Algı ve Öğrenme Eğitim bir aracı olarak Elektrofizyolojik Cortex Kayıt ve Stimülasyon ile Servisi-Box Eğitim Kombine

Özet

Servis kutusu kaçınma öğrenme davranışsal nörobilim iyi bilinmektedir. Bu protokol kemirgenlerde öğrenme mekik kutusu siteye özgü elektrik intrakortikal mikrostimülasyonla (ICMS) ve öğrenme ve algılama çoklu yönlerini incelemek için bir araç olarak in vivo kayıtları eşzamanlı kronikleştiriyor ile kombine edilebilir açıklanır.

Özet

Servis kutusu kaçınma öğrenme davranışsal nörobilim ve deneysel kurulumları köklü bir yöntem geleneksel ısmarlama edildi ise; gerekli ekipman çeşitli ticari şirketler tarafından kullanılabilir. Birlikte bölgeye özgü elektrik intrakortikal mikrostimülasyonla (ICMS) ve eşzamanlı kronik elektrofizyolojik in vivo kayıtları ile, bu protokol kemirgenlerde iki yönlü servis kutusu kaçınma öğrenme paradigmasının ayrıntılı bir açıklama (Meriones unguiculatus burada Moğol Gerbil) sağlar. Ayrıntılı protokol, farklı kemirgen türlerinde öğrenme davranış ve algı birden yönlerini incelemek için de geçerlidir.

Burada klimalı uyaranlara olarak işitsel kortikal devrelerin Siteye özgü ICMS belirli afferent, efferent ve intrakortikal bağlantıları algısal alaka test etmek için bir araç olarak kullanılır. Farklı aktivasyon desenleri farklı stimülasyon elektrot arr kullanılarak uyarılmış olabilirYerel, katman bağımlı ICMS veya uzak ICMS siteleri için ays. Stimülasyon strateji davranışsal saptanabilir ve belirgin bir sinyal ortaya çıkarmak için en etkili olduğu tespit edilebilir davranış sinyal algılama analizi kullanmak. Dahası, (vb yüzey elektrotları, derinlik elektrotları) farklı elektrot tasarımları kullanarak paralel çok kanallı-kayıtları gibi öğrenme süreçlerinin süresi boyunca nöronal gözlenebilirleri araştırmak için izin verir. Bu davranış tasarım değişiklikleri bilişsel karmaşıklığı artırabilir nasıl ele (örneğin algılama, ayrımcılık, ters öğrenme) yapılacaktır.

Giriş

Davranışsal nörobilim temel bir amacı nöronal yapısal ve fonksiyonel özellikleri, öğrenme ve algı arasındaki özel bağlantılar kurmaktır. Algı ve öğrenme ile ilişkili sinirsel aktivite birden fazla çeşitli beyin yapılarında aksiyon potansiyeli ve yerel alan potansiyelleri elektrofizyolojik kayıt ile ele alınabilir. ^{3 -} elektrofizyolojik kayıtlar sinirsel aktivite ve davranış arasındaki karşılıklı dernekler sağlayan Oysa, bir yüzyıl boyunca doğrudan elektrik intrakortikal mikrostimülasyonla (ICMS) nöronların heyecanlı nüfus ve bunların davranışsal ve algısal etkileri ¹ test nedensel ilişkileri için en doğrudan bir yöntem olmuştur. Birçok çalışma hayvanlar örnek retinotopic ^4, t içinde stimülasyon sitesine bağlı algısal görevleri elektrik uyaranların çeşitli mekansal ve zamansal özelliklerinin faydalanmak mümkün olduğunu göstermiştirkortekste onotopic ⁵ ya da ⁶ somatotopik bölgeleri. Kortekste örneğin elektrik kuvvetiyle uyandırılan aktivitesi yayılması çoğunlukla aksonal lifler ve korteks, açık bir şekilde katmanın bağımlı ^7, onların dağıtılmış sinaptik bağlantı ² düzeni ile belirlenir. ICMS tarafından uyarılmış sonuçtaki polisinaptik aktivasyon daha bundan böyle elektrik alan ^2,8,9 doğrudan etkilerinden daha yaygın olduğunu. Intrakortikal mikrostimülasyonla tarafından ortaya algısal etkileri eşikleri kuvvetle katman bağımlı ^8,10,11 ve site bağımlı ⁹ olabilir açıklıyor. Yeni yapılan bir çalışmada korteks sonucu derin katmanlarının uyarılması aktivasyonu intracolumnar fokal, tekrarlayan corticoefferent ise üst katmanlar uyarılması, özellikle supragranular katmanlarda corticocortical devrelerin daha yaygın aktivasyonunu vermiştir detaylı olarak gösterdi. Paralel davranışsal deneyler ikincisi çok daha düşük algısal algılama thr sahip olduğunu ortaya çıkarmıştıresholds ^8. Nedensel ⁸ mekik-box öğrenme ve algılama davranışsal tedbirler belirli kortikal devre aktivasyonları ilişkilendirmek nedenle, bölgeye özgü ICMS olarak koşullandırılmış uyaranlara avantajı elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istismar edildi.

İki yönlü servis kutusu paradigma kaçınma öğrenme ¹² incelemek için iyi kurulmuş bir laboratuvar cihazıdır. Bir mekik-box bir engel veya kapı ile ayrılmış 2 bölmeden oluşmaktadır. Bir ışık veya ses gibi uygun bir sinyal ile temsil edilen bir durumunu teşvik (CS), olumsal, caydırıcı bir şartsız uyarıcı (ABD) tarafından takip edilir, örneğin bir metal ızgara zemin üzerinde ayak şoku. Denekler CS karşılık diğer bir mekik kutusu bölümünden mekik ile ABD'yi önlemek için öğrenebilirsiniz. : Birincisi, mekik-box öğrenme ^13,14 ayırt öğrenme evreleri bir dizi içerirkonular klasik koşullanma CS ABD tahmin etmek ve ABD mekik üzerine sonlandırıldı olarak, enstrümantal klima tarafından ABD'ye kaçmak için öğrenirler. Bir sonraki aşamada, deneklere ABD başlamasından önce CS (kaçınma reaksiyonu) cevaben mekik ile tamamen ABD'nin önlemek için öğrenirler. Genellikle, mekik kutusu öğrenme klasik klima, enstrümantal klima yanı sıra aşamasını ¹⁴ öğrenmeye bağlı olarak hedefe yönelik davranışı içerir.

Mekik kutusu prosedürü kolayca kurmak ve genellikle birkaç günlük eğitim oturumları ¹⁵ sonra sağlam bir davranış üretir ^olabilir - ^17. Basit kaçınma klima (algılama) ek olarak, mekik kutusu ayrıca go / NOGO paradigmalar kullanılarak uyaran ayrımcılığı incelemek için kullanılabilir. Burada, hayvanlar klimalı tepki ile ABD (CR) (davranışı gidin; karşıt bölmeye shuttle) önlemek için eğitilmiş bir tepki olarak NOGO-uyarıcı (CS-) tepki olarak yüksek yoğunluklu multielectrode dizileri ile paralel mikrostimülasyonla ve nöral aktivitenin kayıt., strong> go-uyaran (CS +) ve NOGO davranış tarafından (hiçbir CR geçerli bölme içinde kalmak) Başarılı öğrenme altında yatan fizyolojik mekanizmalar. Mekik-box eğitimi, ICMS ve paralel elektrofizyoloji başarılı kombinasyonları için temel birkaç teknik detayları ele alınacaktır.

Protokol

Bu çalışmada sunulan tüm deneyler deney hayvanlarının korunması için Alman kanunlarına göre belirlenen etik standartlar ile anlaşma yapılmıştır. Deneyler Saksonya Anhalt eyaletinin etik komite tarafından kabul edildi.

1. Ismarlama mikrostimülasyonla ve Kayıt için Çok Kanallı Elektrot Diziler

1. Ismarlama mikrostimülasyonla dizisi
   1. ICMS teslim için (= izolasyonla Ø 50 mikron) 3-cm uzunluğunda teflon yalıtımlı çelik teller kullanarak istenen mekansal tasarım (2 kanal burada yan dizi) stimülasyon elektrotlar hazırlar. Şekil 2'ye bakınız.
   2. Bir erkek pim sistemi (1.25 mm pin) ile tellerin ucunu kıvırın.
   3. 2-kanallı ile dizide ~ 0.5 mm veya ~ için teller (0,1654 mm pin) rehberlik dik iki dikey hizalanmış elektron mikroskobu nesne tutucu ızgaraları (~ 5 mm ızgaralara mesafe) ile 0.7 mm elektrot mesafesi geçiş telleri.
   4. 4 mm nihayet elektrot uçları olarak hizmet tellerin uçlarının üzerinde diş akrilik küçük bir damla ile birlikte Tutkal telleri.
   5. Fiş muhafazası içine erkek işaretçilerine koyun.
   6. Elektrolitik solüsyon (örn% 0.9 sodyum klorür) içeren bir tabak elektrodu koyun ve ilgili bir empedans ölçüm cihazı ile her kanalın empedans ölçer (örneğin., FHC Empedans Klima Modülü). 100 ila 500 kohm aralığındaki empedansları hedefliyoruz.
      1. Empedans çok yüksek ise, o düşürmek için kanallardan kısa elektrik akımı (1 sn, 1 mA) teslim. Tekrar empedansını edin.
2. Ismarlama yüksek çözünürlüklü çok kanallı kayıt dizileri
   Not: Bu protokol electrocorticogram (ECoG) verilerini kaydetmek için yüzey dizilerin üretimini açıklar. Ancak, tasarımlar, ilgili araştırma sorusunun gereklerini (derinlik kayıtları, vb) karşılamak için uygun olabilir. Yüksek çözünürlüklü çok kanallı diziler Buil vardırTeflon yalıtımlı paslanmaz çelik teller (mikron izolasyonla Ø = 50) tarafından t erkek pim sistemi (1.25 mm pin) kıvrılarak.
   1. Yüzey elektrot diziler, iki hazırlanan elektron mikroskobu nesne tutucu ızgaraları 3 x 6 matris boyunca 18 tel kılavuz.
   2. Diş akrilik ile ızgaraların arasındaki tel 6 x 3 düzenlemeyi göm ve fiş konut işaretçilerine koydu.
   3. Bir el matkap bağlı öğütücü kullanarak dikdörtgen blok içine diş akrilik eziyet.
   4. 500 kH - (1.1.6 bakınız) tüm kanalların bu empedans kontrol 100 aralığı içindedir.
   5. Implantasyon öncesi kortikal yüzeyin konveksliği maç dizilerin eziyet yüzeyini (adım 2).

Kronik Kullanım için Anestetize Moğol Herbils İşitsel korteks içine Diziler 2. Cerrahi İmplantasyonu

1. Planlanan tüm gerekli deneysel adımlar yürütmek için resmi onay tutun. Beğenme Wearzemelerle koruyucu giysi (mont, steril eldivenler, cerrahi maske, davlumbaz).
2. Yetişkin erkek Moğol Gerbil (Meriones unguiculatus) ya da diğer herhangi bir kemirgen türleri kullanın. Sterilize ve iyi tanımlanmış cerrahi aletler kullanmayın zaman koruyucu eldiven ve ceket giymek ve.
3. Gerbils durumunda,% 0.9 steril sodyum klorid çözeltisi içinde seyreltilmiş ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) karışımı bir ip enjeksiyonu ile hayvanlar uyuşturan. 1: 10: 9 bir oranda sodyum klorid (% 0.9): ksilazin: ketamin karışımı oluşturmanın 0.6 ml / saat / kg infüzyonu ile muhafaza.
4. Rektal prob geri besleme sistemi ile 37 ° C 'de vücut sıcaklığı korumak için bir ısıtma plakası üzerinde hayvan yerleştirin (örneğin, Dünya Precision Instruments).
5. Kürk kapsayan interoccipital, parietal ve temporal kemikler tıraş. Aseptik etkili dezenfektan ile kesi sitesi hazırlamak (örn., Betadine veya Nolvasan ve% 70 alkol ovma 3 kez alternatif). Prgöz merhemi ile kurumaya karşı otect gözler.
6. Interoccipital, parietal kapsayan kafatası cilt kesin ve neşter kullanılarak kemikleri frontal ve yavaşça kemik yüzeyi üzerinde bir matkap hareket ettirerek periost çıkarın.
7. Daha sonra baş bağlama engel değil kontralateral parietal ve mümkün olduğunca lateral frontal kemikte küçük delikler delin. Şimdi sıkı delik içine yaklaşık 1 mm bir çapa sahip, iki kemik vidalarının vidalayın. Sonradan elektriksel stimülasyon için ortak referans ve zemin yanı sıra geri dönüş elektrodu olarak kullanılacaktır olarak parietal vida, dura iyi temas olduğundan emin olun.
8. Frontal kemiklerin üzerinde mediale küçük alüminyum çubuk Tutkal ve çivili başlıkta ile implantasyon esnasında baş sabitleme olarak kullanabilirsiniz.
9. Bir tarafı kullanarak makas üzerinde Musculus temporal kapsayan cilt kaldırın.
10. Temporal kemiğin kabullerini sağlamak için geçici kas dorsal kısmını kesti.
11. Kraniotomi (~ 3 mm x 4 mm) ile işitme korteksi AçığaBir diş matkap kullanarak temporal kemik. Tipik kan-beyin-damar imza ^18,19 dayalı işitsel korteks konumunu tanımlayın.
12. Dikkatle stimülasyon elektrot beyinde implante yerde bir mikro neşter ile dura bir kesi yapmak. Dura gözyaşları yatan nöropilde zarar yasaklamak kadar yavaşça yüzey boyunca hareket ettirin.
13. Mikromanipülatör kontrol altında stimülasyon dizisi yerleştirin. Epidural dizi ilgili bölge boyunca yerleştirilmesini sağlayacak bir tanjant sokulma açısını seçin. Sokma açısına ve pozisyon ve uyarım amaçlı alanına bağlı olarak, dikkatli bir şekilde yerleştirme derinliği düşünün.
14. İkinci mikromanipülatör tarafından ilgi bölgesini (burada işitsel korteks) kapsayan beyin yüzeyine iyi temas ile epidural yüzey kayıt dizisi yerleştirin. Dizi dura girinti değil korteksin eğrilik eşleşen özen gösterin.
15. Elektrot diziler ve onların fişinden sabitleşmekkafatasına diş akrilik ile yuvalar.
16. Kapak diş akrilik bir antiseptik yağlayıcı (örn, KY-Jelly) ile yakın kraniotomi ile kortikal yüzeye maruz (örn Paladur, Heraeus Ulzer). Polimerizasyon ısı üreten olabileceğini aklınızda bulundurun. Bu doku hasarına neden olabileceğinden, diş akrilik ve kortikal yüzeyin herhangi bir teması önlemek için nöropilde ve diş akrilik arasında yeterli yağ kullanın.
17. Şimdi hayvanlar hiçbir işleme başlamadan önce geri izin verir. Kurtarma süreleri türler (: ≥3 gün, farelerde: ≥7 gün, örneğin Gerbils) arasında farklılık olabilir. Dikkatle hayvanın durumunu izleme ve önümüzdeki günlerde analjezik tedavi verirsen uygulanabilir (örneğin, Meloksikam; 1 mg / kg cerrahi sonrası ve ameliyat sonrası 24 saat).

ICMS olarak Koúullanmıú Stimulus Kullanılması 3. İki yönlü Servisi-box Tasarımları

1. Servis kutusu eğitimi
   1. (C bir servis kutusu yerleştirinörneğin ustom-build ya da herhangi bir ticari ürün, akustik ve elektrik korumalı bir odasında E10-E15, Coulbourn Instruments). Kasa bir engel ile ayrılan iki bölmeyi içerir. O go-cevapların davranışsal önyargı etkiler olarak engel yüksekliğini düşünün. Belirli bir tür için uygun yükseklikleri kullanarak (örneğin, ~ fareler için 2 cm ~ Gerbils 3 cm).
   2. Ayak şok (ABD) uygulamak için, soruşturma ^12,15 altında türler için uygun bar arasında bir mesafe ile bir ızgara zemin kullanın. Her zaman bir şey elektrikle bireysel barlar (dışkı, tüyler, elektrot krem) kısayolları dikkat ediniz.
   3. Hayvan (2.17 bakınız) önemli bir iyileşme süresinden sonra, tercihen herhangi bir kısa vadeli anestezi kullanmadan kayıt ve stimülasyon kablosuna konuyu bağlayın. Bir havlu ile hayvan kapsayacak şekilde çalışın ve yavaşça elinde hayvan almak. Öte yandan ile hayvanın baş ve konnektörleri ortaya çıkarın ve kabloları takın.
   4. Hayvanlar Her oturumun başlamasından önce 3 dakika süreyle eğitim odasına alıştırmak için izin verin.
   5. Antrenmandan başına 90 denemeler - (1-2 gün) 30 arasında geçerlidir. Kullanım deneme kadar 15 saniye süreleri ve 25 arasında rastgele değişmektedir arası deneme aralıkları - 30 sn.
   6. Uyarım elektrotlara koşullandırılmış uyarılması için ICMS teslim için (örneğin, MCS STG2000) Çok kanallı uyarıcı kullanın. 200 us faz süresi ile nabız trenler (örneğin, 300 ms uzunluğu, 100 pps) bifazik, şarj dengeli bakliyat (ilk katodik) uygulamak, beyin dokusu zarar vermeden davranışsal etkiler elde etmek için. 4 sn (gözlem pencere) bir süre için 700 ms'lik bir duraklama ile trenler tekrarlayın.
   7. Işitsel CS sunmak için bir analog çıkış PCI kartını (örneğin, NI PCI-6733) kullanın. Esnek kontrol ve dijital çıkış hatları üzerinden mekik-box sistemi donanım tetiklemek için Matlab ile bu cihazlar Programı.
   8. Rota inci analog çıkış sinyalibir ses amplifikatör üzerinden e mekik kutusu hoparlörler.
   9. Şartlı teslim ızgara zemin üzerinden ABD ayak-şok. Optimal elektrofizyolojik kayıt kalitesi için, ikinci bir high-end çok kanallı uyarıcısı (MCS STG2000) tarafından şok oluşturur.
   10. Sadece CS + uyaranlara mevcut algılama eğitimi uygulamak için. Burada test denemeleri (~% 10) arasında serpiştirilmiş CS ve ABD olmadan mevcut boş denemeler önyargılı mekik davranışı (3.2) düzeltmek için. Daha talepkar bir görev için, CS + ve randomize sırayla aynı seansta sunulan CS uyaranlara arasında ayrım hayvanları eğitmek.
   11. Bir hit yanıt olarak 4 saniye (CR) kritik bir zaman penceresi içinde CS + başlangıcından sonra bir bölme değişiklik sınıflandırır. Kritik zaman penceresi (bayan) CR olmadan CS + çalışmalarda, hemen koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak 6 ila 10 saniye boyunca hafif bir ayak şok.
       Not: tekrarlayan CS + stimülasyon ABD ile örtüşmektedir hayvanlar a öğrenme çabası azaltacaktırnd (tartışma, 'iz' klima vs 'gecikme') öğrenme hızını ve performansını artırmak.
   12. CS araştırmalar için kritik zaman pencere yanlış alarm tepkisi içinde bir bölme değişikliği sınıflandırmak ve hemen bu uygunsuz CR sonra 10 saniye boyunca ABD'yi geçerlidir. Hayvan kritik zaman penceresi esnasında bölme (hayır CR) kalır iken CS- sonra ABD geçerlidir ve bu deneme sürümü olarak doğru ret sınıflandırmak etmeyin.
       Not: Hayvanlar ona (kaçış) cevaben bölmesini değiştirdiğinde Önemlisi, ayak, ABD her zaman kapalıdır şok. O CR inhibe hayvanın yüksek çaba tanıyor bu daha muhafazakar bir öğrenme kriterini empoze rağmen, tekrarlayan şartlandırılmış stimülasyon kullanılması durumunda CS çalışmalarda, örneğin, daha uzun kritik zaman pencereleri kullanın.
   13. CS ve ABD'nin etkin bir dernek için caydırıcı ama acı olmamak için ılımlı bir aralıkta şok gücünü ayarlayın. Optimal Initial akım gücü türler arasında farklılık (örneğin, fareler için 50 uA, Gerbils 200 uA). Bu nedenle, daha fazla teknik ayrıntı için önümüzdeki iki mermi bakın:
       1. Bireysel hafif genlikleri (~ Gerbils 200 uA) ile başlayan ilk antrenmandan şok gücünü adapte. Ayak şok mukavemeti çok düşükse CS ve ABD'nin optimal değildir arasında, gecikmeleri titremeleri ve dernek kaçış.
       2. Hayvanlar seslendirmek ve CS yanıt dondurma başlarsanız her zaman dikkat edin. Bu durumda footshock gücü çok yüksek. Bu klimalı korku tepkisi kaçınma öğrenme uğratır.
   14. Dikkatle kaçış gecikmeleri belirler. Adım adım kaçma süreleri ilk 20 denemeden sonra 2 saniye daha uzun ise ayak şok gücünü artırın. Hayvan, yani şok kontrolü altında ise her eğitimden sonra kontrol edin, önemli 2 saniyenin altında gecikmeleri kaçış gösterir.
       Not: Ancak, ayak artırmak önlemekyüksek stresli bir hayvanın davranışsal stratejisi saf kaçış yanıtları geri düşmek gibi, çok hızlı gücünü şok. ABD'nin genliği ayarlanırken nedenle yakından davranış ve özellikle tepki gecikmeleri dikkate alınmalıdır. Örnek olarak Şekil 3E bakın.
   15. Hayvan CR gösteriyorsa, derhal CS sunumu durdurun. Bu kaçınma tepkisinin güçlendirilmesi için büyük önem taşımaktadır.
   16. Hayvanlar kaçınma stratejisi, yani edinilmiş varsa, psikometrik analizleri yapmak için parametreleri (ICMS genlik, faz süresi, tekrarlama oranı vb), tüm CS uygun CR gösteriyor değişir. Ancak öğrenme ve uyum neden olacaktır ABD eşleştirme, bir tümceye moda parametrik CS varyasyonu uygulayın.
       1. Bunu önlemek için, orijinal eğitimin 15 ila 30 denemeler ile başlamak ve daha sonra rastgele orijinal CS adlı düzenli eğitim denemeleri arasındaki sınav denemeleri ABD'de olmadan CS varyasyonları serpmek. Maksimum uTest çalışmaların se% 25.
   17. Eğitimden sonra eğitim odasından gelen hayvan çıkarın ve dikkatlice bir sonraki hayvanın Eğitim öncesi tam kutuyu temizleyin. Doğal kokusu eğitim performansı etkileyebilir olarak, aynı kutuda bir anda farklı türler eğitim önlemek için deneyin.
2. Eğitim verilerinin analizi
   1. Alışma aşamasında tüm bölme değişiklikleri kaydedin.
   2. (ITS) yanıtları (özlüyor ve geri mekikleri yanlış alarmdan sonra) ve spontan intertrial servis kaçış, eğitim sırasında tüm bölme değişiklikleri kaydedin ve hit ve yanlış alarmlara bölün.
   3. Aşağıdaki gibi CS + ve CS- için CR oranları hesaplayın: hit oranlarını = vurur / CS + çalışmaların sayısı; yanlış alarm oranı = false alarm / CS çalışmaların sayısı.
   4. Session-bilge CR oranları edinin. Ancak, daha yüksek bir zamansal çözünürlükte öğrenme dinamiklerini değerlendirmek için (CS + ve CS çalışmaların aynı sayıda kısa bloklardan CR oranları hesaplamak örneğin, n = 10) kullanılarak değerlendirildi.
   5. Eğitim ilerleme ve öğrenme dinamiklerini değerlendirmek için oturumun veya deneme bloğunun bir fonksiyonu olarak arsa CR oranları.
   6. Hayvanın tepki eğimlendirme deneysel koşullar bağımsız davranış hassasiyet ölçümü için, sinyal algılama teorisi ^8,9,17 göre d 'değeri elde.
   7. İlgili hit ve yanlış alarm oranları (ayrımcılık öğrenme) ya da bu z-puanları standartlaştırılmış normal dağılım fonksiyonu terslerinin türetilen oranları ve ITS (algılama öğrenme) çarptı ve çıkarma d 'analiz kullanımı Z-skorları için. D uyaran algılama '= 1.0, gürültü üzerinde bir standart sapma bir sinyal kuvveti karşılık için bir eşik kriter ayarlayın. Örneğin, Şekil 3'e bakınız.
   8. Ayrıca CR-saptamak ve (CS başlangıcı ve davranışsal tepki arasındaki süre ölçerek tam bölmesi farklı CS yanıt tepki süreleri kaçış) değiştirebilirsiniz.
   9. Mekik kutusu davranışını videoya gelen daha detaylı bir davranış analizi edinin. Videonun ses izi üzerinde mekik kutu veya stimülasyon sisteminden tetik bakliyat kaydederek, video ve kayıt sistemleri arasındaki zamansal senkronizasyon sağlamak. Video analiz CR önceki hayvanın eşek dikkat ve yönlendirme yanıtları verir.

Öğrenme Hayvanlarda Vivo Elektrofizyolojik Teknikleri 4.

1. Eğitim sırasında Elektrofizyolojik kayıt
   1. Eğitim süresince, birden fazla elektrot gelen ortak referans / toprak elektrot karşı tek kutuplu (tarif ECoG-dizilerle, örneğin) elektrofizyolojik sinyaller kaydedin.
   2. Bir headstage amplifikatör tüm elektrotların besleme sinyalleri doğrudan veya kafa konnektörleri kısa bir adaptör aracılığıyla takılı.
   3. Sarılmış ince, esnek kablolar bir koşum vasıtasıyla ana amplifikatör headstage bağlayınBir metal hayvanların ısırma yoluyla hasarlardan korumak için örgü.
      Not: Kablo koşum mekanik stres daha da kutuya hayvanın serbest dolaşımını ve rotasyon izin veren bir bahar tarafından giderilebilir. İdeal bir döner ve motorlu döner kullanımıdır. Işitsel deneyler ses geçirmez odasının dışında döner verebilirsiniz veya ses Ancak, onun motor tarafından üretilen yüksek frekanslı işitme gürültüyü azaltmak için köpük ile kalkan.
   4. Sinyal-gürültü oranı ve bant-geçişli istenen frekans aralığındaki sinyal filtre geliştirmek için korumalı kutusuna bir preamplifikatör kullanın.
   5. (Yerel alan potansiyel kayıtlar için) en fazla 1 kHz örnekleme frekansı ve (aksiyon potansiyeli kayıtları için) en az 40 kHz örnek verileri ve çevrimdışı analiz için PC'ye saklayın. Her iki tür için uygun filtre ayarlarını kullanın (örneğin 2 - Yerel alan potansiyeli 300 Hz, 300 - aksiyon potansiyelleri için 4000 Hz).
   6. Dikkatle t başlamadan önce kayıt kalitesini kontrol(gürültü veya hareket eserler) yağmur. 50 Hz gürültü genliği belirlemek için sinyal için bir online FFT filtre uygulayın. Gerekirse baş konnektörü arasındaki tüm bağlantıları çift kontrol adaptörler, headstages, kablo demeti ve yükselteçler.
   7. Elektrik stimülasyonu ile uyarılmış kaydedilen verilerde eserlerin azaltılması için 5 ~ kadar ms her darbenin başlangıcından sonra 1 ms önce dışlayıcı etkilenen tüm veri noktalarını yeniden bir enterpolasyon yordamı kullanın. Bunun için, etkilenmemiş veri noktaları arasındaki sıfır eklemek ve enterpolasyonlu noktaları ve bunların ideal değerlerle (Matlab'ın interp.m fonksiyonu) arasındaki ortalama karesel hataları en aza indirir simetrik FIR-filtre uygulamak. Ayrı ayrı daha fazla analiz ⁹ önce her kanalda, ham sinyal için bu prosedürü uygulayın.
2. Paralel mekik-box eğitim, ICMS ve kaydın Teknik detaylar
   1. Genel olarak, hayvanlar kutu surroundi rahat hissediyorum sağlamakng. Hayvan serbestçe hareket ve kutunun her köşesine ulaşmanızı sağlar. İlk eğitim (20 dk) ve her oturumundan önce (3 dakika) bir gün önce alıştırmak için yeterli zaman yararlıdır.
   2. Herhangi bir cerrahi tedaviden sonra, hayvan, yeterli süre (2.17 yukarıya bakınız) ve gerekirse ilaç kurtarmak ve hayvanların acı veya ağrı herhangi bir tipik belirtileri (kapalı gözler, uyuşuk fenotip, pasaklı kürk göstermek istemiyorsanız, sadece hayvan yetiştirmek başlamak için izin ^20).
   3. Izgara zemine uygun elektrik topraklama sağlayın. Kayıt sisteminde, mekik-box ve hayvan arasındaki zemin döngüler kaçınılmalıdır. Yüzen bir gerilimde gridfloor bırakarak, sadece ortak bir zemin elektrot aracılığıyla hayvan topraklayın.
   4. Motorlu döner ayrı hatları üzerinden implante stimülasyon elektrot dizisinin baş konnektörüne çok kanallı uyarıcı (MCS STG2000) bağlayın.
   5. Zemin olarak kayıt ortak zemin elektrot kullanın veya I elektrot iadeCMS yanı sıra.

Elektrot Pozisyonlar 5. Histolojik Analizi

1. Tam bir eğitim seti takiben, histolojik analiz ile stimülasyon elektrot dizisinin stabil pozisyon için kontrol.
2. % 0.9 steril sodyum klorid içinde seyreltilmiş ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) karışımı bir ip enjeksiyonu ile hayvanlar anestezi uygulayın. Sonra implantasyon ⁸ pozisyonunda dokusunda demir mevduat elde etmek için tüm stimülasyon kanallardan verilen monopolar katodik akım (60 saniye 30 uA) uygulanır.
3. Bu prosedürü takiben, ötenazi uygun ve onaylı yönteme (100 mg / kg dozda pentobarbital örneğin karın içinden enjeksiyon) tarafından hayvan kurban.
4. Hemen hayvanın beyin çıkarın ve 2-metilbütan içinde dondurularak sıvı azot içinde -70 ° C'ye soğutuldu.
5. Şimdi 50 mikron saat içine kriyostat mikrotom faiz bölgeyi kesiporizontal bölümleri.
6. Histoloji: Nissl ve "Prusya Mavisi" -staining
   1. Korteks tabakalarının belirlenmesi için Nissl-boyama ile her saniye dilim davranın. İlk olarak, dilimleri 0.05 M sodyum asetat trihidrat tamponu (pH 4,0 -4,2) 'de 5 dakika banyo.
   2. % 5 cresyl mor asetat 10 dakika - 5 için dilim yıkayın. Distile su ile durulayın dilimleri.
   3. 0.05 M sodyum asetat trihidrat tampon (pH 4,0-4,2) 'de 2 dakika için ardışık dilim yıkayın ve sırasıyla% 50,% 70 etanol,% 90, Çözeltilerin.
   4. Izopropanol içinde iki kez dilimleri batırın:% 96 etanol (2: 1) ve her biri 5 dakika.
   5. Son olarak, 5 dakika boyunca Roticlear üç kez dilim yıkanmak.
   6. Görünür deneyler sonrası uzun monofazik akımlar tarafından uyarılmış demir birikimi yapan her dilimin "Prusya Mavisi" -staining tarafından uyarılması kanalların yerini edinin.
   7. % 1 potasyum hexacyanoferrat taze bir çözüm hazırlayın (II) trihydrate K ₄[Fe (CN) _6] K ₄ 2 g karıştırılarak [Fe (CN) _6],% 1 HCI, 200 ml.
   8. 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) 800 ml ilave edilir.
   9. Hexacyanoferrat çözelti içinde 10 dakika süreyle, sonra damıtılmış su ile 10 dakika boyunca beyin dilimleri yıkayın ve.
   10. 0.1 M fosfat tamponu içinde 10 dakika karıştırıldı ve damıtılmış su içinde son 5 dakika boyunca iki kez dilimleri yıkayın.

Sonuçlar

Bu bölümde Moğol gerbil mekik-box öğrenme temsili örneğini göstermektedir. Konu iki uyarım elektrotları arasında ICMS Alanı işitme korteksindeki birbirinden 700 um implante diskriminasyonu için eğitilmiş olan (Şekiller 1 ve 2). Uyarım diziler farklı mekansal tasarımlar (Şekil 1) özelleştirilebilir. Burada, iki ICMS sitelerinin ayrımcılık 30 CS + ve CS- her (Şekil 3A-C) sunumu ile 3 eğitim oturumları içinde öğrenildi. Bu art arda 7 eğitim...

Tartışmalar

Bu protokol, iki yönlü bir caydırıcı ayak şoku kontrollü mekik kutusu sistemi kullanarak bir öğrenme hayvanda eş zamanlı site-spesifik ICMS ve çok kanallı elektrofizyolojik kayıtları için bir yöntem tarif eder. Protokol, kombinasyon için teknik anahtar kavramları vurgulamaktadır ve sadece ortak bir zemin elektrot aracılığıyla hayvan topraklama yüzer voltajda gridfloor bırakarak önemine işaret etmektedir. Bu hayvanların işitsel korteks öğrenme ile ilgili plastik yeniden yapılanma yoğun <...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Teflon-insulated stainless steel wire	California Fine Wire		diam. 50µm w/ isolation
Pin connector system	Molex Holding GmbH	510470200	1.25 mm pitch PicoBlade
TEM grid Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
Dental acrylic Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
Hand-held drill OmniDrill35	WPI	503599
Ketamine 500mg/10ml	Ratiopharm GmbH	7538837
Rompun 2%, 25ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
Sodium-Chloride 0.9%, 10ml	B.Braun AG	PRID00000772
Lubricant KY-Jelly	Johnson & Johnson
Shuttle-box E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
Stimulus generator MCS STG 2000	Multichannel Systems
Plexon Headstage cable 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32v-G20
Plexon Headstage  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32v-G20
PBX preamplifier 32 channels	Plexon Inc.	32PBX box
Multichannel Acquisition System	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
Cryostate CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
Signal processing Card Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM Stereotaxic Instruments	Stoelting Co.
Audio attenator g.pah	g.pah Guger technologies
Cresyl violet acetate	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
Sodium acetate trihydrate	Roth GmbH	6779.1
Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate	Roth GmbH	7974.2
Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate	Merck	1,065,801,000
ICM Impedance Conditioning Module	FHC	55-70-0
Animal Temperarture Controler	World Precision Instruments	ATC2000