Produção de Nurr-1 policlonal específico Anticorpos Livre de reactividade cruzada contra o seu próximo homólogos, NOR1 e Nur77

Resumo

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Resumo

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

Introdução

O factor de transcrição e os seus homólogos de Nurr1 (Nur77 e NOR1) pertencem à subfamília de receptores nucleares 4A (NR4A) ^1. Eles também são receptores órfãos porque seus ligantes endógenos ainda não foram identificados. Nurr1 foi primeiro clonado em 1992 e, embora conhecido por ser expresso no cérebro ^2, o seu papel essencial para o desenvolvimento e manutenção de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo foi revelado por estudos de ratinho knockout ^3. Além disso, o seu importante papel para a manutenção dos neurônios de dopamina do mesencéfalo foi recentemente demonstrado por um estudo nocaute condicional ^4. Devido a estes estudos elegantes mostrando papéis críticos do Nurr1 para os neurônios de dopamina do mesencéfalo, muitos estudos subsequentes em grande parte focado no neurônios de dopamina e de doenças neurodegenerativas relacionadas com a dopamina do mesencéfalo, doença de Parkinson (DP) ^5.

Notavelmente, Nurr1 se expressa não apenas nos neurônios de dopamina do mesencéfalo (MDA), mas também em diáreas cerebrais verso ^2, sugerindo que ele pode ter papéis funcionais em muitas áreas não-Da, que é fortemente apoiada por estudos mais recentes que mostram que Nurr1 desempenha papéis importantes em várias funções cerebrais. Por exemplo, demonstrou-se que as actividades de memória induzir tal como a aprendizagem, ou outras tarefas hipocampo-dependentes resultar em aumento da regulação da expressão no hipocampo Nurr1 ^6,7. Além disso, derrubar Nurr1 de expressão no hipocampo foi suficiente para prejudicar a memória a longo prazo e / ou a plasticidade sináptica ^8-11, sugerindo fortemente que Nurr1 desempenha diversos papéis em muitas áreas do cérebro. Assim, para melhor compreender a expressão específica do tipo celular e subcelular de Nurr1, é desejável a utilização de anticorpos específicos de Nurr1, que não apresentam qualquer reactividade cruzada com os seus homólogos Nur77 ou NOR1. Este documento descreve um protocolo de pré-adsorção para gerar anticorpos específicos de Nurr1 e apresentar dados adicionais mostrando a sua especificidade.

Protocolo

Nota: A composição de todas as soluções a seguir indicadas podem ser encontrados na Tabela Materiais / Equipamento.

1. Proteína A coluna de anticorpo Purificação

1. Equilibrar a coluna de proteína A rotação e todos os tampões necessários à temperatura ambiente durante 15 min antes de iniciar o procedimento.
2. Diluir o soro imune 1: 1 com a proteína A de IgG Binding Buffer. (5 ml de soro é recomendado).
3. Bata levemente uma coluna de proteína rodada na bancada para desalojar qualquer resina que pode ser apresentado na tampa. Remova a tampa superior e encaixe delicadamente fora do fecho da parte inferior. Inserir a coluna no tubo de recolha de 15 ml de solução de armazenamento e permitir o seu escoamento.
4. Adicionar 5 ml de Proteína A IgG tampão de ligação e permitir que a solução escorra.
5. Aplicar o soro imune diluído para a coluna e recolher o fluxo de passagem. Para melhores resultados, adicionar um volume de amostra que contém uma concentração de anticorpos menos de 80% da ligação do anticorpo-capacit da colunay.
6. Lava-se a coluna com 15 ml de Proteína A IgG Binding Buffer ou até a absorvância a 280 nm é inferior a 0,1.
7. Adicione 100 ml de Neutralização Buffer para cinco tubos de coleta marcadas.
8. Adicionar 5 ml de tampão de eluição de IgG ao da Proteína A coluna e recolher fracções de 1 ml em cada um dos tubos contendo 100 ul de tampão de neutralização.
9. Medir a absorção de cada fração de 280 fracções nm e piscina com uma absorvância superior a 0,5. Mantenha as fracções reunidas em gelo até estar pronto para diálise.
10. Regenerar a coluna por adição de 8 ml de tampão de eluição de IgG e permitir que a solução flui através da coluna.
11. Lavar a coluna com solução de ligação a IgG da Proteína A, até os retornos eluente de pH para 7,4.
12. Armazenar a coluna através da adição de 5 ml de solução de armazenamento (azida de sódio a 0,02% em PBS). Quando cerca de 3 ml permanecem na coluna, tampa inferior e prenda a tampa superior. Armazenar a coluna a 4 ° C.
13. Determinar o comprimento Of tubagem de diálise necessária de acordo com as instruções do fabricante. Usando tubagem plana 16 milímetros de diâmetro utilizar 5,47 centímetro de comprimento do tubo por ml de solução a ser dialisado. Cortar o tubo e enxaguar com PBS pH 7,4 durante 15 a 30 min.
14. Dobrar e cortar uma extremidade do tubo de diálise, a transferência de IgG reunida continha as fracções para tubo de diálise equilibrada em PBS pH 7,4 e fechar a outra extremidade.
15. Dialisar à temperatura ambiente contra 200 volumes de PBS, pH 7,4 durante 2 horas.
16. Mudar o tampão de diálise (PBS fresco pH 7,4) e dializar durante mais 2 horas à temperatura ambiente.
17. Mudar o tampão de diálise (PBS fresco pH 7,4) e diálise durante a noite a 4 ° C.
18. Manter a solução de anticorpo dialisado a 4 ° C até estar pronto para prosseguir com outros passos de purificação.
19. Avaliar a concentração de anticorpo utilizando a sua absorvância a 280 nm, e o coeficiente de absorção molar de anticorpos a 280 nm de 210,000 ^{M-1 cm-1 12.}

2. Acoplamento de proteínas LBD para Aminolink Resina Acoplamento

1. Prepare duas colunas, uma para a outra e NOR1 para Nur77. Seguir o mesmo protocolo para ambas as proteínas.
2. Descongelar a proteína a ser acoplada à resina em gelo. Determinar a concentração de proteína utilizando o seu coeficiente de extinção molar e a sua absorvância a 280 nm ^{de 12.}
   1. Em alternativa, usar um ensaio de determinação de proteínas, tais como o ensaio de ácido bicinconínico ^13. Se a proteína é dissolvida num tampão de diálise de troca contendo amina ou tampão contra a atrelagem. Se a proteína é de um tampão adequado (não há aminas livres) dilua 4 vezes em tampão de acoplamento.
3. Utilizar 2 ml de resina por 2 mg de proteína. Todos os passos que se seguem são para a resina de 2 ml numa coluna de 10 ml. Até 10 mg de proteína pode ser ligado por 1 ml de resina (2 ml de 1: 1) pasta.
4. Prepara-se uma coluna de 10 ml por meio de uma frita de empurrar para o fundo e rodando PBS pH 7,4 através dele. Cap tele parte inferior da coluna e adicionar 2 ml de tampão de acoplamento.
5. Adicionar o volume pretendido de suspensão (4 ml para se obter 2 ml de resina) para a coluna, remover a tampa de fundo e deixar a coluna de drenagem. Lavar a coluna com um total de 6 ml (volume de leito de resina 3) de atrelagem e permite que a coluna para drenar. Depois que o tampão de acoplamento tenha escorrido, recoloque a tampa inferior.
6. Adicionar 2-4 ml de proteína suspensa em tampão de acoplamento para a coluna (manter-se uma alíquota da solução de proteína para avaliar a eficiência de acoplamento por comparação da concentração de proteína do eluato na etapa 2.11 usando a absorvância a 280 nm ou o ensaio de ácido bicinconínico) . Tampa e misture sobre a extremidade final para ter uma solução homogénea.
7. Pesar um tubo de microcentrífuga de 1,8 ml vazio e passar para a capela. Transferir cuidadosamente _NaCNBH3 (cerca de 0,05 g) no tubo pré-pesado. Fechar o tubo e pesar o tubo contendo _NaCNBH3. Não abra o tubo fora do capô.
8. Com base no peso de_NaCNBH3 transferida para o tubo, fazer uma solução 5 M por adição de NaOH 1 M. O peso molecular de _NaCNBH3, por conseguinte, é 62,84 g 0,05 g é igual a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 ^-4 mol) 7,96 x 10 ^-4 mol. Para fazer uma solução 5 M de suplemento (7,96 x 10 ^-4 / 5) 159 ul de NaOH 1 M.
9. Medir o volume total da reacção de tomar o volume de resina em consideração. Adicionar 10 ul de 5 M _NaCNBH3 por ml de reacção.
   1. Por exemplo: para um volume de reacção 4 ml de adicionar 40 ul de 5 M _{de NaCNBH3.} Para 1 mL de resina e 3 ml de proteína adicionado, o volume total é de 4 ml.
10. Tampe a coluna e misturar sobre a extremidade final. Fixar a coluna num rotor tubo e deixar a reacção prosseguir durante a noite a 4 ° C.
11. Na parte da manhã, trazer a coluna para a capa química e retire cuidadosamente a tampa como um pouco de gás pode ter se formado. Drenar a coluna para um tubo limpo e guardar o eluato para medir a proteína concentração usando a absorvância a 280 nm, método ¹² ou o ensaio de ácido bicinconínico e compará-la com a concentração de proteínas a partir de passo 2.6.
12. Lavou-se a resina com 4 ml de tampão de acoplamento e deixar a coluna de drenagem.

3. Bloqueio restante Sites

1. Lavou-se a resina com 4 ml de tampão de têmpera. Escorra e coloque a tampa inferior. Adicionar 2 ml de tampão de têmpera e suspender a resina.
2. Avaliar o volume total da reacção por medição do volume de resina e do volume de tampão de têmpera, em seguida, adicionar 10 ul de 5 M de _NaCNBH3 por ml de volume de reacção.
3. Misturar suavemente à temperatura ambiente durante 30 min-extremidade sobre extremidade. Depois de 30 minutos, trazer a coluna no exaustor de fumos. Remova cuidadosamente a parte superior e, em seguida, retire a tampa do fundo e deixar o dreno coluna em um tubo de resíduos.
4. Lavar a coluna com 5 volumes de resina de solução de lavagem. Monitorizar as lavagens para a presença de proteínas residuais medindo abso do eluatorbance a 280 nm. Proteínas desacoplados são lavados para fora pela concentração elevada de sal.
5. Lavou-se a resina com 6 ml de PBS desgaseificado pH 7,4 contendo azida de sódio a 0,02%. Manter a coluna a 4 ° C até ser necessário.

4. Purificação de anticorpos específicos Nurr1

1. Lavar a coluna acoplada Nur77 LBD com 10 ml de PBS pH 7,4 e deixa a coluna de drenagem. Tapar o fundo da coluna e colocar a coluna acoplada Nur77 LBD drenada em 15 ml de um novo tubo de recolha.
2. Adicionam-se 5 ml de proteína A anticorpos anti-Nurr1 purificados, tampão da coluna e lugar num agitador rotativo a 4 ° C durante 1 h. Remova as tampas superior e inferior e recolher o fluxo através. Separe em gelo até estar pronto para adicionar à coluna acoplada NOR1 LBD.
3. Lavar a coluna acoplada NOR1 LBD com 10 ml de PBS pH 7,4 e deixa a coluna de drenagem. Tapar o fundo da coluna e colocar o NOR1 LBD coluna acoplada em um tubo de recolha de 15 ml.
4. Adicionar o fluxo através do golpe Nur77 LBDlevou coluna, tampão da coluna e lugar num agitador rotativo a 4 ° C durante 1 hora. Remova as tampas superior e inferior e recolher o fluxo através.
5. Medir a concentração de anticorpos através da medição da absorvância a 280 nm.

Análise baseada em ELISA de 5. purificada Anticorpo Anti-Nurr1

1. Adicionar 100 ul de proteína (2,5 ug / ml) aos poços de uma placa de 96 poços. Se testar três diferentes proteínas, adicione 100 ml de proteína de 1 a poços A1 a H4, 100 l de proteína 2, a Wells A5 para H8 e 100 l de proteína 3 a poços A9 para H12. Cobrir a placa e incubar durante a noite a 4 ° C.
2. Lavar os poços revestidos duas vezes com 300 ul por poço de PBS, pH 7,4 e adicionar 300 ul de tampão de bloqueio de ELISA para os antigénios inteiros poços revestidos e incubar 2 horas à temperatura ambiente.
3. Enquanto o prato está a bloquear preparar uma diluição de partida desejado purificado do anticorpo anti-Nurr1 (variando de 10 a 100 ug / ml) em tampão de bloqueamento de ELISA.
4. Após 2 horas de bloqueio, substitua o buffer do bloco de ELISA com 100 ul de tampão de bloqueio fresco ELISA para todos os poços.
5. Adiciona-se 100 ul de anticorpo purificado anti-Nurr1 diluída a todos os poços em linha em série A. diluir os anticorpos por transferência de 100 ul de solução da linha A para a linha B em poços seguidos por transferência de 100 ul de solução de linha B para a linha C continuando até a linha G. Depois de misturar as soluções em poços na fileira G descartar as extra de 100 mL. Wells em linha H só recebem os primeiros 100 ml de tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
6. Lava-se a placa três (3) vezes com 300 ul por cavidade de 0,05% de Tween 20 em PBS pH 7,4 e seque a placa para remover o excesso de tampão de lavagem.
7. Adicionar 100 ul de peroxidase de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de coelho diluído em tampão de bloqueio de ELISA (1: 8000 de diluição, a gama típica é de 1: 5000 a 1: 25.000). Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
8. Lavar as th placaree (3) vezes, como descrito em 5.6. Lave todos os poços, preenchendo-os com 300 mL de água deionizada. Remova o excesso de água invertendo a placa sobre papel absorvente.
9. Adicionar 100 ul de 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbenzidina (aquecida até à temperatura ambiente) a todos os poços e incubar 15 a 30 min no escuro à temperatura ambiente.
10. Parar a reacção por adição de 50 ul de 2 NH ₂ SO _4.
11. Ler a absorvância a 450 nm subtraindo fundo a 650 nm.

Resultados

Uma comparação da coluna de proteína A purificada anticorpos específicos para a proteína A Nurr1 com anticorpos anti-Nurr1 purificados seguido por passagem através de colunas Nur77 LBD e NOR1 LBD é mostrado na Figura 1. Tal como pode ser visto, Proteína-A purificada Nurr1 anticorpo exibiram uma forte ligação para Nurr1 LBD. No entanto, também mostraram ligação significativa a Nur77 LBD e NOR1 LBD. Quando os anticorpos Nurr1-A proteína purificada foram ainda purificados contra Nur77 LBD e N...

Discussão

O sucesso deste protocolo baseia-se na disponibilidade de proteínas puras para a caracterização dos anticorpos criados contra um membro específico da família de proteínas de interesse. Não há necessidade de purificar os anticorpos utilizando proteína A / G até que seja claramente estabelecido que existem significativas reacções cruzadas por ELISA e Western blot.

Conforme indicado no texto, é importante para evitar a suspensão de proteína (s) a ser reticulado à coluna num tamp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl