Producción de Nurr-1 específico anticuerpos policlonales Libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, NOR1 y Nur77

Resumen

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Resumen

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Introducción

El factor de transcripción Nurr1 y sus homólogos (Nur77 y NOR1) pertenecen a la subfamilia de receptores nucleares 4A (NR4A) ^1. También son receptores huérfanos porque sus ligandos endógenos no son identificados todavía. Nurr1 se clonó por primera vez en 1992 y aunque sabe que se expresa en el cerebro ^2, su papel esencial para el desarrollo y mantenimiento de las neuronas de dopamina del cerebro medio fue revelado por estudios de ratones knockout ^3. Además, su importante papel para el mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo se demostró recientemente por un estudio knockout condicional ^4. Debido a estos estudios elegantes que muestran papeles críticos de Nurr1 para las neuronas de dopamina del cerebro medio, muchos estudios posteriores se han centrado en gran medida en el cerebro medio neuronas de dopamina y trastorno neurodegenerativo relacionada con la dopamina, enfermedad de Parkinson (PD) ^5.

Notablemente, Nurr1 se expresa no sólo en las neuronas de dopamina del cerebro medio (MDA), sino también en diáreas cerebrales versículo ^2, lo que sugiere que puede tener un papel funcional en muchas áreas no-DA, que está fuertemente apoyadas por estudios más recientes muestran que Nurr1 juega un papel importante en varias funciones cerebrales. Para ejemplos, se demostró que las actividades de inducción de memoria tales como el aprendizaje, u otras tareas dependiente del hipocampo da lugar a la regulación de la expresión de Nurr1 en el hipocampo ^6,7. Además, derribar de expresión Nurr1 en el hipocampo fue suficiente para afectar la memoria a largo plazo y / o la plasticidad sináptica ^8-11, lo que sugiere fuertemente que Nurr1 juega diversos papeles en muchas áreas del cerebro. Por lo tanto, para entender mejor la expresión de tipo celular específico y subcelular de Nurr1, es deseable usar anticuerpos-Nurr1 específico, que no presentan ninguna reactividad cruzada con sus homólogos Nur77 o NOR1. En este trabajo se describe un protocolo pre-adsorción para generar anticuerpos Nurr1 específica y presentar datos adicionales que muestran su especificidad.

Protocolo

Nota: La composición de todas las soluciones citadas a continuación se puede encontrar en la Tabla de Materiales / Equipo.

1. columna de proteína A Purificación de anticuerpos

1. Equilibrar una proteína de una columna de centrifugación y todos los tampones necesarios a temperatura ambiente durante 15 min antes de iniciar el procedimiento.
2. Diluir el suero inmune 1: 1 con Proteína A IgG Binding Buffer. (Se recomienda 5 ml de suero).
3. Golpee suavemente una columna de proteína vuelta en la mesa de trabajo para desalojar cualquier resina que puede ser alojada en la tapa. Retire la tapa superior y coloque suavemente el cierre inferior. Colocar la columna en un tubo de recogida de 15 ml y permita que la solución de almacenamiento para drenar.
4. Añadir 5 ml de Proteína A IgG Binding Buffer y permita que la solución drene.
5. Aplicar el suero inmune diluido a la columna y recoger el flujo a través. Para obtener los mejores resultados, añadir un volumen de muestra que contiene una concentración de anticuerpos de menos de 80% de la unión del anticuerpo-capacit de la columnay.
6. Lavar la columna con 15 ml de Proteína A IgG Binding Buffer o hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0,1.
7. Añadir 100 l de tampón de neutralización a cinco tubos de recogida etiquetados.
8. Añadir 5 ml de tampón de elución de IgG a la columna de Proteína A y recoger fracciones de 1 ml en cada uno de los tubos que contienen los 100 l de tampón de neutralización.
9. Medir la absorbancia de cada fracción a 280 nm y las fracciones de la piscina con una absorbancia mayor que 0.5. Mantenga las fracciones agrupadas en hielo hasta que esté listo para la diálisis.
10. Regenerar la columna mediante la adición de 8 ml de IgG tampón de elución y permita que la solución fluya a través de la columna.
11. Lavar la columna con una solución de proteína de unión Una IgG hasta que el pH eluyente vuelve a 7.4.
12. Almacenar la columna mediante la adición de 5 ml de solución de almacenamiento (azida de sodio 0,02% en PBS). Cuando aproximadamente 3 ml permanecen en la columna, la tapa inferior y asegurar la tapa superior. Guarde la columna a 4 ° C.
13. Determinar la longitud otubos de diálisis f necesario de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de tubos de 16 mm de diámetro plana usar 5,47 cm de longitud del tubo por ml de solución que se dializa. Corte el tubo y enjuagar con PBS pH 7,4 durante 15 a 30 min.
14. Doblar y el clip un extremo del tubo de diálisis, transferir la IgG reunidas que contienen fracciones a tubos de diálisis equilibrada en PBS pH 7,4 y cerrar el otro extremo.
15. Se dializa a temperatura ambiente contra 200 volúmenes de PBS pH 7,4 durante 2 h.
16. Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante otras 2 horas a temperatura ambiente.
17. Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante la noche a 4 ° C.
18. Mantener la solución de anticuerpo dializada a 4 ° C hasta que esté listo para proceder con etapas de purificación adicionales.
19. Evaluar la concentración de anticuerpo utilizando su absorbancia a 280 nm y el coeficiente de absorción molar de anticuerpos a 280 nm de 210.000 M ^-1 cm ^{-1 12.}

2. Acoplamiento de LBD proteínas para Aminolink Acoplamiento Resina

1. Prepare dos columnas, una para NOR1 y el otro para Nur77. Siga el mismo protocolo para ambas proteínas.
2. Descongelar la proteína que se acopla a la resina en hielo. Determinar la concentración de proteína usando su coeficiente de extinción molar y su absorbancia a 280 nm ^12.
   1. Alternativamente, utilizar un ensayo de determinación de proteínas tales como el ensayo de ¹³ ácido bicinconínico. Si la proteína se disuelve en un intercambio de Diálisis tampón que contiene amina o tampón contra el enganche de tope. Si la proteína es en un tampón adecuado (no hay aminas libres) diluirlo 4 veces en tampón de acoplamiento.
3. Utilice 2 ml de resina para 2 mg de proteína. Todos los pasos que siguen son para la resina de 2 ml en una columna de 10 ml. Hasta 10 mg de proteína puede ser vinculado por 1 ml de resina (2 ml de 1: 1 de suspensión).
4. Preparar una columna de 10 ml empujando una frita a la parte inferior y funcionando PBS pH 7,4 a través de él. Cap tél parte inferior de la columna y añadir 2 ml de Coupling Buffer.
5. Añadir el volumen deseado de suspensión (4 ml para obtener 2 ml de resina) a la columna, retire la tapa inferior y dejar que el drenaje de la columna. Lavar la columna con un total de 6 ml (volumen 3 de resina de lecho) de acoplamiento de búfer y permitir que la columna se drene. Después de que el tampón de acoplamiento ha drenado, coloque la tapa inferior.
6. Añadir 2-4 ml de proteína en suspensión en tampón de acoplamiento a la columna (mantener una alícuota de la solución de proteína para evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la comparación de la concentración de proteína del eluato en el paso 2.11 utilizando la absorbancia a 280 nm o el ensayo bicinconínico) . Tapar y mezclar de punta a punta para tener una solución homogénea.
7. Pesar un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml vacío y pasar a la campana de humos. Transferir cuidadosamente _NaCNBH3 (aproximadamente 0,05 g) en el tubo pesado previamente. Cerrar el tubo y pesar el tubo que contiene _NaCNBH3. No abra el tubo fuera del capó.
8. Basado en el peso de_NaCNBH3 transferido en el tubo, hacer una solución 5 M mediante la adición de 1 M NaOH. El peso molecular de _NaCNBH3 es 62,84 g, por lo tanto 0.05 g es igual a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 ^-4 moles) 7,96 x 10 ^-4 moles. Para hacer una solución add 5 M (7,96 x 10 ^-4/5) 159 l de 1 M NaOH.
9. Medir el volumen total de la reacción que tiene el volumen de resina en consideración. Añadir 10 l de 5 M _NaCNBH3 por ml de reacción.
   1. Por ejemplo: para un volumen de reacción 4 ml añadir 40 l de 5 M _NaCNBH3. Para 1 ml de resina y 3 ml de proteína añadida, el volumen total es de 4 ml.
10. Tape la columna y la mezcla de punta a punta. Asegure la columna en un rotador tubo y dejar que la reacción continúe durante la noche a 4 ° C.
11. Por la mañana, llevar la columna a la campana química y cuidadosamente quite la tapa como un poco de gas puede haberse formado. Escurrir la columna en un tubo limpio y guardar el eluido para medir la concentración de proteínacentración mediante la absorbancia a 280 nm Método ¹² o el ensayo de ácido bicinconínico y compararla con la concentración de proteína de partida en el paso 2.6.
12. Lavar la resina con 4 ml de acoplamiento Buffer y dejar que la fuga de la columna.

3. Sitios Bloqueo restante

1. Lavar la resina con 4 ml de tampón de enfriamiento. Escurra y coloque la tapa inferior. Añadir 2 ml de tampón de extinción y suspensión de la resina.
2. Evaluar el volumen total de reacción midiendo el volumen de resina y el volumen de tampón de temple a continuación, añadir 10 l de 5 M _NaCNBH3 por ml de volumen de reacción.
3. Mezclar suavemente a temperatura ambiente durante 30 min de extremo a extremo. Después de 30 min, traer la columna en la campana de humos. Retire con cuidado la tapa y retire la tapa inferior y dejar que la fuga de la columna en un tubo de residuos.
4. Lavar la columna con 5 volúmenes de resina de solución de lavado. Monitorear los lavados para la presencia de proteínas residuales mediante la medición de abso del eluatorbance a 280 nm. Proteínas desacopladas se lavan a cabo por la alta concentración de sal.
5. Lavar la resina con 6 ml de desgasificado PBS pH 7,4 que contiene azida de sodio al 0,02%. Mantenga la columna a 4 ° C hasta que se necesite.

4. Purificación de Nurr1 anticuerpos específicos

1. Enjuague la columna junto Nur77 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el Nur77 LBD columna junto drenado en un nuevo tubo de recogida de 15 ml.
2. Añadir 5 ml de proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados, limitar la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través. Ponga a un lado en el hielo hasta que esté listo para agregar a la columna junto NOR1 LBD.
3. Enjuague la columna junto NOR1 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el NOR1 LBD columna acoplada en un tubo de recogida de 15 ml.
4. Añadir el flujo a través del golpe Nur77 LBDcolumna encabezada, la tapa de la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través.
5. Medir la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm.

Análisis basado en ELISA 5. purificada de Anti-Nurr1 Anticuerpo

1. Añadir 100 l de proteína (2,5 g / ml) a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Si las pruebas 3 proteínas diferentes, añadir 100 l de proteína 1 de pozos A1 a H4, 100 l de la proteína 2, a pozos A5 a H8 y 100 l de proteína 3 a pozos A9 a H12. Cubrir la placa e incubar durante la noche a 4 ° C.
2. Lavar los pocillos recubiertos dos veces con 300 l por pocillo de PBS pH 7,4 y añadir 300 l de tampón de bloqueo ELISA a la totalidad de los pocillos recubiertos de antígeno y se incuba 2 horas a temperatura ambiente.
3. Mientras que la placa está bloqueando preparar una dilución de partida deseado de anticuerpo anti-Nurr1 purificado (que van de 10 a 100 g / ml) en tampón de bloqueo ELISA.
4. Después de 2 horas de bloqueo, reemplazar el tampón de bloqueo ELISA con 100 l de tampón bloque fresca ELISA a todos los pocillos.
5. Añadir 100 l de anticuerpo anti-Nurr1 purificada diluida a todos los pocillos de la fila A. En serie diluir los anticuerpos mediante la transferencia de 100 l de solución de la fila A de los pozos en la fila B seguido de la transferencia de 100 l de solución de la fila B a la fila C continuando hasta la fila G. Después de mezclar las soluciones en los pocillos de la fila G descartar los extra de 100 l. Wells en la fila H sólo reciben los iniciales 100 l de tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
6. Lavar la placa tres (3) veces con 300 l por pocillo de 0,05% de Tween 20 en PBS pH 7,4 y seque la placa para eliminar el exceso de tampón de lavado.
7. Añadir 100 l de peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de conejo diluido en tampón de bloqueo ELISA (1: 8000 dilución; la gama típica es de 1: 5.000 a 1: 25.000). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
8. Lavar las placas ªree (3) veces como se describe en 5.6. Enjuague todos los pocillos llenándolos con 300 l de agua desionizada. Seque el exceso de agua invirtiendo la placa sobre papel absorbente.
9. Añadir 100 l de 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbencidina (calentó a temperatura ambiente) a todos los pocillos e incubar 15 a 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
10. Detener la reacción mediante la adición de 50 l de 2 NH ₂ SO _4.
11. Leer la absorbancia a 450 nm restando fondo a 650 nm.

Resultados

Una comparación de columna de proteína A purificada anticuerpos Nurr1 específica con la proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados seguido por paso a través Nur77 LBD y NOR1 LBD columnas se muestra en la Figura 1. Como puede verse, la proteína A-anticuerpo purificado Nurr1 exhibió una fuerte unión a Nurr1 LBD. Sin embargo, también mostró unión significativa a Nur77 LBD y para NOR1 LBD. Cuando Proteína A-Nurr1 anticuerpos purificados se purificaron adicionalmente contra Nur77 LBD y NOR1 LB...

Discusión

El éxito de este protocolo se basa en la disponibilidad de proteínas puras para la caracterización de los anticuerpos generados contra un miembro específico de la familia de proteínas de interés. No hay necesidad de purificar los anticuerpos usando proteína A / G hasta que se establezca claramente que no son significativas reactividades cruzadas por ELISA y Western Blot.

Como se indica en el texto, es importante para evitar la suspensión de la proteína (s) a ser reticulado a la colu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl