Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Résumé

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Résumé

Le dysfonctionnement des mitochondries des muscles squelettiques jouent un rôle dans le métabolisme est modifié observée avec le vieillissement, l'obésité et le diabète de type II. Des dosages de préparations mitochondriales respirométriques mitochondries isolées permettent l'évaluation de la fonction mitochondriale, ainsi que la détermination du mécanisme (s) d'action des médicaments et des protéines qui modulent le métabolisme. Procédures d'isolement actuelles exigent souvent de grandes quantités de tissu pour donner mitochondries de haute qualité nécessaires pour les essais respirométriques. Les méthodes présentées ici décrivent comment haute qualité mitochondries purifiées (~ 450 ug) peut être isolé à partir de quantités minimes (~ 75-100 mg) de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des mesures respiratoires à haut débit. Nous avons déterminé que notre méthode d'isolement donne 92,5 ± 2,0% mitochondries intactes en mesurant l'activité de la citrate synthase spectrophotométrie. En outre, l'analyse Western blot dans les mitochondries isolées abouti à l'expression faibles de l'cytosoprotéines lic, GAPDH, et l'expression robuste de la protéine mitochondriale, COXIV. L'absence d'une bande de GAPDH de premier plan dans les mitochondries isolées est indicatif de la contamination à partir de sources peu de non-mitochondriales au cours de la procédure d'isolement. Plus important encore, la mesure de O ₂ le taux de consommation sur la base d'une technologie de micro-plaque et la détermination du rapport de contrôle respiratoire (RCR) pour des essais couplés respirométriques montre très couplés (RCR;> 6 pour tous les essais) et les mitochondries fonctionnelles. En conclusion, l'addition d'une étape de hachage séparé et réduisant de manière significative entraîné par un moteur vitesse d'homogénéisation d'un procédé précédemment rapporté a permis l'isolement de haute qualité et des mitochondries purifiées à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris qui en résulte dans les mitochondries fortement couplés qui respirent avec une haute fonction lors de microplaques base des essais de respirometirc.

Introduction

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocole

Les études animales ont été effectuées en vertu d'un protocole approuvé par le Institutional Animal Care et utilisent Comité à Virginia Polytechnic Institute et State University.

1. Configuration (Durée: ~ 45 min)

1. Décongeler les magasins de 0,25% de trypsine, Isolation tampon pour mitochondries (IBM) 1 et IBM2 dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Rincer la verrerie et instruments de dissection éthanol à 70% puis à l'eau de haute pureté.
3. Préparer la solution de trypsine à 0,05% de 0,25% de trypsine de stock en diluant 1 partie trypsine en 4 parties IBM1.
4. Mélanger la protéase et inhibiteur de phosphatase cocktail avec un tampon de lyse cellulaire (1: 100 du rapport) dans un tube de 1,5 ml avec bouchon à vis.
5. Aliquotes de 5 ml (5 ml / souris) de 0,05% de trypsine dans un tube en plastique de 15 ml.
6. Réglez motorisé homogénéisateur de tissu à 80 RPM.

2. Isolement du muscle squelettique mitochondries (Durée: ~ 90 min)

1. Euthanasier une souris _par le CO 2 inhalation, suivie par dislocation cervicale.
2. Retirer muscle rouge du quadriceps et le muscle jumeau, qui comprend le soléaire (~ 75-100 mg au total) comme décrit dans les étapes suivantes:
   1. Peler la peau vers la souris.
   2. Retirer le coussinet adipeux sur le point d'origine quadriceps. Couper le tendon du quadriceps qui est attaché à la rotule avec des ciseaux fins à bout.
      Remarque: le quadriceps est identifié par sa position anatomique sur la partie antérieure du fémur proximal.
   3. Lentement couper l'aponévrose entre l'os et les quadriceps, tout en évitant l'artère fémorale, pour libérer les quadriceps de l'os. Couper le tendon avec des ciseaux fins à bout au point d'origine sur le fémur pour libérer le muscle quadriceps et placer le muscle quadriceps en réfrigérés PBS.
   4. Retirer le tissu adipeux visible sur les quadriceps avec des ciseaux. Retourner les quadriceps plus de sorte que la partie du muscle qui a été recouvrant le fémur est confronté à up. Ouvrez le muscle quadriceps avec une pince dans un mouvement de Fanning. Retirez les deux parties visibles musculaires rouges de chaque lobe avec des ciseaux pointe fine et les placer dans un bécher contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés.
      Remarque: muscle quadriceps apparaissent comme deux lobes avec une bande de muscle rouge situé près du bord latéral de chaque lobe.
   5. Couper la peau recouvrant le tendon d'Achille avec de fines pointe des ciseaux et peler la peau vers la souris. Couper le tendon d'Achille exposé et peler le muscle vers le corps de la souris.
   6. Couper le tendon à la condyles latéral et médial du fémur avec des ciseaux pointe fine pour libérer les jumeaux et placer les jumeaux attachée à ses tendons en réfrigérés PBS.
   7. Retournez le jumeau plus et de décoller le muscle soléaire et le placer dans le bol contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés. Fan ouvrir le jumeau. Retirez les trois parties visuelles rouges musculaires (deux bandes rouges latérales et médiale superficielles) avec fine embout ciseauxs et de les transférer dans le bécher contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés.
3. Retirer autre ~ 75 à 100 mg de muscle rouge à partir de l'autre branche de la souris (comme décrit à l'étape 2.2) et la placer dans un tube de 1,5 ml avec une protéase et un inhibiteur de la phosphatase cocktail et un tampon de lyse cellulaire (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de dodécylsulfate de sodium, 0,5% de désoxycholate de sodium, 1% de polyoxyéthylène (9) nonylphényléther, ramifiée. Immédiatement Flash geler ce deuxième échantillon dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure dans le Western blot (voir l'étape 6.1).
4. Placez une surface en plastique pré-réfrigérés, à plat sur la glace dans un grand seau. Versez une goutte d'IBM1 sur la surface en plastique et utiliser des pinces pour placer la totalité du muscle rouge coupe (étape 2.2.4 et 2.2.7) dans IBM1 gouttelettes. Émincer le tissu musculaire pendant 2 minutes en utilisant 3 simples lames de rasoir bord en changeant tous les rasoirs 40 sec.
5. Transférer le tissu haché à un nouveau bécher avec 5 ml de IBM1 frais en maintenant la surface de plastique sur ee bêcher et racler le muscle dans le bécher avec une lame de rasoir. Prenez cette solution et les égoutter dans une passoire cellulaire 100 um placé sur un tube conique de 50 ml.
6. Tamponnez le tissu avec une tâche délicate glace, puis le transférer dans 5 ml de la solution de trypsine à 0,05%. Utilisez une pince à épiler pour enlever le tissu de la tâche essuie-glace.
7. Incuber le tissu musculaire sur de la glace pendant 30 min dans une solution de trypsine à 0,05%.
8. Faites tourner les 15 ml tube conique mélange contenant de la trypsine / musculaire à 200 g pendant 3 min à 4 ° C.
9. Verser le surnageant de la trypsine dans un conteneur de déchets et resuspendre le culot avec 3 ml de glace IBM1 froid. Transférer le tissu dans un tube de verre de 45 homogénéisateur ml. Rincer les 15 ml tube conique avec un autre 1,5 ml IBM1 de rassembler tout échantillon restant et ajouter ce au tube d'homogénéisation de verre.
10. Placer le tube de homogénéiseur en verre dans un bécher ou récipient en plastique à mi-chemin rempli de glace afin d'homogénéisation de verre se déplace peu dans le bécher.
11. Homogénéiser le mélange tissu / IMB1 avec le pilon en PTFE attachés à une homogénéisation de tissu motorisé avec 10 passes à 80 tours par minute. Maintenir le fond de chaque passage de ~ 2 sec.
12. Transférer le homogénat de tissu dans un nouveau tube de 15 ml conique et le tube de rinçage homogénéisateur en verre avec 6,5 ml de IBM1. Verser le IBM1 dans le tube conique contenant 15 ml de l'homogénat tissulaire.
13. Faites tourner la 15 ml tube conique à 700 g pendant 10 min à 4 ° C. Verser doucement le surnageant dans un haute résistance tube de centrifugeuse en verre et jeter le culot.
14. Spin le surnageant de l'étape précédente à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C.
15. Eliminer le surnageant IBM1 et remettre en suspension le culot par addition lente de 500 ul de IBM2. Coupez l'extrémité d'une pointe de pipette et homogénéiser doucement le culot dans IBM2 avec mélangeant et en agitant des motions. Ajouter encore 4,5 ml de IBM2 au mélange après que le culot est entièrement suspendu.
    Remarque: Evitez de trituration excessive tout en brisant les gros morceaux de boulettes que tson peut endommager les membranes mitochondriales.
16. Spin le broyat / tissu IBM2 à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque: Cette étape peut être répétée dans un tube de centrifugeuse à haute résistance propre pour la quantification plus précise de la protéine de mitochondries isolées à l'étape 4 depuis BSA résiduelle peut contribuer à teneur totale en protéines.
17. Retirer le surnageant et doucement, mais complètement re-suspendre le culot en ajoutant deux paliers de 25 pi de IBM2 avec une pointe de pipette avec son point coupé. Incorporer délicatement le culot et mélanger après chaque addition de 25 pl de IBM2. Placez ce stock mitochondrial sur la glace.

3. Homogénéisation de tout le tissu Lysate (Durée: ~ 45 min; Peut être effectué pendant l'étape 7)

1. Enlever le muscle de celle a été placé dans de l'azote liquide provenant de l'étape 2.3 et incuber à température ambiante jusqu'à ce que complètement décongelé.
2. Émincer le tissu pour ~ 30 secondes sur la glace avec des ciseaux fins à bout.
3. Ajouter deux cuillères 100 pi de Zirconium oxyde Perles au tube de 1,5 ml avec bouchon à vis de l'étape 3.2 qui contient le tissu haché. Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de tissu à l'aide broyeur à billes de deux à trois cycles de 5 min à une vitesse de 4-6 (réglage moyen).
4. Spin mélange de l'étape 3.3 à 12000 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette de 1000 pi après le spin et le transfert dans un tube de 1,5 ml. Jeter le culot et placer le surnageant sur de la glace.

4. Détermination des protéines (Durée: ~ 30 min)

1. Déterminer la concentration en protéine de l'ensemble du lysat de tissu (étape 3.4) et clips mitochondrial (étape 2.17) en utilisant le kit de dosage de protéine BCA de selon les spécifications du fabricant.

5. Les mitochondries Membrane intégrité; Citrate synthase (CS) Activité (Durée: ~ 15 min)

1. Faire deux séparées 1: 20 dilutions du stock mitochondrial dans l'eau de haute pureté. Ajouter0,1% de Triton X-100 à un échantillon et soniquer il à un niveau faible (765 Watts, amplitude de 2). Laissez l'autre dilution sur la glace. Remettre l'échantillon à la glace après sonication.
2. Effectuez un test de la citrate synthase à la fois la non-traité par ultrasons et soniqué dilutions mitochondriales en utilisant un dosage spectrophotométrique comme décrit précédemment ^11,12.
3. Déterminer le pourcentage de membranes intactes mitochondries en utilisant les équations suivantes:
   (CS activité non-traitées aux ultrasons ÷ soniqué activité CS) * 100

100- N (pour cent atteint à partir de ci-dessus)

6. Les mitochondries qualité d'isolation; Western Blot (Durée: Conformément au protocole Lab)

1. Effectuer Western blot sur ​​l'ensemble du lysat de tissu et de mitochondries isolées comme décrit précédemment ^12.
   Remarque: Utilisez anticorps primaires pour GAPDH (1: 1000 dilution dans 5% de BSA / TBS-T) et COXIV (1: 1000 dilution dans 5% non graslait / TBS-T), suivie par anti-chèvre, et des anticorps secondaires de lapin, respectivement (1: 10,000).

7. respirométrique série de test (Durée: ~ 90 min)

1. Effectuer des dosages respirométriques souhaités en utilisant la technologie de mesure de microplaques basé O ₂ de consommation comme décrit précédemment (voir l'article de compagnon et Rogers et al ^8).
2. Déterminer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant par 3 État État 4o (RCR) ou en divisant 3U d'État par État 4o. Utilisez soit le milieu (moyenne) le point, ou le plus haut (Etat 3) et les plus faibles (de taux 4o de l'Etat) à partir des traces de point à point au moment de déterminer RCR.

Résultats

Activité de la citrate synthase sert de mesure pour l'intégrité de la membrane depuis la citrate synthase est situé dans la membrane mitochondriale interne, et par conséquent ne devrait pas être présent dans les suspensions de mitochondries avec des membranes intactes. La figure 1 représente l'activité de la citrate synthase dans des échantillons non soumis à une sonication mitochondriales par rapport à soniqué des échantillons provenant de la même isolation. Soni...

Discussion

Les méthodes présentées ici fournissent une description détaillée de la procédure d'isolement des mitochondries à partir de quantités minimes (~ 75 à 100 mg) de muscle squelettique de souris. Cette procédure d'isolement est capable de produire de haute fonctionnement, les mitochondries pur (~ 450 ug) comme en témoigne O ₂ taux de consommation, les valeurs RCR, l'activité de la citrate synthase maximale et l'expression de protéines à partir immunoblotting. Fait important, les mito...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20 °C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8 °C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20 °C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature