precisa para induzir a ruptura do fagossoma. Em contraste, Salmonella typhimurium replica num compartimento vacuolar, conhecido como Salmonella vacúolo molecular contendo (SCV). Todavia, certos mutantes de Salmonella não conseguem manter a integridade do VCE e são, assim, libertado para o citosol. A percentagem de bactérias citosólica vs vacuolares sobre o nível de bactérias individuais podem ser medidos por permeabilização diferencial, também conhecido como ensaio de protecção fagossoma. A abordagem faz uso da propriedade de detergente digitonina para se ligar seletivamente o colesterol. Uma vez que a membrana de plasma contém mais colesterol do que outras membranas celulares, digitonina pode ser usado selectivamente para permeabilizar a membrana plasmática, enquanto deixando as membranas intracelularesintacta. Em resumo a seguir à infecção, com o agente patogénico expressando uma proteína marcador fluorescente (por exemplo mCherry entre outros), a membrana plasmática de células hospedeiras é permeabilizadas com uma curta incubação em tampão contendo digitonina. As células são então lavadas e incubadas com um anticorpo primário (acoplado a um fluoróforo de escolha) dirigido contra a bactéria de escolha (por exemplo, anti- -FITC de Salmonella) e lavou-se novamente. Se forem utilizadas as bactérias não marcados, um passo adicional pode ser feito, em que todas as membranas são permeabilizadas e todas as bactérias coradas com um anticorpo correspondente. Após a coloração, a percentagem de vacuolares e citosólicos bactérias podem ser quantificados por microscopia de FACS ou por contagem de eventos simples ou duplos positivos. Aqui nós fornecemos detalhes experimentais para a utilização desta técnica com a bactéria Salmonella typhimurium. A vantagem deste teste é que, em contraste com o outro ensaio, que fornece uma quantificação do nível de único bactericidaRia, e se analisou por microscopia fornece o número exacto de citosólica e bactérias vacuolares numa dada célula.

Introdução

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares replicar quer directamente no citosol da célula hospedeira, ou em compartimentos vacuolares especializados ^1. Durante a fase inicial da infecção a maioria dos patógenos são internalizadas por fagocitose ou por células especializadas (tais como macrófagos) ou por promover activamente a sua própria absorção em células não fagocíticas. Em células fagocíticas, o fagossoma funde normalmente com lisossomas para formar um compartimento de degradação, em que as partículas são digeridas fagocitados. Bactérias citosólicas especializados, tais como Francisella novicida ou Shigella flexneri, escapar degradação phagosomal por induzir a ruptura do fagossoma e subsequentemente escapar para o citosol ^2,3. Isso requer associada a virulência mecanismo como a ilha de patogenicidade Francisella (FPI) ou a Shigella flexneri T3SS, que injeta proteínas efetoras que promovem a ruptura vacuolar ^2-4. As características citosol da célula hospedeiraum número de receptores de reconhecimento de padrões conservados que normalmente reconhecem a presença de patógenos e induzem imune inata sinalização ^5. Além disso, xenophagy, uma forma anti-microbiana de autofagia pode degradar bactérias que entram no citosol. Citossólicos bactérias são normalmente bem adaptado para diminuir ou burlar estas respostas usando estratégias diferentes. Por exemplo, Francisella modifica suas LPS para evitar o reconhecimento de acolhimento e Shigella impede recrutamento autofagia utilizando proteínas efetoras secretadas ^6,7.

Outra estratégia para escapar degradação lisossomal é empregado pelo modelo vacuolar patógeno Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, a seguir referido como Salmonella typhimurium. Salmonella usa um T3SS para injetar effectors que remodelar o phagosome inicial em seu nicho intracelular, a Salmonella -contendo vacúolo (SCV) ^8,9. Manipulação contínua de vias de acolhimento énecessária para manter este vacúolo recrutando lípidos e outros nutrientes para o vacúolo. De facto, um mutante de Salmonella sifa falha para manter a estabilidade vacuolar, e entra no citosol das células hospedeiras em questão de horas após a infecção, o que resulta na activação de vias imunes inatas e recrutamento autofagia ^8. Fuga vacuolar de Salmonella varia dependendo do tipo de célula que é estudos, e vários relatórios demonstraram que em células epiteliais mesmo WT Salmonella pode escapar do VCE e hyperreplicate no citosol ^10. Relatórios recentes mostram que a detecção de agentes patogénicos imune inata vacuolares também depende da capacidade do hospedeiro em reconhecer e desestabilizar vacúolos contendo agentes patogénicos PCVs ^(11-14).

Dado que tanto o hospedeiro ou bactérias genótipo pode afectar a distribuição de bactérias intracelulares entre o vacuolar e compartimento citosólico, é necessário para quantificar o número de vacuolar vs.bactérias citosólicas. Uma vez que, em configurações experimentais mais células hospedeiras são infectados com mais do que uma bactéria e, subsequentemente, pode abrigar várias bactérias em diferentes compartimentos subcelulares, uma técnica é necessário que permite a quantificação do nível de bactérias individuais. Permeabilização diferencial (também conhecido como teste de protecção phagosomal) fornece essa resolução ^2,4,10,12. O ensaio é baseado na permeabilização selectiva da membrana plasmática da célula hospedeira com o detergente digitonina, o qual deixa intacta membranas vacuolares e, assim, permite que a coloração selectiva de bactérias citosólicas com anticorpos. Aqui nós fornecemos dois protocolos para a quantificação de cytosolic e vacuolar Salmonella typhimurium usando diferencial permeabilização. O princípio deste método é descrita na Figura 1: macrófagos da medula óssea derivadas (BMDMs) são infectadas com fase estacionária mCherry-expressando Salmonella. Fase estacionária Salmonella precisa tO ser utilizados porque regular negativamente a expressão do SPI-1 T3SS, cuja actividade de outro modo seriam reconhecidos pelo inflammasome NLRC4 e induzir a morte celular rápida (pyroptosis) do BMDMs ^15. Após a infecção as células são lavadas e tratadas com 50 ug / ml de digitonina para 1 minuto. As células são lavadas mais uma vez e imediatamente incubadas com anticorpos anti- Salmonella acoplado a FITC para marcar as bactérias com o acesso ao citosol. Após um passo de lavagem adicional células são lisadas e a percentagem das bactérias mCherry + (vacuolar) e FITC + / + mCherry (citosólica) é determinada por FACS. Nós também relatam uma adaptação deste método que pode ser utilizado se não há estirpes que expressam proteínas fluorescentes estão disponíveis (Figura 2). Os passos adicionais são introduzidas após a marcação com FITC, em que as células são fixadas e permeabilizadas completamente. Posteriormente, todas as bactérias são coradas com anticorpos anti-Salmonella e anticorpos secundários correspondentes. Detec ç ã o é em seguida feito por microscopia, em vez de análise de FACS.

Protocolo

1. Digitonin Ensaio com mCherry expressando Salmonella (Análise baseada em FACS)

1. Preparando bactérias
   Nota: Salmonella de tipo selvagem SL1344 (resistente à estreptomicina) expressando mCherry partir de um plasmídeo (pFPV mCherry que codifica sob o promotor rpsM) é usado neste ensaio. Fagocitose bacteriana e proliferação onde não alterada pela expressão constitutiva de mCherry (dados não mostrados) ^16.
   1. Inocular a estirpe 1 dia antes da infecção em 3 ml de meio LB suplementado com estreptomicina (90 ug / ml) e ampicilina (100 ug / ml, mCherry vector de expressão) num agitador a 37 ° CO / N.
2. Chapeamento de células para a infecção.
   1. Semente de tipo selvagem BMDMs em uma placa de 24 poços a uma densidade de 1,25 x 10 ⁵ células / poço em 1 ml de meio de macrófagos primários (DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS, inactivado pelo calor, a 56 ° C, 30 min ), 1% de HEPES, 1% de aminoácidos não-essenciais (NEAA), 1% de L-glutamina e 10% L929 sobrenadante (meio condicionado a partir de macrófagos factor estimulador de colónias (M-CSF), produzindo células L929). Poços de sementes de acordo com a Tabela 1 para ter em conta as condições individuais. Adicionar lamelas aos poços utilizados como controlos (Tabela 1).
   2. Incubar as células durante a noite numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.

			Permeabilização		Coloração
	Lamela de vidro	Salmonella	Digitonin	Saponin	anti-Salmonella	anti-Calnexina	anti-PDI
A1 (amostra)	- / + *	+	+		+
A2 (amostra)	- / + *	+	+		+
A3 (amostra)	- / + *	+	+		+
A4 (sem controle de permeabilização)	- / + *	+			+
A5 (controle completo permeabilização)	- / + *	+		+	+
B1 (coradas para calnexina)	+					+
B2 (coradas para calnexina)	+		+			+
B3 (coradas para calnexina)	+			+		+
C1 (manchadopara PDI)	+						+
C2 (coradas para PDI)	+		+				+
C3 (coradas para PDI)	+			+			+

Tabela 1: Regime de chapeamento de medula óssea macrófagos derivados (BMDMs) num formato de 24 poços para a infecção subsequente com Salmonella, permeabilização e coloração * Dependendo se um protocolo ou protocolo 2 é feito..

3. Preparando as bactérias para a infecção.
   1. No dia seguinte, determinar a concentração de Salmonella em cultura durante a noite por diluição da cultura a 1:10 em PBS e medindo a OD ₆₀₀ de encontro a um único controlo PBS. Isto assegura que a OD ₆₀₀ é medida na lgama inear do espectrofotômetro.
   2. Calcular a concentração de salmonelas por ml. Uma OD600 de 1 corresponde a 1 x 10 ⁹ bactérias.
   3. Dilui-se as bactérias em forma de macrófagos para atingir uma concentração de Salmonella de 1,25 x 10 ⁶ células / ml.
4. A infecção de células com Salmonella.
   1. Remover o meio de BMDMs. Adicionar 1 ml de meio aos poços de macrófagos de controlo não infectados (B1-B3, C1-C3). Adicionar 1 ml de suspensão de Salmonella poços A1 - A5 a chegar a uma multiplicidade de infecção (moi) de 10 bactérias por célula.
   2. Centrifugar a placa durante 15 minutos a 300 xg a 37 ° C para sincronizar a infecção. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
5. Matar Salmonella extracelular com gentamicina.
   1. A 1 h pós-infecção, remova a placa da incubadora e adicionar 0,1 ml de meio de macrófagos contendo 0,1 mg / ml de gentamicinapara matar as bactérias extracelulares. Adicionar gentamicina a todas as cavidades, mesmo com os controlos não infectados, para assegurar que todas as células são tratadas da mesma maneira. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
6. Lavar as células.
   1. Às 2 h após a infecção, remover placa da incubadora e lavar os poços 2x com 1 ml de DMEM simples (pré-aquecido a 37 ° C) e substituí-lo por meio de macrófagos (pré-aquecido a 37 ° C) contendo 10 ug / ml   Gentamicina para prevenir o crescimento de todas as bactérias extracelulares restantes. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
7. Preparando padrões frescos com detergentes e anticorpos.
   1. Imediatamente antes do ponto de tempo de análise desejado, preparar uma solução de reserva fresca de digitonina a 1 mg / ml em tampão de KHM (acetato de potsio 110 mM, HEPES 20 mM, 2 mM de _MgCl2, pH 7,3). Filtrar o estoque e diluir em KHM tampão para uma concentração de trabalhode 50 ug / ml de digitonina. Além disso, preparar uma solução de saponina a 0,1% em tampão de KHM, anticorpo anti- Salmonella acoplado a FITC (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexina a 1/100 ou anti-PDI a 1/100 em KHM tampão suplementado com 3% de BSA.
8. Permeabilização celular.
   1. Retire a placa da incubadora e lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C). Remover KHM tampão e adicionar 0,25 ml planície KHM buffer para poços A4 e B1 / C1, KHM tampão com digitonina para poços A1 - A3 e B2 / C2 ou KHM tampão com saponina para poços A5 e B3 / C3 (de acordo com a Tabela 1). Incubar durante exactamente 1 min à temperatura ambiente e imediatamente lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C).
9. Coloração de anticorpo primário.
   1. Remover o tampão de KHM e adicionar as soluções de anticorpos primários (anticorpo de cabra anti -FITC Salmonella, 250 ul / poço, 0,1 ug / ml) aos poços apropriados (Figura 1 , Tabela 1). Incubar a placa durante 15 minutos num incubador a 37 ° C e 5% de CO _2.
   2. Lavam-se as células com 1 ml de 1x PBS.
10. As células infectadas (poços A1 - A5): análise FACS
    1. Lavar as células 3x com PBS e adicionar 0,5 ml de PBS gelado contendo 0,1% de Triton. Transferir para um tubo de 5 ml com tampão FACS coador de células para romper os agregados de células. Manter as amostras em gelo.
    2. Analisar as amostras de um FACS. Usando os controles totalmente permeabilizadas, defina a porta para as bactérias totais com base na dispersão frontal e lateral (FSC / SSC) em primeiro lugar, eo sinal mCherry (610 nm ± 20 nm filtro).
    3. Em seguida, analisar o sinal FITC na população bacteriana total usando os controles permeabilizadas totalmente permeabilizadas e não para definir as portas para as bactérias citossólicos (FITC +, mCherry +) e bactérias vacuolares (FITC, mCherry +) (Figura 3).
    4. Com os portões definido, analisar as amostras e determinar a percentagem de vs citosólicavacuolares bactérias que utilizam software FlowJo de acordo com o protocolo do fabricante.
11. Permeabilização controles não infectados (poços B1 - B3, C1 - C3): microscopia
    1. Fixação
       1. Remover PBS e adicionar 250 ul de PFA a 4% em PBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
       2. Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS e adicionar 250 ul de 0,1 M de glicina em PBS durante 10 minutos para extinguir o fixador. Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS.
    2. Coloração com anticorpo secundário.
       1. Controlos permeabilização da mancha por 1 hora à TA com anticorpos secundários acoplados com fluoróforos adequados em PBS suplementado com 0,1% de saponina e BSA a 3% para permeabilizar células completamente.
       2. Lavar 3x lamelas com 1 ml de PBS e montar as lamelas para análise no meio de montagem com DAPI (1,5 ug / mL).
    3. Análise de microscopia.
       1. Analisar as lamelas com os controles em um aumento de 40 vezes 63X ou usando um fluo confocalmicroscópio rescência. Se a permeabilização tem trabalhado, não deve haver nenhuma coloração para células não-permeabilizadas, coloração Calnexina para ambas as células digitonin- e Saponina-permeabilizadas e PDI coloração apenas para células permeabilizadas-saponina (Figura 4).

2. Digitonin Ensaio com Unlabeled Salmonella (Análise baseada em Microscopia)

1. Preparando bactérias para o / n culturas.
   1. Inocular não marcado Salmonella de tipo selvagem SL1344 (resistente à estreptomicina) 1 dia antes da infecção em 3 ml de meio LB suplementado com estreptomicina (90 ug / ml) num agitador a 37 ° CO / N.
   2. Chapeamento de células para a infecção.
      1. BMDMs semente em uma placa de 24 poços contendo lamelas de vidro esterilizadas a uma densidade de 1,25 x 10 ⁵ células / poço em 1 ml de meio de macrófagos (DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS, complementado-de, 56 ° C,30 min), 1% de HEPES, 1% de aminoácidos L-aminoácidos não-essenciais (NEAA), 1% de L-glutamina e 10% de sobrenadante L929). Poços de sementes de acordo com a Tabela 1 para ter em conta as condições individuais.
      2. Incubar as células S / N em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
   3. Preparando as bactérias para a infecção.
      1. No dia seguinte, determinar a concentração de Salmonella na cultura D / N por diluição da cultura a 1:10 em PBS e medindo a OD ₆₀₀ de encontro a um único controlo PBS. Isto assegura que a OD ₆₀₀ é medida na gama linear do espectros otómetro.
      2. Determinar a concentração de Salmonella por mililitro. Uma _OD600 de 1 corresponde a 1 x 10 ⁹ bactérias.
      3. Dilui-se as bactérias em forma de macrófagos para atingir uma concentração de Salmonella de 1,25 x 10 ⁶ células / ml.
   4. A infecção de células com Salmonella.
      1. Remover o meio de todos os poços. Adicionar 1 ml de meio de macrófagos claro para poços de controlo não infectados (B1 - B3, C1 - C3). Adicionar 1 ml de suspensão de Salmonella poços A1 - A5 a chegar a uma multiplicidade de infecção (moi) de 10 bactérias por célula.
      2. Centrifugar a placa durante 15 minutos a 300 xg a 37 ° C para sincronizar a infecção. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
   5. Matar Salmonella extracelular com gentamicina.
      1. A 1 h pós-infecção, remova a placa da incubadora e adicionar 0,1 ml de meio contendo macrófagos 1 mg / ml de gentamicina para matar bactérias extracelulares para todos os poços. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
   6. Lavar as células.
      1. Às 2 h pós-infecção, remova a placa da incubadora e cada poço lavar 3x com 1 ml de meio fresco contendo macrófagos 10 ng / mL Gentamicina para evitaro crescimento de todas as bactérias extracelulares restantes. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
   7. Preparando padrões frescos com detergentes e anticorpos.
      1. Imediatamente antes do ponto de tempo de análise desejado, preparar uma solução de reserva fresca de digitonina a 1 mg / ml em tampão de KHM (acetato de potsio 110 mM, HEPES 20 mM, 2 mM de _MgCl2, pH 7,3). Filtra-se o estoque e diluir em tampão de KHM para uma concentração de trabalho de 50 ug / ml de digitonina.
      2. Além disso, preparar uma solução de saponina a 0,1% em tampão de KHM, anti- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexina a 1/100 ou anti-PDI a 1/100 em tampão de KHM suplementado com BSA a 3% (ver tabela materiais para a concentração de anticorpo).
   8. Permeabilização celular.
      1. Retire a placa da incubadora e lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C). Remover KHM tampão e adicionar 0,25 ml planície KHM bufferpara poços A4 e B1 / C1, KHM tampão com digitonina para poços A1 - A3 e B2 / C2 ou KHM tampão com saponina para poços A5 e B3 / C3 (de acordo com a Tabela 1). Incubar durante exactamente 1 min à temperatura ambiente e imediatamente lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C).
   9. Coloração de anticorpo primário.
      1. Remover o tampão de KHM e adicionar as soluções de anticorpos primários (anticorpo de cabra anti-FITC Salmonella AST1, 250 ul / poço, 0,1 ug / ml) aos poços apropriados (Figura 2, Tabela 1). Incubar a placa durante 15 minutos num incubador a 37 ° C e 5% de CO _2. Lavar 3x com 1 ml de PBS.
   10. Fixação.
       1. Remover PBS e adicionar 250 ul de PFA a 4% em PBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
       2. Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS e adicionar 250 ul de 0,1 M de glicina em PBS durante 10 minutos para extinguir o fixador. Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS.
   11. TotalSalmonella coloração de amostras infectadas.
       1. Lavar lamelas 3x com PBS com 0,1% de saponina / BSA a 3% e incubar as amostras com um anticorpo anti-AST1 (de cabra anti-AST1, 0,1 ug / ml, de ratinho anti-LPS funciona bem, 0,1 ug / ml) durante 1 hora à TA em PBS com 0,1% de saponina / BSA a 3%.
       2. Lavar 3x em PBS com 0,1% de saponina / BSA a 3%. Incubar as amostras com um anticorpo secundário anti-cabra acoplado a escolha do fluoróforo em PBS com 0,1% de saponina / 3% de BSA durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
       3. Lavar 3x lamelas com 1 ml de PBS e montar as lamelas para análise no meio de montagem com DAPI (1,5 ug / mL).
   12. Análise de microscopia.
       1. Aquisição de dados com um microscópio confocal por contagem de Salmonella citosólica (anti- Salmonella -FITC positivo) e Salmonella total (duplo positivo) (Figura 5). Controles permeabilização deve mostrar: nenhuma coloração para células não permeabilizadas, Calnexina stenção para células permeabilizadas-digitonina e coloração PDI para células permeabilizadas-saponina (Figura 4). Wells A4 e A5 vai servir como controles internos para a coloração de Salmonella.

Resultados

Figura 1 e Figura 2 mostra o esquema do ensaio digitonina descritos no protocolo 1 e 2 protocolo ilustra as etapas críticas do protocolo e os resultados obtidos. A Figura 3 mostra os resultados típicos de FACS. Os controlos positivos e negativos são usados ​​para definir as portas para mCherry + / bactérias FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + bactérias (cytosolic Salmonella). Com base nestes portões a percentagem de bactérias citosólicas e vacuolare...

Discussão

Diferencial de permeabilização é um método fácil e robusto para analisar e quantificar a distribuição subcelular de agentes patogénicos bacterianos entre compartimentos vacuolares e o citosol. O mesmo ensaio foi usado com sucesso com bactérias tais como Francisella novicida ^2,4 e ¹² Shigella flexneri. No entanto, uma vez que muitos patógeno intracelular alterar ou modificar as estruturas de acolhimento de Endomembrane, a robustez da permeabilização digitonina terá de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	Sigma	D5628	50 μg/ml
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100 μg/ml and 10 μg/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63X
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm