Combinado Shuttle-Box Formação com eletrofisiológica Cortex Gravação e Estimulação como Ferramenta para o Estudo de Percepção e Aprendizagem

Resumo

Shuttle-box aprendizagem evasão está bem estabelecida em neurociência comportamental. Este protocolo descreve como shuttle-box aprendizagem em roedores pode ser combinado com microstimulation site-specific elétrica intracortical (ICMS) e crônica simultânea em gravações vivo como uma ferramenta para estudar vários aspectos da aprendizagem e percepção.

Resumo

Aprendizagem evasão Shuttle-box é um método bem estabelecido na neurociência e experimentais setups comportamentais foram tradicionalmente feitos sob medida; o equipamento necessário está disponível agora por várias empresas comerciais. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de uma de duas vias evitar shuttle-box paradigma de aprendizagem em roedores (gerbilos da Mongólia aqui; Meriones unguiculatus) em combinação com microstimulation site-specific elétrica intracortical (ICMS) e simultâneos crônicas eletrofisiológicos in vivo gravações. O protocolo detalhado é aplicável a estudar vários aspectos do comportamento de aprendizagem ea percepção em diferentes espécies de roedores.

ICMS específicas do local de circuitos corticais auditivas como estímulos condicionados aqui é usado como uma ferramenta para testar a relevância perceptual de aferentes específico, eferentes e conexões intracorticais. Padrões de ativação distintas pode ser evocado, utilizando diferentes arr eletrodo de estimulaçãoays para ICMS, dependente da camada locais ou sites de ICMS distantes. Utilizando análise comportamental detecção do sinal pode ser determinada qual a estratégia de estimulação é mais eficaz para provocar um sinal detectável comportamentalmente e saliente. Além disso, multicanal-gravações paralelas utilizando diversos modelos de eletrodos (eletrodos de superfície, eletrodos de profundidade, etc.) permitem investigar observáveis ​​neuronais ao longo do tempo, destes processos de aprendizagem. Será discutido como as mudanças do projeto comportamental pode aumentar a complexidade cognitiva (por exemplo, detecção, discriminação, aprendizagem reversa).

Introdução

Um objectivo fundamental da neurociência comportamental é estabelecer ligações específicas entre as propriedades estruturais e funcionais neuronais, aprendizagem e percepção. Atividade neural associada com a percepção e aprendizagem pode ser estudada pela gravação eletrofisiológico dos potenciais de ação e potenciais de campo locais em várias estruturas cerebrais em vários locais. Considerando registros eletrofisiológicos fornecer associações correlativas entre a atividade eo comportamento neural, microstimulation elétrica direta intracortical (ICMS) por mais de um século tem sido o método mais direto para as relações causais testes de populações de neurônios excitados e seus efeitos comportamentais e perceptivas ^{1 - 3.} Muitos estudos têm demonstrado que os animais são capazes de fazer uso de várias propriedades espaciais e temporais de estímulos eléctricos em tarefas perceptivas, dependendo do local dentro de estimulação por exemplo retinotópica ^4, tonotopic ^{5, 6} ou somatotópica regiões no córtex. Propagação da actividade eléctrica evocada no córtex é determinada principalmente pela disposição das fibras axonais e a sua conectividade synaptic distribuído ² que, no córtex, é claramente dependente da camada ^7. A ativação resultante polysynaptic evocada pelo ICMS é doravante muito mais difundida do que efeitos diretos do ^2,8,9 campo elétrico. Isso explica por que os limiares de efeitos perceptivos induzidos pelo microstimulation intracortical pode ser fortemente camadas dependente ^{8,10,11 e} 9-dependente site. Um estudo recente demonstrou em detalhes que a estimulação de camadas superiores rendeu mais ativação generalizada de circuitos corticocortical em camadas principalmente supragranular, enquanto a estimulação de camadas mais profundas do córtex resultado em um corticoefferent recorrente focal intracolumnar ativação. Experimentos comportamentais paralelas revelou que este último tem muito mais baixo thr detecção perceptualesholds ^8. Portanto, a vantagem de site-specific ICMS como estímulos condicionados foi explorada em associação com registros eletrofisiológicos para relacionar causalmente ativações de circuitos corticais específicas ^{8 a} medidas comportamentais de aprendizagem e percepção em shuttle-box.

O bidirecional shuttle-box paradigma é um aparelho de laboratório bem estabelecido para estudar aprendizagem evasão ^12. Um shuttle-box é composto por 2 compartimentos separados por um obstáculo ou um pórtico. Um estímulo condicionado (CS) que está representada por um sinal adequado, como uma luz ou de som, é contingente, seguido por um estímulo não condicionado aversivo (EUA), como por exemplo, um choque no pé ao longo de um chão de grade de metal. Os indivíduos podem aprender a evitar os EUA por vaivém de um compartimento shuttle-box para o outro em resposta ao CS. Aprendizagem Shuttle-box envolve uma seqüência de fases de aprendizagem distintas ^13,14: Em primeiro lugar,assuntos aprender a prever os EUA a partir do CS por condicionamento clássico e para escapar de os EUA por condicionamento instrumental, como os EUA é encerrado mediante vaivém. Numa fase seguinte, o indivíduo aprende a evitar completamente os EUA por vaivém, em resposta ao CS antes do início dos EUA (reacção de evasão). Geralmente, a aprendizagem shuttle-box envolve o condicionamento clássico, condicionamento instrumental, bem como o comportamento goal-directed dependendo aprendizagem fase ^14.

O procedimento shuttle-box pode ser configurado facilmente e geralmente produz um comportamento robusto após algumas sessões diárias de treinamento ^{15 - 17.} Além de simples evasão condicionado (detecção), shuttle-box pode ser ainda utilizado para estudar a discriminação estímulo empregando paradigmas go / Nogo. Aqui, os animais são treinados para evitar os EUA por uma resposta condicionada (CR) (ir comportamento; shuttle para o compartimento oposto), em resposta a um ir-estímulo (CS +) e pelo comportamento Nogo (permanecer no compartimento de corrente, sem CR), em resposta a um Nogo-estímulo (CS-) microestimulação paralela e gravação de actividade neural com matrizes multieletrodo de alta densidade permitem estudar. os mecanismos fisiológicos subjacentes aprendizagem bem sucedida. Vários detalhes técnicos que são fundamentais para as combinações bem sucedidas de formação shuttle-box, ICMS e eletrofisiologia Paralelamente, serão discutidos.

Protocolo

Todos os experimentos apresentados neste trabalho foram conduzidos de acordo com os padrões éticos definidos pela lei alemã para a protecção dos animais experimentais. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Estado da Saxônia-Anhalt.

1. Custom-made Multicanal Eletrodo Arrays para microestimulação e Gravação

1. Matriz microstimulation Custom-made
   1. Para a entrega de ICMS, preparar eletrodos de estimulação no projeto espacial desejado (aqui lateral da matriz 2 canais), utilizando longos fios de aço inoxidável de 3 cm com isolamento de Teflon (Ø com isolamento = 50 mm). Veja a Figura 2.
   2. Crimp uma das extremidades dos fios para um sistema de pino macho (1,25 mm Passo).
   3. Para uma gama de 2 canais com ~ 0,5 mm ou 0,7 milímetros ~ fios de passe distância eletrodo perpendicularmente através de microscopia eletrônica de duas grades porta-objeto alinhados verticalmente (distância de grades ~ 5 mm) que orientam os fios (0,1654 milímetro passo).
   4. Fios de cola, juntamente com uma pequena gota de acrílico dental cerca de 4 mm acima das terminações dos fios que finalmente servem como dicas de eléctrodos.
   5. Coloque pinos macho no alojamento do obturador.
   6. Colocar o eléctrodo em um prato com uma solução electrolítica (por exemplo, cloreto de sódio a 0,9%) e medir a impedância de cada canal com um respectivo dispositivo de medição de impedância (por ex., FHC Impedância módulo de condicionamento). Visam impedâncias na faixa de 100 a 500 kW.
      1. Se a impedância é muito alto, fornecer corrente curto-circuito eléctrico (1 seg, 1 mA) através dos canais para o baixar. Verifique impedância novamente.
2. De alta resolução matrizes de gravação multicanal Custom-made
   Nota: este protocolo descreve a fabricação de matrizes de superfície para a gravação de dados eletrocorticograma (ECoG). No entanto, os projetos podem ser adaptados para atender as exigências da respectiva questão de pesquisa (gravações de profundidade, etc.). Matrizes multicanal de alta resolução são built por fios de aço inoxidável com isolamento de Teflon (Ø com isolamento = 50 mm) frisado a um sistema de pin masculino (1,25 milímetros pitch).
   1. Para matrizes de eletrodos de superfície, 18 fios orientar através de uma matriz 3 x 6 de microscopia eletrônica de duas grades porta-objeto preparadas.
   2. Incorporar a disposição 6 x 3 dos fios entre as grades com acrílico dental e colocar pinos na caixa da ficha.
   3. Moer o acrílico dental em um bloco retangular usando moedor anexado a uma broca de mão.
   4. Verificar que a impedância de todos os canais (ver 1.1.6) está no intervalo entre 100 - 500 kQ.
   5. Antes de implantação (ver passo 2) moagem superfície das matrizes para coincidir com a convexidade da superfície cortical.

2. implantação cirúrgica de Arrays em Auditivo Cortex em Herbils mongóis anestesiados para uso crônico

1. Segure a aprovação oficial para executar todas as etapas experimentais necessários que são planejadas. Desgaste aproroupas disso proteção (casaco, luvas estéreis, máscara cirúrgica, exaustor).
2. Use gerbilos adultos do sexo masculino (Meriones unguiculatus mongóis) ou quaisquer outras espécies de roedores. Usar luvas e casaco e sempre usar instrumentos cirúrgicos esterilizados e bem identificados.
3. No caso de roedores, anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluído em solução de cloreto de sódio a 0,9% estéril. Manter por infusão de 0,6 ml / h / kg de uma composição de mistura de cetamina: xilazina: cloreto de sódio (0,9%) numa proporção de 9: 1: 10.
4. Coloque o animal sobre uma placa de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C por um sistema de feedback sonda rectal (por exemplo, instrumentos de precisão mundo).
5. Raspar pele cobrindo interoccipital, parietal, e ossos temporais. Assepticamente preparar o local da incisão com um desinfectante eficaz (por exemplo., Alternando Betadine ou Nolvasan e 70% de álcool esfrega 3 vezes). Prolhos otect contra secagem por pomada.
6. Corte a pele que cobre o crânio interoccipital, parietal e frontal ossos utilizando um bisturi e remover periósteo delicadamente movendo uma broca sobre a superfície do osso.
7. Perfurar pequenos buracos no parietal contralateral e osso frontal como lateral, como possível não impeçam a cabeça depois montar. Agora o parafuso de dois parafusos de osso, com um diâmetro de cerca de 1 mm a firmemente nos orifícios. Certifique-se de que o parafuso parietal tem bom contato com a dura-máter, uma vez que será usado como referência comum e do solo, bem como eletrodo de retorno para a estimulação elétrica mais tarde.
8. Cole uma pequena barra de alumínio medial ao longo dos ossos frontais e usá-lo como fixação de cabeça durante a implantação de um headholder.
9. Retire a pele que cobre os Musculus temporalis de um lado usando uma tesoura.
10. Corte a parte dorsal do músculo temporal para obter a admissão ao osso temporal.
11. Expor córtex auditivo por craniotomia (a 3 mm x 4 mm) deosso temporal usando uma broca de dentista. Identificar a localização do córtex auditivo baseado na assinatura típica sangue-cérebro vasos ^18,19.
12. Cuidadosamente fazer uma incisão da dura-máter com um bisturi micro no local onde o eléctrodo de estimulação é implantado no cérebro. Suavemente mover ao longo da superfície até que as lágrimas dura para proibir o neuropil danos ao subjacente.
13. Insira estimulação matriz sob controle micromanipulador. Escolha um ângulo de inserção tangencial para permitir que a matriz epidural para ser colocado ao longo da região de interesse. Dependendo do ângulo de inserção e posição eo site voltado de estimulação, considere cuidadosamente a profundidade de inserção.
14. Coloque a epidural matriz de gravação da superfície com um bom contacto com a superfície do cérebro que cobre a região de interesse (córtex auditivo aqui) por um segundo micromanipulador. Tome cuidado para que a matriz corresponde à curvatura do córtex para não recuar a dura.
15. Fixar ambas as matrizes de eletrodos e seus plugcaixas com acrílico dental no crânio.
16. Capa expostos superfície cortical com um lubrificante anti-séptico (por exemplo, KY Jelly-) e perto craniotomia com acrílico dental (por exemplo, Paladur, Heraeus Ulzer). Tenha em mente que a polimerização pode produzir calor. Use lubrificante suficiente entre neuropil e acrílico dental para evitar qualquer contato do acrílico dental ea superfície cortical, pois isso pode causar danos aos tecidos.
17. Agora que os animais possam se recuperar antes do início de qualquer procedimento adicional. O tempo de recuperação pode variar entre as espécies (por exemplo, gerbos: ≥3 dias, ratos: ≥ 7 dias). Acompanhar atentamente o estatuto do animal e dar tratamento analgésico nos dias seguintes se for o caso (por exemplo, meloxicam; 1 mg / kg pós-cirúrgica e 24 horas após a cirurgia).

3. Duas vias Designs Shuttle-caixa usando ICMS estímulo como Condicionada

1. Formação Shuttle-box
   1. Coloque um shuttle-box (custom-build ou produtos comerciais, por exemplo, E10-E15, Coulbourn Instruments) em uma câmara acusticamente e eletricamente blindado. A caixa contém dois compartimentos separados por um obstáculo. Considerar a altura do obstáculo, pois influencia o viés comportamental de go-respostas. Use alturas adequadas para espécies específicas (por exemplo, ~ 2 cm para ratos, ~ 3 cm para gerbos).
   2. Para aplicar o pé-choque (US), use um piso de grade com uma distância entre as barras apropriadas para as espécies sob investigação ^12,15. Sempre tomar cuidado para que nada eletricamente Atalhos as barras individuais (fezes, cabelos, eletrodo de creme).
   3. Depois de um tempo de recuperação considerável do animal (ver 2.17), ligar o sujeito ao cabo de gravação e estimulação de preferência sem a utilização de qualquer anestesia a curto prazo. Tentar cobrir o animal com uma toalha e gentilmente levar o animal em mãos. Descobrir a cabeça e conectores do animal com a outra mão e conecte os cabos.
   4. Permitir que os animais se habituam à câmara de treinamento para 3 min antes do início de cada sessão.
   5. Por sessão de treinamento (1-2 dia) aplicar entre 30-90 ensaios. Durações uso experimental de até 15 segundos, e intervalos inter-julgamento que variam aleatoriamente entre 25 - 30 seg.
   6. Para a entrega de ICMS para a estimulação condicionada à eletrodos de estimulação usar um estimulador multicanal (por exemplo, MCS STG2000). Para obter efeitos comportamentais, sem danificar o tecido cerebral, aplicar trens de impulsos (por exemplo, 300 ms de comprimento, 100 pps) de bifásicos, pulsos de carga equilibrada (catódicas primeiro) com uma duração de fase de 200 uS. Repita os comboios com uma pausa de 700 ms com uma duração de 4 seg (janela de observação).
   7. Por apresentar CS auditivo usar uma placa PCI saída analógica (por exemplo, NI PCI-6733). Programar estes dispositivos com Matlab para controlar de forma flexível e hardware de desencadear o sistema de transporte-box através das linhas de saída digital.
   8. Rota do sinal analógico de saída para the shuttle-box alto-falantes através de um amplificador de áudio.
   9. Condicionalmente entregar o pé-choque EUA através de um piso de grade. Para óptima qualidade de gravação eletrofisiológico, gerar o choque por um segundo estimulador multicanal high-end (MCS STG2000).
   10. Para aplicar o treinamento de detecção presente apenas estímulos CS +. Aqui, presentes ensaios em branco sem CS e US intercaladas entre os ensaios de teste (~ 10%) para corrigir o comportamento preconceituoso de transporte (ver 3.2). Para uma tarefa mais exigente, treinar animais para discriminar entre estímulos e CS + CS apresentados na mesma sessão em ordem aleatória.
   11. Classificar uma mudança compartimento após o início CS + dentro de uma janela de tempo crítico de 4 seg (CR) como uma resposta de acerto. Em ensaios + CS sem CR na janela de tempo crítico (miss), entregar imediatamente um choque pé leve de 6 a 10 seg, como estímulo incondicionado (US).
       Nota: estimulação repetitiva CS +, que se sobrepõe com a US irá reduzir o esforço de aprendizagem para o animal umnd melhorar a velocidade de aprendizagem e desempenho («atraso» vs. condicionado 'trace', veja a discussão).
   12. Para ensaios CS-, classificar uma mudança compartimento dentro da janela de tempo crítico resposta de alarme como falsa, e aplicar os EUA por até 10 segundos imediatamente após este CR inadequado. Não aplicar US após CS- quando o animal permanece no compartimento (sem CR) durante a janela de tempo crítico, e classificar este julgamento rejeição como correta.
       Nota: É importante ressaltar que o pé chocar EUA está sempre desligado, quando os animais muda compartimento em resposta a ela (escape). Use janelas de tempo mais críticos para ensaios CS, por exemplo, se a estimulação condicionado repetitivo são usados, embora isso vai impor um critério de aprendizagem mais conservadora, uma vez que proporciona maior esforço por parte do animal para inibir o CR.
   13. Para uma associação eficaz de CS e US ajustar a força de choque numa gama de moderada a fim de ser aversivo mas não dolorosa. INICIA Optimall força atual difere entre as espécies (por exemplo, 50 mA para ratos, 200 mA para gerbos). Portanto, por favor, veja as próximas duas balas para mais detalhes técnicos:
       1. Individualmente adaptar a força de choque na primeira sessão de treinamento começando com amplitudes leves (~ 200 mA para gerbos). Se a força de choque do pé é muito baixo, escapar jitter latências e associação entre CS e dos Estados Unidos não é o ideal.
       2. Sempre preste atenção se os animais começam a vocalizar e congelar em resposta ao CS. Neste caso a força choque nas patas é demasiado elevada. Esta resposta de medo condicionada interfere com a aprendizagem de evitação.
   14. Determinar cuidadosamente as latências de fuga. Aumentar a força de choque do pé passo-a-passo, se as latências de escape são mais de 2 segundos, após os primeiros 20 ensaios. Confira depois de cada treinamento, se o animal está sob controle de choque, ou seja, ele mostra latências de escape consideravelmente abaixo de 2 seg.
       Nota: No entanto, evitar a aumentar péchocar força muito rapidamente, como a estratégia comportamental de um animal altamente estressado pode cair de volta para respostas de fuga puros. Portanto observar de perto o comportamento e particularmente as latências de resposta durante o ajuste da amplitude de os EUA. Para um exemplo veja Figura 3E.
   15. Se o animal mostra o CR, pare de apresentação do CS imediatamente. Isto é crucial para o reforço da resposta de esquiva.
   16. Se os animais tenham adquirido uma estratégia de prevenção, ou seja, mostrar CR adequado a todos CS, variar parâmetros (amplitude, duração da fase de ICMS, taxa de repetição etc.) para realizar análises psicométricas. Aplicar variação paramétrica CS em uma forma por blocos com o emparelhamento dos EUA, que no entanto irá induzir a aprendizagem e adaptação.
       1. Para evitar isso, começar com 15 a 30 ensaios da formação original, e em seguida, aleatoriamente intercalar as variações CS sem EUA como ensaios de teste entre os ensaios regulares de treinamento com o original de CS. Maximamente uSE 25% dos ensaios de teste.
   17. Após o treinamento remover o animal da câmara de formação e limpe cuidadosamente a caixa completa antes do treino da próxima animal. Tente evitar a formação de espécies diferentes ao mesmo tempo na mesma caixa, como o seu cheiro natural pode interferir no desempenho do treinamento.
2. Análise de dados de treino
   1. Grave todas as mudanças compartimento na fase de habituação.
   2. Grave todas as mudanças compartimento durante o treinamento e se dividem em hits e alarmes falsos, escapar as respostas (acidentes e ônibus de volta depois de um alarme falso) e shuttles entre tentativas espontâneas (ITS).
   3. Calcular as taxas de RC para CS + e CS- as seguintes: Taxa de sucesso = Acessos / Número de Cs + ensaios; taxas de falsos alarmes falsos alarmes = / número de ensaios CS.
   4. Obter taxas CR sessão-wise. No entanto, para avaliar a dinâmica de aprendizagem a uma resolução temporal maior, calcular as taxas de CR de blocos mais curtos do mesmo número de CS + e ensaios CS- ( , por exemplo, N = 10), respectivamente.
   5. Plot taxas CR em função da sessão ou bloco de ensaio para avaliar a dinâmica de progresso de formação e de aprendizagem.
   6. Para a quantificação da sensibilidade comportamental independente das condições experimentais de polarização da resposta do animal, derivar valores de d 'baseados na teoria de detecção de sinal ^8,9,17.
   7. Para usar a análise d 'Z-scores de correspondentes taxas de acerto e falso-alarme (aprendizagem discriminação) ou atingidas taxas e ITS (aprendizagem detecção) derivados dos inversos de uma função de distribuição normal padronizada e subtrair esses escores z. Definir um critério de limiar para a detecção de estímulo d '= 1,0, o que corresponde a uma intensidade de sinal de um desvio padrão acima do ruído. Ver figura 3 como exemplo.
   8. Além disso determinar CR- e escapar tempos de reação em resposta a diferentes CS medindo o período de tempo entre o início dos CS e resposta comportamental (compartimento completoalteração).
   9. Obter uma análise mais detalhada do comportamento de filmando o comportamento shuttle-box. Conseguir a sincronização temporal entre os sistemas de vídeo e gravação através da gravação de impulsos de disparo do shuttle-box ou sistema de estimulação no traçado de áudio do vídeo. Análise de vídeo permite aos jumentos atenção e orientar as respostas do animal anterior ao CR.

4. Em Técnicas Vivo eletrofisiológicos em aprender Animais

1. Gravação eletrofisiológico durante o treinamento
   1. Durante o treinamento, gravar sinais eletrofisiológicos (por exemplo, com as ECoG-matrizes descritos) a partir de múltiplos eletrodos monopolarly contra o eletrodo de referência comum / chão.
   2. Sinais para alimentação animal de todos os eletrodos em um amplificador headstage seja conectado diretamente ou através de um pequeno adaptador para os conectores de cabeça.
   3. Conecte o headstage ao amplificador principal através de um arnês de cabos flexíveis, finas envoltopor uma malha metálica para protegê-la de danos causados ​​por morder os animais.
      Nota: O stress mecânico na cablagem pode ser aliviada por uma mola que permite mais a livre circulação e rotação do animal na caixa. Ideal é o uso de um suporte giratório rotativa e motorizado. No entanto, para experiências auditivas colocar o giro fora da câmara à prova de som ou som protegê-lo com espuma para reduzir o ruído acústico de alta frequência produzida pelo seu motor.
   4. Usar um pré-amplificador na caixa blindada para aumentar a relação sinal-ruído e passa-banda filtrar o sinal na gama de frequências desejada.
   5. Dados de exemplo na frequência de mais de 1 kHz amostragem (para campo locais potenciais gravações) e pelo menos 40 kHz (para uma eventual acção gravações) e armazenar para o PC para análise offline. Use as configurações de filtro adequado para ambos os tipos (por exemplo, 2-300 Hz para o potencial de campo local; 300 - 4.000 Hz para os potenciais de ação).
   6. Verifique cuidadosamente qualidade da gravação antes do início da tchover (não há barulho ou movimento artefatos). Aplicar um FFT-filtro em linha para o sinal para determinar a amplitude do ruído de 50 Hz. Se necessário verifique todas as conexões entre o conector de cabeça, os adaptadores, os headstages, o feixe de cabos, e os amplificadores.
   7. Para a redução de artefactos nos dados gravados evocados por estimulação eléctrica usar um procedimento de interpolação para reconstruir todos os pontos de dados afectados pelo artefacto 1 ms antes até ~ 5 ms após o início de cada impulso. Para isso, inserir zeros entre os pontos de dados não afetados, e aplicar um filtro FIR-simétrica que minimiza os erros médios quadrados entre os pontos interpolados e seus valores ideais (função interp.m do Matlab). Aplicar este procedimento para o sinal bruto, separadamente em cada canal antes de uma análise mais aprofundada ^9.
2. Detalhes técnicos de formação paralela shuttle-box, ICMS, e gravação
   1. Em geral, assegurar que os animais se sintam confortáveis ​​no surroundi caixang. Permitir que o animal se movimentar e chegar a todos os cantos da caixa. Tempo suficiente para se habituar um dia antes da primeira formação (20 min) e antes de cada sessão (3 minutos) é benéfica.
   2. Depois de qualquer tratamento cirúrgico, permitir que o tempo suficiente de animais para recuperar incluindo medicação, se necessário (veja acima 2.17) e começar a treinar o animal somente, se os animais não mostram quaisquer sinais típicos de sofrer ou dor (olhos fechados, fenótipo letárgico, pele desalinhado ^20).
   3. Certifique-se de aterramento elétrico adequado do piso grid. Loops de terra entre o sistema de gravação, shuttle-box eo animal deve ser evitado. Aterrar o único animal através do seu eletrodo terra comum, deixando o gridfloor a uma tensão flutuante.
   4. Conecte o estimulador multicanal (MCS STG2000) ao conector de cabeça do conjunto de eletrodos de estimulação implantado através de linhas separadas do girador motorizado.
   5. Use o eletrodo terra comum de gravação como o solo ou eletrodo de retorno para o ICMS, bem.

5. Análise histológica de Eletrodo Posições

1. Após o conjunto de treino completo, para controlar a posição estável do conjunto de eléctrodos de estimulação por análise histológica.
2. Anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) diluído em 0,9% de cloreto de sódio estéril. Em seguida, aplicar monopolar corrente catódica (30 mA durante 60 segundos) entregue através de todos os canais de estimulação para obter depósito de ferro no tecido na posição do implante ^8.
3. Seguindo este procedimento, sacrifício do animal por um método apropriado e aprovado da eutanásia (por exemplo, injecção intraperitoneal de uma sobredose de pentobarbital; 100 mg / kg).
4. Remover o cérebro do animal imediatamente e congelá-lo em 2-metilbutano arrefecida a -70 ° C em azoto líquido.
5. Agora corte da região de interesse em um micrótomo criostato em 50 mm horizontal seções.
6. Histologia: Nissl e "Prussian Blue" -staining
   1. Para identificação das camadas corticais tratar cada segunda fatia com Nissl-coloração. Em primeiro lugar, tomar banho fatias 5 min em tampão de trihidrato de acetato de sódio 0,05 M (pH 4,0 -4,2).
   2. Banhem fatias durante 5 - 10 min em 5% de acetato de violeta de cresilo. Enxágüe fatias com água destilada.
   3. Banhem fatias consecutivamente durante 2 min em tampão de trihidrato de acetato de sódio 0,05 M (pH 4.0 - 4.2), e em soluções de 50%, 70% e 90% de etanol, respectivamente.
   4. Banhem fatias duas vezes em isopropanol: etanol a 96% (2: 1) durante 5 minutos cada.
   5. Finalmente, banhar-se em fatias Roticlear três vezes por 5 min.
   6. Obter localização dos canais de estimulação por -staining "Prussian Blue" de qualquer outra fatia que faz com que a deposição de ferro evocada por longas correntes monofásicas após os experimentos visíveis.
   7. Prepara-se uma solução fresca de 1% hexacyanoferrat de potássio (II) tri-hidrato de K ₄[Fe (CN) _6] por mistura de 2 g de K ₄ [Fe (CN) _6] em 200 ml de HCl a 1%.
   8. Adicionar 800 mL de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4).
   9. Banhar-se fatias do cérebro durante 10 minutos com água destilada, e em seguida, durante 10 minutos na solução hexacyanoferrat.
   10. Banhem fatias duas vezes durante 10 min em tampão fosfato 0,1 M e, finalmente, durante 5 minutos em água destilada.

Resultados

Esta seção ilustra um exemplo representativo da aprendizagem shuttle-box em um gerbilo da Mongólia. O assunto foi treinados para discriminar o sítio ICMS entre dois eléctrodos de estimulação implantado 700 uM afastadas uma da outra no córtex auditivo (Figuras 1 e 2). Matrizes de estimulação pode ser personalizado em diversos modelos espaciais (Figura 1). Aqui, a discriminação dos dois locais de ICMS foi aprendido dentro de 3 sessões de treinamento com a apr...

Discussão

Este protocolo descreve um método de ICMS simultâneas site-specific e registros eletrofisiológicos multi-canal em um animal aprender usando um aversivo pé-choque sistema shuttle-box controlado em dois sentidos. O protocolo enfatiza os principais conceitos técnicos para tal combinação e salienta a importância de fundamentar o animal apenas via sua eletrodo terra comum, deixando o gridfloor a uma tensão flutuante. Aqui, auditiva aprendizagem shuttle-box foi aplicada a gerbilos da Mongólia como reorganizações p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-insulated stainless steel wire	California Fine Wire		diam. 50µm w/ isolation
Pin connector system	Molex Holding GmbH	510470200	1.25 mm pitch PicoBlade
TEM grid Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
Dental acrylic Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
Hand-held drill OmniDrill35	WPI	503599
Ketamine 500mg/10ml	Ratiopharm GmbH	7538837
Rompun 2%, 25ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
Sodium-Chloride 0.9%, 10ml	B.Braun AG	PRID00000772
Lubricant KY-Jelly	Johnson & Johnson
Shuttle-box E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
Stimulus generator MCS STG 2000	Multichannel Systems
Plexon Headstage cable 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32v-G20
Plexon Headstage  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32v-G20
PBX preamplifier 32 channels	Plexon Inc.	32PBX box
Multichannel Acquisition System	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
Cryostate CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
Signal processing Card Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM Stereotaxic Instruments	Stoelting Co.
Audio attenator g.pah	g.pah Guger technologies
Cresyl violet acetate	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
Sodium acetate trihydrate	Roth GmbH	6779.1
Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate	Roth GmbH	7974.2
Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate	Merck	1,065,801,000
ICM Impedance Conditioning Module	FHC	55-70-0
Animal Temperarture Controler	World Precision Instruments	ATC2000