Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Resumen

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Resumen

Mitocondrias del músculo esquelético disfuncionales juegan un papel en el metabolismo alterado observado con el envejecimiento, la obesidad y la diabetes tipo II. Ensayos respirométricos mitocondrial de preparaciones mitocondriales aislados permiten la evaluación de la función mitocondrial, así como la determinación del mecanismo (s) de acción de los fármacos y las proteínas que modulan el metabolismo. Procedimientos de aislamiento actuales requieren a menudo grandes cantidades de tejido para producir las mitocondrias de alta calidad necesarias para los ensayos de respirométricos. Los métodos presentados en este documento describen cómo de alta calidad mitocondrias purificadas (~ 450 g) se puede aislar a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón para su uso en mediciones respiratorias de alto rendimiento. Se determinó que nuestro método de aislamiento produce 92,5 ± 2,0% mitocondrias intactas midiendo la actividad de la citrato sintasa espectrofotometría. Además, el análisis Western blot en mitocondrias aisladas resultó en la expresión débil del cytosoproteína lic, GAPDH, y la expresión robusta de la proteína mitocondrial, COXIV. La ausencia de una banda de GAPDH prominente en las mitocondrias aisladas es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento. Lo más importante, la medición de la tasa de consumo de O ₂ con tecnología basada en micro-placa y la determinación de la relación del control respiratorio (RCR) para los ensayos de respirométricos acoplado muestra altamente acoplado (RCR;> 6 para todos los ensayos) y las mitocondrias funcionales. En conclusión, la adición de una etapa de picar carne separada y reduciendo significativamente impulsado por motor de velocidad homogeneización de un método reportado previamente ha permitido el aislamiento de alta calidad y mitocondrias purificada a partir de cantidades más pequeñas de ratón músculo esquelético que da como resultado en las mitocondrias altamente acoplados que respiran con alta función durante ensayos respirometirc basado en una microplaca.

Introducción

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocolo

Los estudios en animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad Estatal.

1. Configuración (Tiempo: ~ 45 min)

1. Tiendas Descongele de 0,25% de tripsina, Aislamiento Buffer de mitocondrias (IBM) 1 y IBM2 en un baño de agua a 37 ° C.
2. Enjuague la cristalería y los instrumentos de disección en etanol al 70%, seguido de agua de alta pureza.
3. Preparar una solución de tripsina al 0,05% desde 0,25% de tripsina stock de diluir 1 parte de tripsina en 4 partes IBM1.
4. Mezclar proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel con tampón de lisis celular (1: 100 ratio) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca.
5. Alícuota de 5 ml (5 ml / ratón) de 0,05% de tripsina en un tubo de plástico de 15 ml.
6. Conjunto motor impulsado homogeneizador de tejidos a 80 RPM.

2. Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético (Tiempo: ~ 90 min)

1. La eutanasia a un ratón por el CO ₂ inhalación, seguido por dislocación cervical.
2. Eliminar músculo rojo del músculo gastrocnemio y cuádriceps, que incluye el sóleo (~ de 75-100 mg total) como se describe en los siguientes pasos:
   1. Pelar la piel hacia el ratón.
   2. Retire la almohadilla de grasa por encima del punto de origen del cuádriceps. Cortar el tendón del cuádriceps que se adjunta a la rótula con unas tijeras de punta fina.
      Nota: El cuádriceps se identifica por su posición anatómica en la parte anterior del fémur proximal.
   3. Lentamente cortar la aponeurosis entre el hueso y el cuádriceps, evitando al mismo tiempo la arteria femoral, para liberar el cuádriceps de la médula. Cortar el tendón con tijeras de punta fina en el punto de origen en el fémur para liberar el músculo cuádriceps y colocar el músculo cuádriceps en PBS enfriado.
   4. Retire el tejido adiposo visible sobre los cuádriceps con tijeras. Voltear las cuádriceps de manera que la porción del músculo que se recubre el fémur se enfrenta up. Abra el músculo cuádriceps con fórceps en un movimiento en abanico. Retire las dos porciones musculares rojas visibles desde cada lóbulo con tijeras de punta fina y colocar en un vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1.
      Nota: del músculo cuádriceps aparecen como dos lóbulos con una tira de músculo rojo situado cerca del borde lateral de cada lóbulo.
   5. Cortar la piel que recubre el tendón de Aquiles con punta fina tijera y la cáscara de la piel hacia el ratón. Cortar el tendón de Aquiles expuesto y pelar el músculo hacia el cuerpo del ratón.
   6. Cortar el tendón en los cóndilos lateral y medial del fémur con tijeras de punta fina para liberar a los gemelos y colocar el gemelo unido a sus tendones en PBS frío.
   7. Da la vuelta al gastrocnemio una y pelar el músculo sóleo y colocarlos en el vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1. Fan abrir el gastrocnemio. Retire los tres porciones visuales rojos musculares (dos tiras rojas laterales y uno medial superficiales) con tijeras de punta finas y les traslado al vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1.
3. Retire otra ~ 75-100 mg de músculo rojo de la otra pata del ratón (como se describe en el paso 2.2) y ponerlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel y tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, 1 EDTA mM, NaCl 150 mM, 1% de dodecilsulfato de sodio, 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% de polioxietileno (9) nonilfeniléter, ramificada. Inmediatamente FLASH-congelar esta segunda muestra en nitrógeno líquido para su uso posterior en Western Blot (véase el paso 6.1).
4. Coloque una superficie de plástico pre-enfriado, plana sobre hielo en un gran cubo. Vierta una gota de IBM1 sobre la superficie de plástico y utilizar pinzas para colocar toda la músculo rojo seccionado (paso 2.2.4 y 2.2.7) en IBM1 gotas. Picar el tejido muscular durante 2 minutos con 3 cuchillas de afeitar borde individuales cambiando las maquinillas de afeitar cada 40 seg.
5. Transferir el tejido picado a un nuevo vaso de precipitados con 5 ml de IBM1 fresco mediante la celebración de la superficie de plástico sobre el the vaso de precipitados y raspando el músculo en el vaso de precipitados con una hoja de afeitar. Tome esta solución y drenarla a través de un filtro de células 100 micras colocado sobre un tubo cónico de 50 ml.
6. Seque el tejido con un limpiador tarea delicada y luego transferirlo a 5 ml de la solución de tripsina 0,05%. Utilice pinzas para retirar el tejido del limpiaparabrisas tarea.
7. Incubar el tejido muscular en hielo durante 30 min en solución de tripsina 0,05%.
8. Haga girar los 15 ml tubo cónico de mezcla que contiene tripsina / muscular a 200 xg durante 3 min a 4 ° C.
9. Verter el sobrenadante de tripsina en un contenedor de residuos y resuspender el precipitado con 3 ml de hielo frío IBM1. Transferir el tejido a un tubo de vidrio de 45 ml homogeneizador. Enjuague los 15 ml tubo cónico con otro 1,5 ml IBM1 reunir cualquier muestra restante y agregar esto a el tubo homogeneizador de vidrio.
10. Coloque el tubo homogeneizador de vidrio en un lleno hasta la mitad vaso o recipiente de plástico con hielo por lo que el homogeneizador de vidrio se mueve mínimamente dentro del vaso de precipitados.
11. Homogeneizar la mezcla de tejidos / IMB1 con las maja PTFE unido a un motor impulsado homogeneizador de tejidos con 10 pases a 80 rpm. Sostenga la parte inferior de cada pasada por unos 2 seg.
12. Transferir el homogeneizado de tejido a un nuevo tubo cónico de 15 ml y enjuagar el tubo homogeneizador de vidrio con 6,5 ml de IBM1. Verter la IBM1 en el tubo cónico de 15 ml que contenía homogeneizado de tejido.
13. Haga girar el tubo cónico de 15 ml a 700 g durante 10 min a 4 ° C. Vierta suavemente el sobrenadante en un tubo de centrífuga de alta resistencia vidrio y desechar el sedimento.
14. Girar el sobrenadante de la etapa anterior a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C.
15. Eliminar el sobrenadante IBM1 y volver a suspender el sedimento añadiendo lentamente 500 l de IBM2. Corte el extremo de una punta de pipeta y homogeneizar suavemente el pellet en IBM2 con mezcla y agitación movimientos. Añadir otros 4,5 ml de IBM2 a la mezcla después el sedimento está totalmente suspendida.
    Nota: Evite la trituración excesiva mientras que romper pedazos de pellets de mayor tamaño como tsu puede dañar las membranas mitocondriales.
16. Haga girar el homogeneizado / tejido IBM2 a 8.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Este paso puede repetirse en un tubo de centrífuga de alta resistencia limpia para la cuantificación de proteínas más precisa de mitocondrias aisladas en el paso 4 ya BSA residual puede contribuir al contenido total de proteínas.
17. Eliminar el sobrenadante y suavemente, pero totalmente volver a suspender el sedimento añadiendo dos incrementos de 25 l de IBM2 con una punta de pipeta con su punto de corte. Revuelva suavemente y mezclar la pastilla después de cada adición de 25 l de IBM2. Coloca esta población mitocondrial en hielo.

3. La homogeneización del Plenario del tejido lisado (Tiempo: ~ 45 min; se puede hacer durante el paso 7)

1. Retire el músculo de que se colocó en el nitrógeno líquido desde el paso 2.3 y se incuba a temperatura ambiente hasta que esté completamente descongelado.
2. Picar el tejido de ~ 30 seg en el hielo con unas tijeras de punta fina.
3. Añadir dos cucharadas de 100 l de Zircoperlas de óxido nio al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca desde el paso 3.2 que contiene el tejido picado. Homogeneizar los tejidos en un homogeneizador de tejidos molino de bolas utilizando dos o tres ciclos de 5 min con un ajuste de velocidad de 4-6 (posición media).
4. Gira la mezcla de la etapa 3.3 a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante usando una punta de pipeta de 1.000 l después del giro y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Deseche la pastilla y colocar el sobrenadante en hielo.

4. Determinación de proteínas (Tiempo: ~ 30 min)

1. Determinar la concentración de proteínas de todo el lisado de tejido (paso 3.4) y de la mitocondrial (paso 2,17) utilizando el kit de ensayo de proteína BCA de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

5. Las mitocondrias integridad de la membrana; Citrato sintasa (CS) Actividad (Tiempo: ~ 15 min)

1. Haga dos separadas 1: 20 diluciones de la población mitocondrial en agua de alta pureza. Añadir0,1% de Triton X-100 a una muestra y sonicar que en un ajuste bajo (765 Watts, amplitud de 2). Deje el otro dilución en el hielo. Devuelva la muestra en hielo después de la sonicación.
2. Realizar un ensayo de la citrato sintasa tanto con la no sonicado y se sonicó diluciones mitocondriales usando un ensayo espectrofotométrico como se describió previamente ^11,12.
3. Determinar el porcentaje de membranas de mitocondrias intactas mediante el uso de las siguientes ecuaciones:
   (Actividad CS no sonicado ÷ sonicada CS actividad) * 100

100- N (porcentaje alcanzado desde arriba)

6. Las mitocondrias Calidad de aislamiento; Western Blot (Hora: De acuerdo con el Protocolo de Laboratorio)

1. Realizar transferencia de Western en el lisado de tejido y mitocondrias aisladas como se ha descrito previamente ^12.
   Nota: Utilice los anticuerpos primarios para GAPDH (1: 1000 dilución en el 5% de BSA / TBS-T) y COXIV (1: 1000 dilución en el 5% sin grasaleche / TBS-T) seguido de anti-cabra y conejo anticuerpos secundarios, respectivamente (1: 10.000).

7. respirometría Ensayo Run (Tiempo: ~ 90 min)

1. Realizar ensayos respirométricos deseados utilizando la tecnología de medición de consumo basado en una microplaca _de O 2 como se ha descrito anteriormente (véase el artículo de compañía y Rogers et al ^8).
2. Determinar la relación de control respiratorio (RCR) dividiendo Estado 3 por 4o Estado (RCR) o dividir 3u Estado por Estado 4o. Utilice el punto medio (promedio), o el más alto (estado 3) y tarifas más bajas (4o Estado) a partir de los restos de punto a punto en la determinación de RCR.

Resultados

La actividad de la citrato sintasa sirve como medida para la integridad de la membrana desde la citrato sintasa se ​​encuentra en la membrana mitocondrial interna, y por lo tanto no debe estar presente en las suspensiones de las mitocondrias con membranas intactas. La figura 1 representa la actividad de la citrato sintasa en muestras no se sonicaron mitocondriales en comparación con sonicado muestras de la misma aislamiento. Sonicando los resultados mitocondrias en un aumento estadísticamente sign...

Discusión

Los métodos presentados en este documento proporcionan una descripción detallada de un procedimiento de aislamiento mitocondrial a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento de aislamiento es capaz de producir de alto funcionamiento, las mitocondrias pura (~ 450 g) como lo demuestra O ₂ tasas de consumo, valores RCR, máxima actividad de la citrato sintasa y de expresión de proteínas de inmunotransferencia. Es importante destacar que las mitocondr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20 °C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8 °C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20 °C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature