NURR-1特異的ポリクローナル抗体の密接な相同体に対する交差反応性の自由、Nor1のとNur77の生産

要約

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

要約

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson’s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

概要

転写因子のNurr1およびその同族体（Nur77およびNor1のは）核内受容体サブファミリー^{4A（NR4A）1}に属します。それらの内因性リガンドはまだ同定されていないので、彼らはまた、オーファン受容体です。 Nurr1を最初は1992年にクローン化され^、2脳内で発現することが知られているが、中脳ドーパミンニューロンの発達および維持のための重要な役割は、ノックアウトマウスの研究により明らかになった^3。また、中脳ドーパミンニューロンの維持のための重要な役割は、最近、条件付きノックアウト研究⁴によって実証されました。による中脳ドーパミンニューロンのためのNurr1の重要な役割を示すこれらのエレガントな研究に、多くのその後の研究は、主に中脳ドーパミンニューロンおよびドーパミン関連の神経変性疾患、パーキンソン病（PD）に焦点を当ててきた^5。

注目すべきは、Nurr1をは中脳ドーパミン（MDA）ニューロンにおいてだけでなく、ディだけでなく表現されていますそれは強くNurr1を、様々な脳機能に重要な役割を果たしていることを示す最近の研究によって支持されている多くの非DAの分野で機能的な役割を有し得ることを示唆している詩の脳領域^2、。例については、このような学習として、メモリ誘導活性を示された、またはその他の海馬依存タスクがアップレギュレーション海馬^6,7中のNurr1の発現をもたらします。また、海馬でのNurr1発現のノックダウンが強くのNurr1は、多くの脳領域で多様な役割を果たしていることを示唆し、長期記憶および/ ​​またはシナプス可塑性^8-11を損なうのに十分でした。したがって、さらにNurr1をの細胞型特異的および細胞内発現を理解するためには、そのホモログNur77またはNor1のに任意の交差反応性を示さないのNurr1特異的抗体を使用することが望ましいです。本稿では、Nurr1を特異的抗体を生成し、その特異性を示す追加データを提示するために事前に吸着プロトコルについて説明します。

プロトコル

注：以下の引用された全ての溶液の組成は、材料/機器の表に記載されています。

1.プロテインAカラム抗体精製

1. 手順を開始する前に15分間室温にプロテインAスピンカラムと、必要なすべてのバッファーを平衡化します。
2. 結合緩衝液プロテインAのIgGと1：免疫血清1を希釈します。 （血清5mlをお勧めします）。
3. 静かにキャップ内に提出することができる任意の樹脂を除去するために、ベンチトップ上のタンパク質スピンカラムをタップします。トップキャップを外し、ゆっくりと底部の閉鎖をスナップオフ。 15ミリリットルのコレクションチューブにカラムを置き、ストレージソリューションを排出することができます。
4. 結合緩衝液プロテインAのIgGの5ミリリットルを加え、溶液を排出させます。
5. カラムに希釈した免疫血清を適用し、フロースルーを収集します。最良の結果を得るために、カラムの抗体結合capacitの80％未満の抗体の濃度が含まれているサンプル容量を追加Y。
6. 280 nmでの吸光度が0.1以下になるまで、プロテインAのIgG 15mlの結合緩衝液またはでカラムを洗浄します。
7. 5標識されたコレクションチューブに中和緩衝液100μlを追加します。
8. プロテインAカラムへのIgG溶出緩衝液5mlを加え、中和緩衝液100μlを含むチューブのそれぞれに1mlの画分を収集します。
9. 0.5より大きい吸光度280 nmおよびプールの画分で各画分の吸光度を測定します。透析の準備ができるまで氷上でプールした画分を保管してください。
10. IgGを溶出緩衝液8mlのを追加することで、列を再生成し、溶液がカラムを通って流れることを可能にします。
11. 溶離液のpHは7.4に戻るまで、プロテインAのIgG結合液でカラムを洗浄します。
12. 貯蔵溶液5ml（PBS中0.02％アジ化ナトリウム）を添加することにより、カラムを保存。約3mlの列、キャップ底部に残り、トップキャップを固定した場合。 4℃で列を保管してください。
13. 長さOを決定製造業者の指示に従って必要なF透析チューブ。 16ミリメートルに平らな直径のチューブを使用すると、透析される溶液1ml当たり、チューブの長さの5.47センチメートルを使用しています。チューブをカットし、15〜30分間のPBS（pH7.4）ですすいでください。
14. 倍と透析チューブの一端をクリップ、PBSのpHは7.4で平衡化した透析チューブに含有画分をプールしたIgGを転送し、もう一方の端を閉じます。
15. 2時間pH7.4のPBSの200ボリュームに対して室温で透析します。
16. 透析緩衝液（新鮮なPBS pH7.4）に変更し、室温でさらに2時間透析。
17. 透析緩衝液（新鮮なPBS pH7.4）に変更し、4℃で一晩透析します。
18. さらなる精製工程を続行する準備ができるまで4℃で透析した抗体溶液を保管してください。
19. 280 nmでの吸光度を用いて抗体濃度と21万M ^-1 cm ^-1で¹²の280nmにおける抗体のモル吸光係数を評価します。

アミノリンクカップリング樹脂にLBDタンパク質の2カップリング

1. 2列、Nur77ためNor1のための1つおよび他を準備します。両方のタンパク質のための同じプロトコルに従ってください。
2. 氷上で樹脂に結合するタンパク質を解凍します。 280 nmの¹²で、そのモル吸光係数とその吸光度を用いてタンパク質濃度を決定します。
   1. あるいは、そのようなビシンコニン酸アッセイ¹³のようなタンパク質の決意アッセイを使用しています。タンパク質は、アミン含有緩衝透析またはカップリングバッファーに対してバッファー交換中に溶解されている場合。タンパク質は、適当な緩衝液（無遊離アミン）である場合のカップリング緩衝液で4倍に希釈します。
3. タンパク質2mgのための樹脂の2ミリリットルを使用してください。以降のすべての手順は、10ミリリットルの列に2ミリリットルの樹脂のためのものです。タンパク質の最大10 mgの（1：1スラリー1を2ml）樹脂を1mlあたり連結することができます。
4. 底部にフリットを押し、それを介してPBS pHが7.4を実行して、10ミリリットルのカラムを準備します。キャップT彼は塔の底部とのカップリング緩衝液2ミリリットルを追加します。
5. 、カラムへのスラリーの所望の体積（樹脂の2ミリリットルを得るために4ミリリットル）を追加底部キャップを除去し、カラムの流出をしてみましょう。カップリング緩衝液の6ミリリットル（3樹脂床容積）の合計でカラムを洗浄し、カラムを排水することができます。カップリング緩衝液を排出した後、ボトムキャップを交換してください。
6. （280nmでの吸光度またはビシンコニンアッセイのいずれかを使用してステップ2.11で溶出液のタンパク質濃度を比較することにより、結合効率を評価するために、タンパク質溶液のアリコートを保持）カラムへの結合緩衝液に懸濁し、タンパク質2-4 mlを加え。キャップと均一な溶液を持つように転倒混和します。
7. 空の1.8ミリリットルマイクロチューブを秤量し、ドラフトに移動します。慎重に予め秤量したチューブ中のNaCNBH _3（約0.05g）を転送します。チューブを閉じ、のNaCNBH _3を含むチューブの重量を量ります。フードの外管を開けないでください。
8. の重量を基準にしてチューブに移しのNaCNBH _3は 、1 M NaOHを添加することによって5 M溶液を作成します。のNaCNBH ₃の分子量は、62.84グラム、従って0.05グラムは、（0.05 / 62.84 = 7.96×10 ^-4モル）を7.96×10 ^-4モルに等しいです。 5 M溶液を作製するには、（7.96×10 ^-4 / 5）1 M NaOHを159μlを添加します。
9. 考慮に樹脂容量を取る反応の総容量を測定します。反応の1ml当たり5 MのNaCNBH ₃の10μLを加えます。
   1. たとえば、次の4ミリリットルの反応ボリュームの5 MのNaCNBH ₃の40μlを添加します。樹脂1mlのコメントを追加しましたタンパク質の3ミリリットルのために、総容量を4 mlです。
10. カラムに蓋をし、転倒混和します。チューブ回転で列を固定し、反応物を4℃で一晩続けましょう。
11. 午前中は、化学フードに列を持参し、いくつかのガスが形成されている可能性がありますように慎重にキャップを取り外します。きれいなチューブにカラムを排水し、タンパク質コンを測定するために、溶出液を保存セント280nmの方法¹²またはビシンコニン酸アッセイでの吸光度を用いて、ステップ2.6で出発タンパク質濃度と比較します。
12. カップリング緩衝液4mlで樹脂を洗浄し、カラムの流出をしてみましょう。

3.残りのサイトをブロック

1. クエンチング緩衝液4mlで樹脂を洗浄。ドレインと底部キャップを交換してください。急冷2mlの緩衝液を添加し、樹脂を中断。
2. 樹脂容量と消光バッファ量を測定することにより、総反応容量は、その後、反応容量1mlあたり5 MのNaCNBH ₃の10μlを添加する評価します。
3. 30分転倒、室温で穏やかに混合します。 30分後、ドラフト内で列をもたらします。慎重にトップを削除してから、底部キャップを除去し、廃棄物の管に、カラムの流出をしてみましょう。
4. 洗浄溶液の5樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。溶出液のabsoを測定することにより、残留タンパク質の存在のための洗浄を監視280nmでrbance。非結合タンパク質を、高塩濃度によって洗い流されます。
5. 0.02％アジ化ナトリウムを含有する脱気したPBSのpHが7.4の6ミリリットルで樹脂を洗浄。必要になるまで4℃で列を保管してください。

Nurr1を特異的抗体の4精製

1. すすぎNur77 LBDは、pH7.4のPBS 10mlでカラムに結合し、カラムの流出をしてみましょう。カラムの底部に蓋をして、新しい15ミリリットルのコレクションチューブに排出さNur77 LBD結合列を配置します。
2. 、タンパク質5mlの精製抗のNurr1抗体を追加し、1時間4℃で回転体の列と場所をキャップ。上部と下部のキャップを外し、フロースルーを収集します。 Nor1のLBD結合列に追加する直前まで、氷上に置いておきます。
3. すすぎNor1のLBDは、pH7.4のPBS 10mlでカラムに結合し、カラムの流出をしてみましょう。カラムの底部に蓋をし、15 mlコレクションチューブNor1のLBD結合列を配置します。
4. Nur77 LBDのクーデターからの流れを介して追加4℃で1時間回転器でのカラムと場所をキャップ、列を主導しました。上部と下部のキャップを外し、フロースルーを収集します。
5. 280nmでの吸光度を測定することにより抗体濃度を測定します。

精製抗のNurr1抗体の5 ELISAに基づく分析

1. 96ウェルプレートのウェルにタンパク質を100μl（2.5μgの/ ml）を追加します。 3種類のタンパク質をテストする場合は、H4のウェルA1、H8にウェルA5へのタンパク質2を100μl、およびH12のウェルA9へのタンパク質3の100μlにタンパク質1の100μlを添加します。プレートをカバーし、4℃で一晩インキュベートします。
2. pH7.4のPBSのウェル当たり300μlの二回コーティングしたウェルを洗浄し、抗原全体コーティングされたウェルにELISAブロッキング緩衝液の300μlを添加し、室温で2時間インキュベートします。
3. プレートは、精製された抗のNurr1抗体の所望の出発希釈を準備ブロックしているときにELISAブロッキング緩衝液中（10〜100μg/ mlの範囲）。
4. ブロッキングの2時間後、全てのウェルに新鮮なELISAブロック緩衝液100μlを用いたELISAブロックバッファを交換します。
5. 行Aの全てのウェルに希釈した精製された抗のNurr1抗体の100μlを添加する逐次Cを行ごとにBから溶液100μlを転送することにより、続いてB列にA列からウェルに100μlの溶液を転送することにより、抗体を希釈余分な100μLを捨てる行Gのウェル中の溶液を混合した後G.行ダウン続けます。行Hのウェルは、緩衝液のみをブロックの最初の100μLを受けます。 1時間室温でインキュベートします。
6. pH7.4のPBSでプレートを0.05％のTween 20のウェル当たり300μlので3回洗浄し、過剰な洗浄緩衝液を除去するためにプレートをブロット。
7. ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ELISAブロック緩衝液で希釈したコンジュゲートヤギ抗ウサギIgGの100μlを加える（1：8,000希釈し、典型的な範囲は、1：25,000：5,000 1）。 1時間室温でインキュベートします。
8. プレート番目を洗いますREE（3）5.6倍に記載の方法。脱イオン水300μlのとそれらを充填することにより、全てのウェルを洗浄します。紙を吸収する上でプレートを反転させて余分な水分を吸い取ります。
9. '、5,5' 3,3の100μlを添加しテトラメチルベンジジン（室温に温め）を全てのウェルに、室温で暗所で15〜30分間インキュベートします。
10. SO _4を 2 NH ₂の50μLを加えて反応を停止します。
11. 650 nmでのバックグラウンドを差し引い450 nmの吸光度を読みます。

結果

Nur77 LBDとNor1のLBDのカラムに通すことによって、その後のタンパク質の比較タンパク質とカラム精製の​​Nurr1に特異的な抗体精製抗Nurr1を抗体は、図1に示されている。図から分かるように、プロテインA精製の​​Nurr1抗体は強い結合を示しましたNurr1をLBDに。しかし、それはまた、Nur77 LBDへとNor1のLBDへの有意な結合を示しました。プロテインA精製のNurr1抗体はさらにNur77 LBDおよ?...

ディスカッション

このプロトコルの成功は、目的のタンパク質ファミリーの特定のメンバーに対して産生された抗体の特徴付けのための純粋なタンパク質の利用可能性に依存しています。それは明らかにELISAおよびウェスタンブロッティングによる有意な交差反応性があることが確立されるまで、プロテインA / Gを使用して抗体を精製する必要はありません。

本文で述べたように、このよ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77			Column Storage solution
AminoLink Coupling Resin and Kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spin column	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normal Goat Serum	KPL	50-675-69
Milk Diluent/ Blocking Concentrate	KPL	50-82-01
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elution Buffer	Thermo Scientific	21004
Column Storage solution			Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide
Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing	Spectrum Labs	132128
10 ml Disposable columns	Thermo Scientific	29924
AminoLink Coupling Buffer			0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0
Quenching buffer			1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4
Wash Solution			1M NaCl, 0.05% NaN3
ELISA Blocking buffer			1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent
Storage Solution			PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide
Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl