בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Summary

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Abstract

מיטוכונדריה שריר שלד מתפקד לשחק תפקיד בחילוף חומרים שינו נצפו עם הזדקנות, השמנת יתר וסוכרת סוג II. מבחני respirometric מיטוכונדריאלי מהכנות המיטוכונדריה מבודדות מאפשרים ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה, כמו גם קביעת המנגנון (ים) של פעולה של תרופות וחלבונים המווסתים את חילוף חומרים. נהלי בידוד נוכחיים לעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של רקמה להניב מיטוכונדריה באיכות גבוהה הנדרשת למבחני respirometric. השיטות שהוצגו במסמך זה מתארים כיצד באיכות גבוהה מטוהרת מיטוכונדריה (~ 450 מיקרוגרם) יכול להיות מבודדים מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ"ג) של שריר שלד עכבר לשימוש במדידות בדרכי הנשימה תפוקה גבוהה. אנחנו קבענו כי שיטת הבידוד שלנו מניבה 92.5 ± 2.0% המיטוכונדריה שלמה על ידי מדידת פעילות synthase ציטראט spectrophotometrically. בנוסף, ניתוח כתם מערבי במיטוכונדריה המבודדת הביא לביטוי הקלוש של cytosoחלבון Lic, GAPDH, והביטוי חזק של חלבון המיטוכונדריה, COXIV. היעדר להקת GAPDH בולט במיטוכונדריה המבודדת מעיד על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד. והכי חשוב, מדידת שיעור O ₂ הצריכה עם טכנולוגיה מבוססת מיקרו-צלחת וקביעת יחס הנשימה השליטה (RCR) למבחני מצמידים respirometric תערוכות בשילוב מאוד (RCR;> 6 לכל מבחני) ומיטוכונדריה הפונקציונלית. לסיכום, התוספת של צעד זהיר, נפרד והפחתת מהירות הומוגניזציה מנוע מונע משיטה שדווחה בעבר באופן משמעותי אפשרה את הבידוד של איכות גבוהה ומיטוכונדריה המטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר, כי תוצאות במיטוכונדריה בשילוב מאוד כי לנשום עם פונקציה גבוהה במהלך מבחני respirometirc microplate מבוססים.

Introduction

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש בוירג'יניה מכון הפוליטכני ואוניברסיטת מדינה.

1. הגדרות (זמן: ~ 45 דקות)

1. חנויות הפשרה קפוא של 0.25% טריפסין, בידוד מאגר למיטוכונדריה (IBM) 1 וIBM2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
2. יש לשטוף את הזכוכית ומכשירים לנתח באתנול 70% ואחריו מים טוהר גבוהים.
3. הכן 0.05% פתרון טריפסין 0.25% ממניות טריפסין על ידי דילול טריפסין חלק 1 ב 4 חלקים IBM1.
4. מערבבים קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase עם חיץ תמוגה תא (1: 100 יחס) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge עם כובע בורג.
5. 5 מיליליטר aliquot (5 מיליליטר / עכבר) של טריפסין 0.05% לצינור פלסטיק 15 מיליליטר.
6. מנוע הגדר מונע homogenizer רקמות 80 סל"ד.

2. בידוד של שרירי שלד מיטוכונדריה (זמן: ~ 90 דקות)

1. להרדים עכבר על ידי CO ₂ , ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. הסר שריר אדום מהארבעה הראשי והגסטרוקנמיוס השריר, הכולל את soleus (~ 75-100 כולל מ"ג) כפי שמתואר בשלבים הבאים:
   1. לקלף את העור לקראת העכבר.
   2. הסר את כרית השומן על נקודת המוצא הארבע ראשי. חותך את גיד שריר הארבעה הראשי, שמצורף לפיקת הברך עם מספריים קנס היטה.
      הערה: ארבע ראשי מזוהה על ידי העמדה אנטומית שלה בחלק הקדמי של עצם הירך הפרוקסימלית.
   3. לאט לגזור אָלָל בין העצם והשריר הארבע ראשי, תוך הימנעות עורק הירך, כדי לשחרר את השריר הארבעה הראשיים מהעצם. חותך את הגיד במספריים קנס היטה בנקודת המוצא בירך כדי לשחרר את השרירים הארבע ראשי ולמקם את השריר הארבע ראשי בPBS המקורר.
   4. הסר רקמת שומן נראית לעין על פני הארבע ראשי במספריים. הפוך את השריר הארבעה הראשיים על כך שהחלק מהשריר שמעל עצם הירך פונה uעמ '. פתח את השריר הארבע ראשי עם מלקחיים בתנועת פנינג. הסר את שני חלקי השריר אדומים גלויים מכל אונה עם מספריים עדינים היטה ומקום בכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר.
      הערה: שריר ארבע ראשי מופיע כשתי אונות עם פס של שריר אדום ממוקם בסמוך לקצה הלטרלי של כל אונה.
   5. חותך את העור שמעל גיד אכילס עם מספריים עדינים הטה ולקלף את העור כלפי העכבר. חותך את גיד אכילס החשוף ולקלף את השריר לכיוון הגוף של העכבר.
   6. חותך את הגיד בcondyles הרוחב והמדיאלי של עצם הירך במספריים קנס היטה לשחרר הגסטרוקנמיוס ולמקם את הגסטרוקנמיוס מצורף לגידים שלה בPBS הצונן.
   7. הפוך את הגסטרוקנמיוס שוב ולקלף את שריר הסוליה והמקום לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר. מאוורר לפתוח הגסטרוקנמיוס. הסר את שלושת חלקים חזותיים אדומים שריר (שתי רצועות אדומות לרוחב והמדיאלי אחד שטחית) עם מספריים קנס היטהים ולהעביר אותם לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר.
3. הסר ~ 75-100 מ"ג אחר של שריר אדום מהרגל השנייה של העכבר (כמתואר בשלב 2.2) ומקום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase וחיץ תמוגה תא (50 מ"מ טריס-HCL, 1 mM EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% סולפט dodecyl נתרן, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% Polyoxyethylene (9) nonylphenylether, מסועף. מייד Flash-להקפיא מדגם השני בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר במערב סופג (ראה שלב 6.1).
4. מניחים משטח טרום צונן, שטוח פלסטיק על קרח בדלי גדול. יוצקים ירידה של IBM1 על גבי משטח הפלסטיק ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את כל השרירים האדומים מחולקים (שלב 2.2.4 ו2.2.7) בטיפת IBM1. לרכך את רקמת השריר למשך 2 דקות באמצעות 3 סכיני גילוח קצה אחד על ידי סכיני גילוח משתנים כל שנייה 40.
5. העברת הרקמה הטחון לכוס חדשה עם 5 מיליליטר של IBM1 הטרי על ידי לחיצה על משטח הפלסטיק על הכוס דואר ומגרד את השריר לתוך הכוס עם סכין גילוח. קח את הפתרון הזה ולנקז אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ממוקמת על צינור חרוטי 50 מיליליטר.
6. למחוק את הרקמה עם מגב משימה עדין ולאחר מכן להעביר אותו לתוך 5 מיליליטר של פתרון טריפסין 0.05%. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את הרקמה ממגב המשימה.
7. דגירה רקמת השריר על קרח למשך 30 דקות ב0.05% פתרון טריפסין.
8. ספין 15 מיליליטר תערובת טריפסין / שרירים המכילים צינור חרוטי ב XG 200 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס.
9. יוצקים את supernatant טריפסין לתוך מיכל פסולת וresuspend גלולה עם 3 מיליליטר של קרח IBM1 הקר. העברת הרקמה לצינור homogenizer זכוכית 45 מיליליטר. יש לשטוף את צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 1.5 מיליליטר IBM1 אחר כדי לאסוף כל מדגם שנותר ולהוסיף את זה לצינור homogenizer הזכוכית.
10. מניחים את צינור homogenizer הזכוכית לאמצע מילא מיכל כוס או פלסטיק עם קרח כדי homogenizer הזכוכית נע מינימאלי בתוך הכוס.
11. Homogenize תערובת הרקמה / IMB1 עם העלי PTFE המצורף לhomogenizer רקמות מנוע מונע עם 10 מסירות ב 80 סל"ד. החזק את החלק התחתון של כל מעבר ל~ 2 שניות.
12. מעבירים את homogenate הרקמה לצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש ולשטוף את צינור homogenizer הזכוכית עם 6.5 מיליליטר של IBM1. יוצקים את IBM1 לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל homogenate רקמות.
13. ספין צינור חרוטי 15 מיליליטר ב 700 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעדינות יוצק את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חוזק גבוה זכוכית וזורקים את הכדור.
14. ספין supernatant מהצעד מעל ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
15. הסר את supernatant IBM1 מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת 500 μl של IBM2 לאט. לחתוך את הקצה של קצה פיפטה ועדינות homogenize גלולה בIBM2 עם ערבוב ובחישת תנועות. להוסיף עוד 4.5 מיליליטר של IBM2 לתערובת לאחר גלולה מושעה באופן מלא.
    הערה: הימנע מטחינה דקה מופרזת תוך שבירת חתיכות גלולה גדולות כמו tשלו עלול לגרום נזק לקרומי המיטוכונדריה.
16. ספין homogenate / רקמת IBM2 ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלב זה ניתן לחזור בצינור צנטריפוגות חוזק גבוה נקי לכימות חלבון מדויקת יותר של מיטוכונדריה המבודדת בשלב 4 מאז BSA שייר עשוי לתרום לכלל תכולת חלבון.
17. הסר את supernatant ועדינות, אבל לגמרי מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת שני 25 מרווחי μl של IBM2 עם קצה פיפטה עם הנקודה שלו מנותק. בעדינות מערבבים ולערבב את הכדור לאחר כל הוספה של 25 μl של IBM2. הנח מניית המיטוכונדריה זה על קרח.

3. Homogenization של כל הפריטים רקמות lysate (זמן: ~ 45 דקות, אפשר לעשות במהלך שלב 7)

1. הסר את השריר שמהונח בחנקן הנוזלי מצעד 2.3 ודגירה בטמפרטורת חדר עד שהפשיר באופן מלא.
2. לרכך את הרקמה ל~ 30 שניות על קרח עם מספריים קנס היטה.
3. להוסיף שני 100 סקופים μl של Zirconium חרוזים אוקסיד לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם פקק הברגה מהשלב 3.2 שמכיל רקמה הטחון. Homogenize הרקמות בhomogenizer רקמות טחנת חרוז באמצעות 02:58 5 מחזורי דקות בהגדרת מהירות של 4-6 (הגדרה בינונית).
4. ספין את התערובת מצעד 3.3 ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl לאחר הספין וההעברה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. זורק את הכדור ומניח את supernatant על קרח.

4. קביעת חלבון (זמן: ~ 30 דקות)

1. קבע את ריכוז החלבון של כל lysate הרקמות (שלב 3.4) ומניית המיטוכונדריה (שלב 2.17) באמצעות ערכת assay חלבון BCA על פי המפרט של היצרן.

5. המיטוכונדריה ממברנה יושרה; ציטראט synthase פעילות (CS) (זמן: ~ 15 דקות)

1. לעשות שני 1 נפרד: 20 דילולים של מניית המיטוכונדריה במים טוהר גבוהים. לְהוֹסִיף0.1% מטריטון 100-X למדגם אחד וsonicate אותו בעצמה נמוכה (765 ואט, המשרעת של 2). השאר את הדילול האחר על קרח. להחזיר את המדגם לקרח לאחר sonication.
2. בצע assay synthase ציטראט עם שני שאינו sonicated וsonicated דילולים המיטוכונדריה באמצעות assay spectrophotometric כפי שתואר קודם לכן ^11,12.
3. לקבוע את אחוז קרומי המיטוכונדריה שלמים באמצעות המשוואות הבאות:
   (פעילות CS ללא sonicated ÷ sonicated CS פעילות) * 100

100 N (אחוזים הושגו מלמעלה)

6. איכות בידוד המיטוכונדריה; מערבי סופג (זמן: על פי פרוטוקול מעבדה)

1. לבצע מערבי סופג בכל lysate הרקמה ומיטוכונדריה המבודדת כפי שתואר לעיל ^12.
   הערה: נוגדנים ראשוניים השתמש לGAPDH (1: 1,000 דילול ב 5% BSA / TBS-T) וCOXIV (1: 1,000 דילול ב 5% דל שומןחלב / TBS-T) ואחריו האנטי-עז, ונוגדנים משני ארנב, בהתאמה (1: 10,000).

7. Respirometric Assay הפעלה (זמן: ~ 90 דקות)

1. לבצע מבחני respirometric רצויים באמצעות טכנולוגית microplate מבוססת O ₂ צריכת מדידה כפי שתואר לעיל (ראה מאמר נלווה ורוג'רס ואח ^'8).
2. לקבוע את יחס שליטה בדרכי הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4O (RCR) או חלוקת 3U מדינה על ידי 4O המדינה. השתמש באחת נקודת האמצע (ממוצעת), או (3 המדינה) הגבוהה ביותר ומחירים נמוכים (4O מדינה) מעקבות נקודה לנקודה בעת קביעת RCR.

תוצאות

פעילות synthase ציטראט משמשת כמדד לשלמות קרום מאז synthase ציטראט ממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימי, ובכך לא צריך להיות נוכח במתלים של המיטוכונדריה עם קרומים. איור 1 מייצג פעילות synthase ציטראט בדגימות של המיטוכונדריה-sonicated הלא לעומת sonicated דגימות מאותו הבידוד. Sonicating תוצ?...

Discussion

השיטות שהוצגו במסמך זה מספקים תיאור מפורט של הליך בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ"ג) של שריר שלד עכבר. הליך בידוד זה מסוגל להניב בתפקוד גבוה, מיטוכונדריה הטהורה (~ 450 מיקרוגרם) כפי שמעיד O ₂ שיעורי הצריכה, ערכי RCR, פעילות synthase ציטראט מקסימלי וביטוי ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20 °C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8 °C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20 °C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature