Combinado de traslado-Box Entrenamiento con electrofisiológico corteza Grabación y estimulación como una herramienta para estudiar la percepción y aprendizaje

Resumen

Shuttle-cuadro aprendizaje de evitación está bien establecido en la neurociencia conductual. Este protocolo se describe cómo el aprendizaje en los roedores lanzadera cuadro se puede combinar con microestimulación sitio específico eléctrica cortical (ICMS) y crónica simultánea en grabaciones in vivo como una herramienta para estudiar varios aspectos del aprendizaje y la percepción.

Resumen

El aprendizaje de evitación de traslado de la caja es un método bien establecido en la neurociencia y experimentales configuraciones de comportamiento eran tradicionalmente hechos a medida; el equipo necesario está disponible por varias empresas comerciales. Este protocolo proporciona una descripción detallada de una evitación de lanzadera cuadro paradigma de aprendizaje de dos vías en roedores (jerbos mongoles aquí; Meriones unguiculatus) en combinación con microestimulación sitio específico eléctrica cortical (ICMS) y crónicas electrofisiológicos in vivo grabaciones simultáneas. El protocolo detallado es aplicable a estudiar varios aspectos de comportamiento de aprendizaje y la percepción en diferentes especies de roedores.

ICMS en sitios específicos de los circuitos corticales auditivas como estímulos condicionados aquí se utiliza como una herramienta para probar la relevancia perceptiva de aferentes específica, eferentes y las conexiones intracorticales. Los patrones de activación distintas pueden ser evocados mediante el uso de diferentes arr electrodo de estimulaciónays para, ICMS capa dependiente locales o sitios ICMS distantes. Utilizando el análisis del comportamiento de detección de señales se puede determinar qué estrategia de estimulación es más eficaz para la obtención de una señal detectable y comportamiento sobresaliente. Además, multicanal-grabaciones paralelas utilizando diferentes diseños de electrodos (electrodos de superficie, electrodos de profundidad, etc.) permiten investigar observables neuronales en el transcurso de tiempo de tales procesos de aprendizaje. Se discute cómo los cambios del diseño de comportamiento pueden aumentar la complejidad cognitiva (por ejemplo, la detección, la discriminación, el aprendizaje de inversión).

Introducción

Un objetivo fundamental de la neurociencia conductual es establecer vínculos específicos entre las propiedades neuronales estructurales y funcionales, el aprendizaje y la percepción. La actividad neuronal asociada con la percepción y el aprendizaje puede ser estudiado por registro electrofisiológico de potenciales de acción y potenciales de campo locales en varias estructuras cerebrales en múltiples sitios. Mientras que los registros electrofisiológicos proporcionan asociaciones correlativos entre la actividad neuronal y el comportamiento, microestimulación directa eléctrica cortical (ICMS) durante más de un siglo ha sido el método más directo para las relaciones causales de pruebas de las poblaciones excitados de las neuronas y sus efectos en el comportamiento y la percepción ^{1 - 3.} Muchos estudios han demostrado que los animales son capaces de hacer uso de diversas propiedades espaciales y temporales de los estímulos eléctricos en tareas de percepción en función de la zona de estimulación dentro de, por ejemplo, retinotopic ^4, tonotopic ^5, o somatotópica ^{6 regiones} de la corteza. Propagación de la actividad evocada eléctricamente en la corteza está determinada principalmente por la disposición de las fibras axonales y su conectividad sináptica distribuido ² que, en la corteza, es claramente dependiente de la capa ^7. La activación polisináptica resultante evocada por ICMS es a partir de ahora mucho más extendida que los efectos directos de la ^2,8,9 campo eléctrico. Esto explica por qué los umbrales de efectos perceptivos provocados por microestimulación intracortical pueden ser fuertemente capa dependiente de ^8,10,11 y el sitio dependiente ^9. Un estudio reciente demostró en detalle que la estimulación de capas superiores rindió más la activación de amplia propagación de circuitos corticocortical en capas principalmente supragranular, mientras que la estimulación de las capas más profundas de la corteza en un resultado, corticoefferent recurrente focal intracolumnar activación. Experimentos de comportamiento paralelo revelado que este último tiene mucho menor thr detección perceptualesholds ^8. Por lo tanto, la ventaja de ICMS estímulos específica de sitio como condicionado fue explotada en combinación con registros electrofisiológicos para relacionar causalmente activaciones específicas de circuitos corticales ⁸ a medidas de comportamiento de aprendizaje y la percepción en la caja de lanzadera.

El transbordador caja paradigma de dos vías es un aparato de laboratorio bien establecido para estudiar el aprendizaje de evitación ^12. Una caja de transporte consta de 2 compartimentos separados por una barrera o puerta. Un estímulo condicionado (CS) que está representado por una señal adecuada como una luz o sonido, se forma contingente seguido por un estímulo no condicionado aversivo (US), como por ejemplo un choque pie sobre un suelo de rejilla metálica. Los sujetos pueden aprender a evitar los EE.UU. por yendo y viniendo de un compartimento de transporte de la caja a la otra en respuesta a la CS. Aprendizaje de traslado-box implica una secuencia de fases de aprendizaje distinguibles ^13,14: En primer lugar,los sujetos aprenden a predecir los EE.UU. de la CS por el condicionamiento clásico y escapar de los EE.UU. por el condicionamiento instrumental, como se termina los EE.UU. sobre yendo y viniendo. En una siguiente fase, los sujetos aprenden a evitar los EE.UU. conjunto por yendo y viniendo en respuesta al CS ante nosotros aparición (reacción de evitación). En general, el aprendizaje de traslado caja implica condicionamiento clásico, condicionamiento instrumental, así como el comportamiento dirigido a un objetivo en función de fase de aprendizaje ^14.

El procedimiento de traslado de la caja se puede configurar fácilmente y generalmente produce un comportamiento robusto después de algunas sesiones de entrenamiento al día ^{15 - 17.} Además de sencilla condicionamiento de evitación (detección), la caja de transporte se puede utilizar más para estudiar la discriminación de estímulos mediante el empleo de paradigmas Pasa / No Pasa. Aquí, los animales están entrenados para evitar los EE.UU. por una respuesta condicionada (RC) (vaya comportamiento; servicio de transporte en el compartimiento opuesto) en respuesta a una go-estímulo (CS +) y por el comportamiento de Nogo (alojarse en el compartimiento de corriente; no CR) en respuesta a una Nogo-estímulo (CS-) microstimulation paralelo y registro de la actividad neural con matrices multielectrodo de alta densidad permitir a estudiar. los mecanismos fisiológicos subyacentes aprendizaje exitoso. Varios detalles técnicos que son fundamentales para las combinaciones exitosas de capacitación de transporte-caja, ICMS y electrofisiología en paralelo, se discutirán.

Protocolo

Todos los experimentos presentados en este trabajo se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos definidos por la ley alemana de protección de los animales de experimentación. Los experimentos fueron aprobados por el comité de ética del estado de Sajonia-Anhalt.

1. encargo multicanal electrodos matrices para Microestimulación y grabación

1. Array microestimulación por encargo
   1. Para la entrega de ICMS, preparar electrodos de estimulación en el diseño espacial deseada (en este array lateral de 2 canales) utilizando alambres de acero inoxidable con aislamiento de teflón largos de 3 cm (Ø con el aislamiento = 50 micras). Ver Figura 2.
   2. Crimp un extremo de los cables a un sistema de pin macho (1,25 mm de paso).
   3. Para una matriz de 2 canales con ~ 0,5 mm o ~ cables 0,7 mm de paso la distancia electrodo perpendicular a través de dos de microscopía electrónica rejillas objeto porta-alineados verticalmente (distancia de rejillas ~ 5 mm) que guían los cables (0,1654 mm de paso).
   4. Cables de pegamento, junto con una pequeña gota de acrílico dental alrededor de 4 mm por encima de las terminaciones de los cables que finalmente sirven como puntas de los electrodos.
   5. Ponga pines macho en la carcasa del enchufe.
   6. Coloque el electrodo en un plato con solución electrolítica (por ejemplo, 0,9% de cloruro de sodio) y medir la impedancia de cada canal con un dispositivo de medición de la impedancia respectiva (por ejemplo., FHC Impedancia acondicionado del módulo). Apunte a impedancias en el rango de 100 a 500 kW.
      1. Si la impedancia es demasiado alta, suministrar corriente cortocircuito eléctrico (1 seg, 1 mA) a través de los canales para bajarla. Compruebe la impedancia de nuevo.
2. De alta resolución matrices de grabación multicanal medida
   Nota: este protocolo describe la fabricación de matrices de superficie para grabar datos electrocorticograma (ECOG). Sin embargo, los diseños pueden ser adaptados para satisfacer los requisitos de la respectiva pregunta de investigación (grabaciones de profundidad, etc.). Matrices multicanal de alta resolución están built por cables de acero inoxidable con aislamiento de teflón (Ø con el aislamiento = 50 micras) engarzado a un sistema de pin macho (1,25 mm de paso).
   1. Para matrices de electrodos superficiales, guía 18 cables a través de una matriz de 3 x 6 de dos rejillas de microscopía electrónica objeto porta-preparados.
   2. Insertar la disposición 6 x 3 de los cables entre las rejillas con acrílico dental y poner alfileres en la caja de enchufe.
   3. Moler el acrílico dental en un bloque rectangular con amoladora unido a un taladro de mano.
   4. Compruebe que la impedancia de todos los canales (véase 1.1.6) está en el intervalo de entre 100 - 500 kW.
   5. Antes de la implantación (véase el paso 2) la superficie de molienda de las matrices para que coincida con la convexidad de la superficie cortical.

2. La implantación quirúrgica de matrices en la corteza auditiva en Herbils mongoles anestesiado para uso crónico

1. Sostenga la aprobación oficial para ejecutar todas las medidas experimentales necesarias que se han programado. Use aproropa proceda protectora (capa, guantes estériles, mascarilla quirúrgica, campana).
2. Utilice jerbos adultos varones de Mongolia (Meriones unguiculatus) o cualquier otra especie de roedores. Use guantes de protección y abrigo y utilice siempre instrumentos quirúrgicos esterilizados y bien identificados.
3. En el caso de los jerbos, anestesiar a los animales con una inyección ip de una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) diluido en solución de 0,9% de cloruro de sodio estéril. Mantener mediante la infusión de 0,6 ml / h / kg de una composición mezcla de ketamina: xilazina: cloruro de sodio (0,9%) en la proporción de 9: 1: 10.
4. Coloque los animales en una placa de calefacción para mantener la temperatura corporal a 37 ° C mediante un sistema de retroalimentación sonda rectal (por ejemplo, World Precision Instruments).
5. Afeitado interoccipital piel que cubre, parietal y huesos temporales. Asépticamente preparar el sitio de la incisión con un desinfectante eficaz (por ejemplo., Betadine o Nolvasan y 70% de alcohol friega 3 veces alterna). Projos otect contra secado por pomada para los ojos.
6. Cortar la piel del cráneo que cubre el interoccipital, parietal, y frontal huesos utilizando un bisturí y eliminar periostio moviendo suavemente un taladro sobre la superficie del hueso.
7. Perforar pequeños agujeros en el parietal contralateral y el hueso frontal como lateral como sea posible para no obstaculizar montar la cabeza más tarde. Ahora atornillar dos tornillos para huesos con un diámetro de aproximadamente 1 mm firmemente en los orificios. Asegúrese de que el tornillo parietal tiene un buen contacto a la duramadre, ya que se utilizará como referencia común y tierra, así como electrodo de retorno para la estimulación eléctrica más adelante.
8. Pegue una pequeña barra de aluminio medial en los huesos frontales y utilizarlo como la fijación de la cabeza durante la implantación de un headholder.
9. Quite la piel que cubre los Musculus temporal en un lado con unas tijeras.
10. Corte la parte dorsal del músculo temporal para obtener la admisión en el hueso temporal.
11. Exponga corteza auditiva mediante craneotomía (~ 3 mm x 4 mm) deel hueso temporal mediante el uso de un taladro dental. Identificar la ubicación de la corteza auditiva sobre la base de la típica firma sangre-cerebro-buque ^18,19.
12. Cuidadosamente hacer una incisión de la duramadre con un bisturí micro en la ubicación donde el electrodo de estimulación se implanta en el cerebro. Mueva suavemente a lo largo de la superficie hasta que las lágrimas duramadre para prohibir los daños en los neuropil subyacente.
13. Inserte conjunto de estimulación bajo control micromanipulador. Elegir un ángulo de inserción tangencial para permitir que la matriz epidural que se coloca sobre la región de interés. Dependiendo del ángulo de inserción y la posición y el sitio destinado a la estimulación, considere cuidadosamente la profundidad de inserción.
14. Coloque la matriz grabación superficie epidural con buen contacto con la superficie del cerebro que cubre la región de interés (corteza auditiva aquí) por un segundo micromanipulador. Tenga cuidado de que la matriz coincide con la curvatura de la corteza de no sangrar la duramadre.
15. Fijar los dos conjuntos de electrodos y su tapónviviendas con acrílico dental con el cráneo.
16. Cubierta expuesta superficie cortical con un lubricante antiséptico (por ejemplo, KY-Jelly) y cerca craneotomía con acrílico dental (por ejemplo, Paladur, Heraeus Ulzer). Tenga en cuenta que la polimerización puede producir calor. Utilice suficiente lubricante entre neuropilo y acrílico dental para evitar cualquier contacto del acrílico dental y la superficie cortical, ya que esto podría causar daños en los tejidos.
17. Ahora permite que los animales se recuperen antes del inicio de cualquier procedimiento posterior. Los tiempos de recuperación pueden variar entre las especies (por ejemplo, los jerbos: ≥ 3 días, los ratones: ≥ 7 días). Supervise cuidadosamente el estado del animal y dar tratamiento analgésico en los próximos días si procede (por ejemplo, meloxicam; 1 mg / kg postquirúrgica y 24 horas después de la cirugía).

3. Dos vías de traslado de caja diseños usando ICMS estímulo condicionado

1. La formación de traslado de caja
   1. Coloque una caja de transporte (custom-build o cualquier producto comercial, por ejemplo, E10-E15, Coulbourn Instruments) en una cámara acústica como eléctricamente blindado. La caja contiene dos compartimentos separados por una valla. Tenga en cuenta la altura de la valla, ya que influye en la tendencia del comportamiento de go-respuestas. Utilice alturas apropiadas para las diferentes especies (por ejemplo, ~ 2 cm para los ratones, ~ 3 cm para jerbos).
   2. Para aplicar el pie-shock (Estados Unidos), utilizar un suelo de rejilla con una distancia entre las barras apropiadas para las especies objeto de la investigación ^12,15. Siempre tenga cuidado de que nada Atajos eléctricamente las barras individuales (heces, pelos, crema electrodo).
   3. Después de un considerable tiempo de recuperación del animal (ver 2.17), conecte el sujeto al cable de la grabación y la estimulación preferentemente sin utilizar ningún tipo de anestesia a corto plazo. Trate de cubrir al animal con una toalla y llévelo suavemente al animal en las manos. Destapar la cabeza y conectores del animal con la otra mano y conectar los cables.
   4. Permitir a los animales para habitúan a la cámara de formación durante 3 minutos antes del inicio de cada sesión.
   5. Per sesión de entrenamiento (1 - 2 al día) se aplican entre 30 a 90 ensayos. Duraciones Uso de prueba de hasta 15 segundos, y los intervalos inter-ensayo que varían aleatoriamente entre 25 - 30 seg.
   6. Para la entrega de ICMS para el estímulo condicionado a los electrodos de estimulación utilizar un estimulador multicanal (por ejemplo, MCS STG2000). Para obtener efectos de comportamiento sin dañar el tejido cerebral, aplicar trenes de impulsos (por ejemplo, 300 ms de longitud, 100 pps), de impulsos de carga equilibrada bifásicos (catódica) primero con una duración de fase 200 mu s. Repita los trenes con una pausa de 700 ms con una duración de 4 seg (ventana de observación).
   7. Para la presentación de CS auditiva utilizar una tarjeta PCI de salida analógica (por ejemplo, NI PCI-6733). Programar estos dispositivos con Matlab para controlar de forma flexible y hardware desencadenar el sistema de transporte de la caja a través de las líneas de salida digital.
   8. Ruta de la señal de salida analógica a the de transporte de cajas de altavoces a través de un amplificador de audio.
   9. Condicionalmente entregar el pie-choque de EE.UU. a través de un suelo de rejilla. Para conseguir la mejor calidad de grabación electrofisiológica, generar el choque por un segundo multicanal estimulador de gama alta (MCS STG2000).
   10. Para aplicar el entrenamiento de detección presente sólo estímulos + CS. Aquí, presentes ensayos en blanco sin CS y US intercalados entre los ensayos de prueba (~ 10%) para corregir el comportamiento de transporte sesgada (ver 3.2). Para una tarea más exigente, entrenar a los animales para discriminar entre CS + y estímulos CS-presentados en la misma sesión en orden aleatorio.
   11. Clasifique un cambio compartimento después de la aparición CS + dentro de una ventana de tiempo crítica de 4 seg (CR) como una respuesta exitosa. En los ensayos + CS sin CR en la ventana de tiempo crítico (miss), de presentar inmediatamente un choque leve pie durante 6 a 10 seg como estímulo incondicionado (EI).
       Nota: repetitivo CS + estimulación que se superpone con los EE.UU. reducirá el esfuerzo de aprendizaje para los animales de unnd mejorar la velocidad de aprendizaje y el rendimiento ('retraso' vs. acondicionado 'rastro', véase el debate).
   12. Para los ensayos CS-, clasificar un cambio compartimento dentro de la ventana de tiempo crítica la respuesta falsa alarma, y aplicar los EE.UU. para un máximo de 10 segundos inmediatamente después de este CR inadecuado. No aplique Estados Unidos después de CS- cuando el animal se queda en el compartimiento (sin CR) durante la ventana de tiempo crítico, y clasificar este ensayo rechazo correcto.
       Nota: Es importante destacar que el pie choque Estados Unidos siempre está apagado, cuando los animales cambia compartimento en respuesta a la misma (escape). Utilice las ventanas de tiempo más largo para los ensayos críticos, CS-por ejemplo, si se usan estimulación condicionada repetitivo, aunque esto va a imponer un criterio de aprendizaje más conservador, ya que ofrece un mayor esfuerzo por parte del animal para inhibir la CR.
   13. Para una asociación eficaz de CS y US ajustar la fuerza de choque en un rango moderado para ser aversiva pero no doloroso. Initia óptimal fuerza actual difiere entre especies (por ejemplo, 50 mu para los ratones, 200 mu para jerbos). Por lo tanto, por favor vea los próximos dos balas para más detalles técnicos:
       1. Individualmente adaptar la fuerza de choque en la primera sesión de entrenamiento a partir de las amplitudes moderadas (~ 200 mu para jerbos). Si la fuerza de choque del pie es demasiado bajo, escapar jitter latencias y asociación entre EC y el EI no es óptima.
       2. Siempre presta atención si los animales empiezan a vocalizar y se congele en respuesta a la CS. En este caso la fuerza descarga en las patas es demasiado alto. Esta respuesta de miedo acondicionado interfiere con el aprendizaje de evitación.
   14. Determinar cuidadosamente las latencias de escape. Aumentar la fuerza de choque del pie paso a paso si latencias de escape son más de 2 segundos después de los primeros 20 ensayos. Compruebe después de cada entrenamiento si el animal está bajo control de choque, es decir, muestra escapar latencias muy por debajo de 2 seg.
       Nota: Sin embargo, evitar aumentar el piechoque fuerza demasiado rápidamente, ya que la estrategia de comportamiento de un animal muy estresado puede recurrir a las respuestas de escape puros. Por lo tanto observar de cerca el comportamiento y en particular las latencias de respuesta mientras se ajusta la amplitud de los EE.UU.. Véase un ejemplo en la figura 3E.
   15. Si el animal muestra el CR, deje de presentación de la CS de inmediato. Esto es crucial para el fortalecimiento de la respuesta de evitación.
   16. Si los animales han adquirido una estrategia de evitación, es decir, mostrar CR adecuada a todos CS, variar los parámetros (ICMS amplitud, duración de la fase, la tasa de repetición, etc.) para realizar análisis psicométricos. Aplicar variación CS paramétrica de una forma por bloques con maridaje de Estados Unidos, que sin embargo inducirá el aprendizaje y la adaptación.
       1. Para evitar esto, comenzar con 15 a 30 ensayos de la formación original, y luego al azar intercalar las variaciones CS sin Estados Unidos como ensayos de prueba entre los ensayos de entrenamiento regulares con el original de CS. Máximo de uSE 25% de los ensayos de prueba.
   17. Después de la capacitación quitar el animal de la cámara de formación y limpiar cuidadosamente el cuadro completo antes de la formación de la próxima animal. Trate de evitar la formación de diferentes especies a la vez en la misma caja, ya que su olor natural podría interferir con el rendimiento de la formación.
2. Análisis de datos de entrenamiento
   1. Anote todos los cambios de compartimentos en la fase de habituación.
   2. Anote todos los cambios del compartimiento durante el entrenamiento y se dividen en aciertos y falsas alarmas, escapar de las respuestas (accidentes y lanzaderas de vuelta después de una falsa alarma) y lanzaderas entre ensayos espontáneas (ITS).
   3. Calcular tasas de RC para EC + y EC- la siguiente manera: las tasas de éxito = golpes / número de CS + ensayos; tasas de falsas alarmas = falsas alarmas / número de ensayos CS-.
   4. Obtener tasas de RC sesión se refiere. Sin embargo, para evaluar la dinámica de aprendizaje con una resolución temporal superior, el cálculo de tasas de RC a partir de bloques cortos del mismo número de CS + y los ensayos CS-( por ejemplo, n = 10), respectivamente.
   5. Terreno tasas de RC como una función de la sesión o el bloque de prueba para evaluar la dinámica de progreso de formación y aprendizaje.
   6. Para la cuantificación de la sensibilidad del comportamiento independiente de las condiciones experimentales de desviación de la respuesta del animal, obtener los valores de d 'basados ​​en la teoría de detección de señales ^8,9,17.
   7. Para d 'utilizar el análisis puntuaciones Z de correspondientes tasas de éxito y de falsa alarma (aprendizaje discriminación) o afectadas tarifas y SU (aprendizaje de detección) derivados de las inversas de una función de distribución normal estandarizada y restar estas puntuaciones z. Establecer un criterio de umbral para la detección de estímulo de d '= 1,0, que corresponde a una intensidad de señal de una desviación estándar por encima del ruido. Véase la Figura 3 como ejemplo.
   8. Además de determinar CR- y escapar de los tiempos de reacción en respuesta a diferentes CS midiendo el período de tiempo entre la aparición CS y la respuesta conductual (compartimientocambiar).
   9. Obtener un análisis de comportamiento más detallado de grabar en vídeo el comportamiento de enlace de la caja. Lograr la sincronización temporal entre los sistemas de vídeo y grabación mediante la grabación de pulsos de disparo de la caja de transporte o el sistema de estimulación en la traza de audio del vídeo. Análisis de video permite a las respuestas de atención asnos y de orientación del animal anterior a la CR.

4. En Vivo técnicas electrofisiológicas en el aprendizaje Animales

1. Registro electrofisiológico durante el entrenamiento
   1. Durante el entrenamiento, grabar señales electrofisiológicas (por ejemplo, con las ECoG-arrays descritos) a partir de múltiples electrodos monopolarmente contra el electrodo de referencia común / suelo.
   2. Señales de alimentación de todos los electrodos a un amplificador de cabezal de la platina ya sea conectados directamente o mediante un adaptador corto en los conectores de la cabeza.
   3. Conecte el cabezal de la platina al amplificador principal a través de un arnés de cables flexibles, finas envueltapor una malla metálica para protegerlo de daños al picar a animales.
      Nota: La tensión mecánica en el mazo de cables puede aliviarse mediante un resorte que permite mayor libertad de circulación y la rotación de los animales en la caja. Ideal es el uso de un eslabón giratorio giratorio y motorizado. Sin embargo, para los experimentos auditivos colocar la pieza giratoria fuera de la cámara a prueba de sonido o el sonido protegerlo con espuma para reducir el ruido auditivo de alta frecuencia producida por su motor.
   4. Utilice un preamplificador en el cuadro blindado para aumentar la relación señal-ruido y de paso de banda filtrar la señal en el rango de frecuencia deseado.
   5. Datos de la muestra en más de 1 kHz de frecuencia de muestreo (por campo local de grabaciones potenciales) y al menos 40 kHz (por acción posibles grabaciones) y almacenar en el PC para análisis fuera de línea. Utilice los ajustes de filtro adecuado para ambos tipos (por ejemplo, 2 - 300 Hz para el potencial del campo local; 300 - 4000 Hz para los potenciales de acción).
   6. Revise cuidadosamente la calidad de la grabación antes del inicio de tlloviendo (no hay ruido o movimiento artefactos). Aplicar una FFT-filtro en línea para la señal para determinar la amplitud de 50 Hz ruido. Si es necesario vuelva a comprobar todas las conexiones entre el conector de la cabeza, los adaptadores, los cabezales, el mazo de cables y los amplificadores.
   7. Para la reducción de los artefactos en los datos registrados evocados por estimulación eléctrica utilizar un procedimiento de interpolación para reconstruir todos los puntos de datos afectados por el artefacto 1 ms antes hasta ~ 5 ms después del inicio de cada pulso. Para ello, inserte ceros entre los puntos de datos no afectados, y aplicar un filtro FIR simétrico que minimiza los errores de un cuadrado medio entre los puntos interpolados y sus valores ideales (función interp.m de Matlab). Aplicar este procedimiento para la señal sin procesar, por separado en cada canal antes de un análisis adicional ^9.
2. Detalles técnicos de formación de enlace de la caja paralela, ICMS, y grabación
   1. En general, asegúrese de que los animales se sientan cómodos en el surroundi cuadrong. Deje que el animal se mueva libremente y llegar a todas las esquinas de la caja. Tiempo suficiente para habituar un día antes del primer entrenamiento (20 min) y antes de cada período de sesiones (3 min) es beneficioso.
   2. Después de cualquier tratamiento quirúrgico, permite al animal el tiempo suficiente para recuperarse incluyendo la medicación si es necesario (ver arriba 2,17) y empezar a entrenar el animal solamente, si los animales no muestran signos típicos de sufrir o dolor (ojos cerrados, fenotipo letargo, piel desaliñada ^20).
   3. Asegúrese de tierra adecuada del suelo de rejilla. Los lazos de tierra entre el sistema de grabación, de traslado de la caja y el animal debe ser evitada. Conecte a tierra el animal sólo a través de su electrodo de un terreno común, dejando el gridfloor a un voltaje flotante.
   4. Conecte el estimulador multicanal (MCS STG2000) al conector de la cabeza de la matriz de electrodos de estimulación implantado a través de líneas separadas de la pieza giratoria motorizada.
   5. Utilice el electrodo de masa común de grabación como la tierra o electrodo de retorno para el ICMS, también.

5. Análisis histológico de posiciones de electrodos

1. Siguiendo el conjunto de entrenamiento completo, el control de la posición estable de la matriz de electrodos de estimulación mediante el análisis histológico.
2. Anestesiar a los animales con una inyección ip de una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) diluido en 0,9% de sodio-cloruro estéril. A continuación, aplicar corriente catódica monopolar (30 mu de 60 seg) entregado a través de todos los canales de estimulación para obtener depósito de hierro en el tejido en la posición ⁸ de la implantación.
3. Siguiendo este procedimiento, sacrificar al animal con un método apropiado y aprobado de la eutanasia (por ejemplo, inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital; 100 mg / kg).
4. Retire el cerebro del animal inmediatamente y congelarlo en 2-metilbutano enfriado a -70 ° C en nitrógeno líquido.
5. Ahora corte la región de interés en un micrótomo criostato a 50 micras hsecciones orizontal.
6. Histología: -staining Nissl y "Azul de Prusia"
   1. Para la identificación de las capas corticales tratar a cada segundo sector con Nissl mancha. En primer lugar, bañarse rodajas de 5 min en 0,05 M tampón de sodio trihidrato de acetato (pH 4,0 -4,2).
   2. Bañe rodajas de 5 a 10 min en el 5% de acetato de cresilo violeta. Enjuague rebanadas con agua destilada.
   3. Bañar las rebanadas de 2 min consecutivamente en 0,05 M tampón de sodio trihidrato de acetato (pH 4,0 - 4.2), y en soluciones de 50%, 70% y 90% de etanol, respectivamente.
   4. Bañe rebanadas dos veces en isopropanol: etanol al 96% (2: 1) durante 5 minutos cada uno.
   5. Por último, se bañan en rodajas Roticlear tres veces durante 5 min.
   6. Obtener ubicación de los canales de estimulación por -staining "Azul de Prusia" de cualquier otra división que hace que el depósito de hierro provocada por las corrientes monofásicas de largo después de los experimentos visibles.
   7. Prepare una solución fresca de 1% hexacyanoferrat potasio (II) trihidrato K ₄[Fe (CN) _6] mediante la mezcla de 2 g de K ₄ [Fe (CN) _6] en 200 ml de HCl al 1%.
   8. Añadir 800 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4).
   9. Bañar rodajas de cerebro de 10 min con agua destilada, y después durante 10 min en la solución hexacyanoferrat.
   10. Bañar rodajas dos veces por 10 min en tampón de fosfato 0,1 M y, finalmente, durante 5 minutos en agua destilada.

Resultados

En esta sección se muestra un ejemplo representativo de aprendizaje de transporte de la caja en un jerbo de Mongolia. El tema fue entrenado para discriminar el sitio ICMS entre dos electrodos de estimulación implantado 700 micras separados unos de otros en la corteza auditiva (Figuras 1 y 2). Arrays de estimulación se pueden personalizar en diferentes diseños espaciales (Figura 1). Aquí, la discriminación de los dos sitios ICMS se supo a 3 sesiones de entrenamient...

Discusión

Este protocolo describe un método de ICMS específicos del sitio simultáneas y registros electrofisiológicos multi-canal en un animal de aprendizaje mediante el uso de un sistema de lanzadera-box controlado aversivo pie-choque de dos vías. El protocolo hace hincapié en conceptos claves técnicas para dicha combinación, y señala la importancia de la conexión a tierra el animal sólo a través de su electrodo de un terreno común, dejando el gridfloor a un voltaje flotante. Aquí, el aprendizaje auditivo lanzadera...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-insulated stainless steel wire	California Fine Wire		diam. 50µm w/ isolation
Pin connector system	Molex Holding GmbH	510470200	1.25 mm pitch PicoBlade
TEM grid Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
Dental acrylic Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
Hand-held drill OmniDrill35	WPI	503599
Ketamine 500mg/10ml	Ratiopharm GmbH	7538837
Rompun 2%, 25ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
Sodium-Chloride 0.9%, 10ml	B.Braun AG	PRID00000772
Lubricant KY-Jelly	Johnson & Johnson
Shuttle-box E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
Stimulus generator MCS STG 2000	Multichannel Systems
Plexon Headstage cable 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32v-G20
Plexon Headstage  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32v-G20
PBX preamplifier 32 channels	Plexon Inc.	32PBX box
Multichannel Acquisition System	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
Cryostate CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
Signal processing Card Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM Stereotaxic Instruments	Stoelting Co.
Audio attenator g.pah	g.pah Guger technologies
Cresyl violet acetate	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
Sodium acetate trihydrate	Roth GmbH	6779.1
Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate	Roth GmbH	7974.2
Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate	Merck	1,065,801,000
ICM Impedance Conditioning Module	FHC	55-70-0
Animal Temperarture Controler	World Precision Instruments	ATC2000