Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Resumen

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Resumen

La investigación de la organogénesis en el útero es un proceso técnicamente difícil en los mamíferos placentarios, debido a la inaccesibilidad de los reactivos a los embriones que se desarrollan dentro del útero. Un método de cultivo de gotas recién desarrollado ex vivo en posición vertical ofrece una alternativa atractiva a los estudios realizados en el útero. El cultivo ex vivo gotita proporciona la capacidad de examinar y manipular las interacciones celulares y diversas vías de señalización a través del uso de diversos bloqueo y compuestos activadores; Además, los efectos de diversos reactivos farmacológicos sobre el desarrollo de órganos específicos pueden ser estudiados sin efectos secundarios no deseados de la administración de fármacos sistémico en el útero. En comparación con otros sistemas in vitro, el cultivo de gota no sólo permite la capacidad de estudio de tres dimensiones morfogénesis y las interacciones célula-célula, que no puede ser reproducida en líneas celulares de mamíferos, sino que también requiere significativamente menos reagents que otros ex vivo e in vitro. protocolos Este trabajo demuestra la disección del ratón correcto fetal órgano y técnicas de cultivo de gotita en posición vertical, seguido por inmunofluorescencia órgano completo para demostrar la eficacia del método. El método de cultivo gotita ex vivo permite la formación de la arquitectura de órganos comparable a lo que se observa in vivo y puede ser utilizado para estudiar los procesos de otro modo difíciles de estudio debido a la letalidad embrionaria en modelos in vivo. Como un sistema de solicitud de modelo, un inhibidor de molécula pequeña se utilizará para investigar el papel de la vascularización en la morfogénesis testicular. Este método de cultivo gotita ex vivo es ampliable a otros sistemas de órganos fetales, como el de pulmón y posiblemente otros, aunque cada órgano debe ser ampliamente estudiados para determinar las modificaciones órgano-específicas en el protocolo. Este sistema de cultivo de órganos ofrece flexibilidad en la experimentación con los órganos fetales, y resulta obtained usando esta técnica ayudará a los investigadores a obtener conocimientos sobre el desarrollo fetal.

Introducción

La regeneración de órganos in vivo en los seres humanos es muy limitada; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos, el desarrollo de tejidos y órganos a partir de células individuales donados por un anfitrión, se está convirtiendo en una terapia potencial atractivo para el reemplazo de órganos. Sin embargo, para que esta estrategia terapéutica para tener éxito, los factores y las interacciones celulares implicados en la morfogénesis del órgano deben ser estudiados a fondo y bien entendidos. Debido a la incapacidad para estudiar el desarrollo de los órganos específicos con los enfoques tradicionales, los investigadores han recurrido a embrión conjunto alternativo o cultivos de órganos enteros. Kalaskar et al. ¹ han demostrado que la cultura embriogénesis ex vivo toda produce resultados comparables (en el 58% de los embriones cultivados) en el desarrollo del útero, lo que sugiere que los métodos de cultivo ex vivo son una alternativa viable para los estudios de organogénesis.

Un sistema de cultivo de órganos individualizado, como este ex vivo droPlet sistema de cultivo, permite el análisis de órganos conjunto independiente de los efectos sistémicos, al tiempo que permite la manipulación de una vía de señalización específica o interacciones celulares a través de la adición de reactivos farmacológicos o anticuerpos. Tradicionalmente, el estudio de desarrollo de los órganos del feto se ha limitado a las tecnologías transgénicas y knockout de ratón, además de reactivos farmacológicos entregados por vía materna. Sin embargo, hay cuestiones técnicas que implican estas técnicas y tratamientos in vivo; la mayoría de las preocupaciones giran en torno a los efectos de influir en varios órganos simultáneamente que a menudo resulta en letalidad embrionaria. Una preocupación adicional de estudios de manipulación de desarrollo fetal farmacológicamente es el efecto materno de los fármacos sobre el desarrollo embrionario in utero (por ejemplo, el metabolismo maternal de la droga antes de que alcance el embrión) y si tales reactivos pueden pasar a través de la barrera placentaria.

La técnica de cultivo de órganos toda describióaquí fue adaptada de un protocolo descrito por primera Maatouk et al. ^2, en la que las gónadas fetales enteros se incuban en cultivos ex vivo de gotas en posición vertical. Una ventaja significativa de cultivo de gónadas fetales es que los inhibidores de molécula pequeña pueden acceder fácilmente todo el órgano por difusión simple. . DeFalco et al han demostrado que la utilización de este método de cultivo gotita ex vivo en combinación con inhibidores de molécula pequeña se puede utilizar para estudiar los procesos y las interacciones que se producen durante el desarrollo de las gónadas ³ de señalización; estos procesos serían difíciles de examinar in vivo debido a problemas técnicos (por ejemplo, el paso de drogas a través de la placenta o letalidad de afectar a múltiples órganos utilizando enfoques genéticos o farmacológicos).

La cultura gotita no es sólo una mejora en algunos aspectos más de la experimentación en el útero, pero también es una mejora con respecto in vitro y ex visistemas vo también. El uso de líneas celulares para estudiar la morfogénesis es extremadamente difícil porque carecen de los diversos tipos de células, carecen de la matriz extracelular (ECM) componentes críticos que permiten la formación de la arquitectura de órganos, y pueden exhibir artefactos en las cascadas de señalización. Aunque la ingeniería de tejidos ha hecho mejoras significativas en la creación de andamios que simulan ECM, la falta de conocimiento con respecto a la cual las señales son requeridos por cada tipo de célula durante la organogénesis hace que sea difícil para construir un sistema de órganos in vitro. Otros sistemas ex vivo han sido establecidos previamente para estudiar la organogénesis, o más específicamente la morfogénesis y han sido muy exitoso para imágenes en vivo de los órganos fetales en agar ^4, transwells ^{5, 6,} filtros y otras matrices de andamio ^7,8. La ventaja del sistema de cultivo gotita es que permite el estudio de la morfogénesis, proporcionando la capacidad de utilizar menos reactivos, que son often caro, pero también dando la tensión superficial de órganos, lo cual es importante para el crecimiento y la señalización de capacidades ^9.

En el ratón, la morfogénesis inicial testículo tiene lugar entre embrionario (E) etapas E11.5 y E13.5; estas etapas comprenden la ventana de tiempo óptimo para los factores que influyen en la diferenciación de sexo-específicas de instrucción. Entre los procesos críticos que ocurren durante la formación de los testículos son la generación de la arquitectura cable de testículo y la formación de una red vascular-testículo específico. La utilización de este órgano vivo todo el sistema de cultivo ex gotita, uno es capaz de alterar la vascularización-masculina específica e inhibir la morfogénesis testículo mediante el uso de un inhibidor de pequeña molécula que bloquea la actividad de los receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); La remodelación vascular mediada por VEGF es crítico para el desarrollo testicular ^10-12. Esta técnica se puede aplicar con éxito a otros órganos y puede apuntar tiempo específicoventanas de desarrollo. Formación de imágenes de órganos Todo el montaje permite la visualización de las estructuras vitales así como los cambios estructurales y celulares resultantes de la administración de diversos inhibidores. Es importante destacar que este sistema es ventajoso en que el investigador puede pasar por alto posibles efectos de confusión de la administración del fármaco materna o la interrupción sistémica in vivo durante estrategias gen diana. Por lo tanto, todo este órgano ex vivo sistema de cultivo de gota puede mejorar significativamente la capacidad de entender las interacciones y la señalización que se producen específicamente en determinados órganos durante el desarrollo fetal.

Protocolo

Todos los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones CD-1 obtenidos de Charles River Laboratories. Experimentos de cultivo anteriores también se han realizado en otras cepas, tales como C57BL / 6J (datos no presentados), pero cualquier cepa se puede utilizar. Hembras adultas embarazadas fueron de aproximadamente 2-3 meses de edad y se sacrificaron mediante _inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical y toracotomía bilateral antes de la eliminación del embrión. Los animales fueron alojados de conformidad con las directrices del NIH, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo y Platos

1. Preparar una solución de etanol al 70%. Agua desionizada Autoclave (para la fabricación de cámaras humidificadas y para hacer soluciones / dilución). Esterilizar las herramientas de disección (pinzas, tijeras, y 27 g jeringas de aguja) rociando abajo con etanol al 70%.
2. PrepararSolución salina tamponada con fosfato 10X (PBS) que contiene calcio y magnesio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, 2,4 g KH ₂ PO _4, 6,75 ml de 1 M CaCl _2, 3,75 ml de 1 M de MgCl ₂ ). Revuelva para disolver en 1 l de agua estéril en autoclave y luego filtrar con papel de filtro. Diluir 10 veces con agua para hacer 1X PBS.
3. Heat inactivar suero bovino fetal (FBS) a 55 ° C durante 30 min y el filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras.
4. Preparar 38 ml 1X medio de cultivo completo (llamado DMEM completo, cDMEM), que consiste en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 10% filtró dilución FBS inactivado por calor y un centésimo de penicilina-estreptomicina de valores. Esto por lo general se debe utilizar fresco, pero se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
5. Reconstituir el VEGFR tirosina quinasa Inhibidor II (TKI II) en DMSO para una concentración de solución madre de 5 mg / ml, y diluir la acción con cDMEM para hacer una solución de trabajo. El aire acondicionado de últimacentración para este estudio es 1,875 g / ml en cDMEM. De acuerdo a las recomendaciones de la empresa, soluciones de reserva son estables durante un máximo de 6 meses a -20 ° C. En cuanto a las soluciones de trabajo, hacer fresco y utilización en el mismo día.
   Nota: La concentración de este fármaco en la solución de trabajo debe ser de dos veces mayor que la concentración final deseada (ya que se diluirá de dos veces en la gotita). Al mismo tiempo, preparar el mismo volumen de cDMEM que contiene el mismo volumen de DMSO para el tratamiento de "control".
6. Preparar los reactivos de digestión cola (NaOH 50 mM y 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) por separado en agua destilada.
7. Hacer un balance de los cebadores de PCR XY 25 M (XY adelante 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'y 5' XY Reverse-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3 ') junto con agua libre de nucleasa.
8. Preparar tampón 50X TAE (242 g Base Trizma, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,5, y añadir agua a 1 l fivolumen final). Preparar tampón de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluyó con agua hasta 1 L de volumen total).
9. Para crear una solución al 2,5% de agarosa (0,625 g de agarosa, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de agua), solución de agarosa de calor en el microondas hasta que hierva, luego dejar enfriar hasta alrededor de 55 a 65 ° C (capaz de tocar). Una vez frío, añadir 2 l de solución de bromuro de etidio 1%, y se vierte en gel.
   ¡CUIDADO! El bromuro de etidio es un mutágeno y teratógeno; por favor, utilice guantes de nitrilo y adecuado protocolo de seguridad al manejar. Alternativamente, se pueden usar otros agentes o colorantes gel de resolución potencialmente menos tóxicos.
10. Preparar solución de bloqueo (PBS con 0,1% Triton X-100, 10% de suero bovino fetal [FBS], y 3% de albúmina de suero bovino [BSA]) para inmunofluorescencia.
11. Preparar la solución de lavado (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% de FBS, y 3% de BSA) para inmunofluorescencia.
12. Preparar PbTx (PBS con 0,1% Triton X-100) para inmunofluorescencia.
13. Preparar las cámaras de incubación para culture. Llenar platos grandes (100 mm de diámetro) de Petri con 35 ml de agua en autoclave. Coloque cerca del lugar donde se llevará a cabo la disección y culturas.

2. Aislamiento de Fetal Testículos de Mus musculus

1. Compruebe el ratón hembra de tapones vaginales cada mañana. Mediodía en el día en el que se detecta el tapón vaginal se considera E0.5. La eutanasia del ratón hembra embarazada en E11.5, de una manera consistente con los animales protocolos aprobados.
2. Rocíe abdomen del ratón con etanol al 70%.
3. Abra la piel del vientre y el peritoneo con una incisión en forma de V con unas tijeras finas y tire hacia atrás colgajo de tejido para exponer los órganos interiores.
4. Localice los ovarios en ambos extremos de la trompa uterina. Con unas tijeras, corte en el ovario y el tejido conectivo para separar el útero que contiene los embriones desde el cuerpo de la madre.
5. Abra la pared uterina cortando suavemente el lado opuesto a la placenta, la exposición de las bolsas de la yema. Sea cuidadoso para no pusaco vitelino ncture para evitar embriones dañar o perder.
6. Cortar cerca de la placenta para eliminar las bolsas de la yema contiene embrión y colocarlos en un plato que contiene PBS con calcio y magnesio. La presencia de iones de calcio y magnesio ayudará a moléculas de adhesión celular apoyo para mantener la arquitectura del tejido e impiden que el tejido se pegue a las herramientas de disección.
7. Con unas pinzas, retire el saco vitelino y amnios del embrión mediante la punción con cuidado el saco vitelino para crear un agujero en el que el embrión se puede deslizar hacia fuera. Una vez que el embrión se encuentra fuera del saco vitelino, cortar el cordón umbilical.
8. Desde este punto en adelante, utilizar un microscopio ubicado en una campana de cultivo de tejido estéril. Retire la cabeza del embrión y deseche pellizcando con pinzas a cada lado del cuello.
9. Retire la cola y colocar en un nuevo tubo de microcentrífuga para el análisis XY PCR para determinar el sexo del embrión.
   Nota: Si bien es óptimo para gónadas cultura tan pronto como sea posible después de la cosecha, también es possible para eliminar ADN de la cola y realizar XX / XY genotipado antes del cultivo, de modo que el sexo de cada embrión es conocido y sólo el sexo deseado tiene que ser cultivado. Si bien la determinación del genotipo se está haciendo, los embriones pueden mantenerse separados (de modo que puedan ser seguidos) a 4 ° C o en hielo hasta que esté listo para la cultura. Una advertencia es que este periodo fuera en el útero o condiciones de cultivo puede afectar potencialmente a la viabilidad de la cultura o el desarrollo posterior durante el cultivo.
10. Asegurar el embrión en una posición supina en contra de la parte inferior de la placa de cultivo fijando las axilas de embrión con un par de pinzas (por lo general el fórceps mantenidos en la mano débil). Mantener estas pinzas en lugar de mantener el embrión quieto durante todo el proceso de disección.
11. Con otro par de pinzas, quite la piel del abdomen y cubre eliminar suavemente el hígado, los intestinos y otros órganos para exponer la pared posterior del cuerpo.
12. Como las gónadas se encuentran en la pared del cuerpo de vuelta a cada lado de la aorta dorsal,un vaso sanguíneo grande que recorre la línea media del cuerpo, cucharada por debajo de la cresta urogenital con pinzas cerradas y retire la cresta urogenital mediante la apertura de la pinza y levantando. Como las gónadas serán libremente fijadas a la pared, tenga cuidado de no tirar demasiado rápido sin quitar estas conexiones o las gónadas pueden estirar, causando daños a los órganos.
13. Mueva la cresta urogenital en cDMEM en un plato para aclimatarse tejido para los medios de comunicación.
14. Separar el complejo gónada-mesonefros del resto de la cresta urogenital utilizando 27 g agujas. Use una aguja para cortar presionando hacia abajo, y utilizar la otra para guiar el tejido correctamente para permitir la separación óptima. Evite el uso de un movimiento de aserrado contra el fondo del plato, como agujas afiladas crearán fragmentos de plástico que se adhieren a los tejidos. Asegúrese de mantener el mesonefros completamente unidos a la gónada.

3. El cultivo de gónadas con un inhibidor de molécula pequeña

1. Establecer dos 20 μl pipetas a 15 l cada uno. Cortar unos 1-2 mm de una de las puntas de pipeta de barrera utilizando una hoja de afeitar limpia, esterilizada para la transferencia de las gónadas y además del control cDMEM, mientras que la otra pipeta se utilizará únicamente para cDMEM tratado con el fármaco.
2. Alinear gónadas con su eje longitudinal paralelo a la punta de la pipeta por lo que fácilmente se pueden pipeta con la punta de corte. Tenga cuidado de las gónadas se pegan en el interior de la punta de pipeta.
3. Etiquetar un lado como la gotita de control y el otro como la gotita que contiene el fármaco. Sólo dos gotitas pueden caber en una tapa de placa de 35 mm. Asegúrese de que las etiquetas de los párpados se ajustan a las etiquetas de los tubos de microcentrífuga que contiene la cola de los tejidos.
4. Pipeta 15 l de cDMEM que contienen una sola gónada en una gotita en la tapa de una pequeña (35 mm) placa de cultivo (utilizar sólo las tapas, ya que los fondos son demasiado alto para caber dentro de una cámara humidificada placa de Petri). Coloque dos gotas que contienen las gónadas-separadas a ambos lados del plato, fr bien separadoom uno del otro. Compruebe bajo el microscopio para asegurar que las gónadas se han transferido a las gotas.
5. Para la gotita designado como el control, agregar un adicional de 15 l de cDMEM que contienen DMSO (realizada en el paso 1.5) para hacer una gota con un volumen total 30 l. Utilice sólo la pipeta "control" que no va a ponerse en contacto con la droga.
6. Para la otra gotita (muestra tratada con fármaco), añadir 15 l de TKI-II que contiene cDMEM para hacer una gota con un volumen total de 30 l. Utilice sólo la pipeta designado para las muestras tratadas con el fármaco.
7. Usando la pipeta, extender las gotas en un patrón circular expansión hasta que estén cerca de 15-18 mm de diámetro y la gónada se encuentra aproximadamente en el centro. Orientar la gónada para que quede en su lado y la gónada y mesonefros son fácilmente distinguibles. Orientar el pulmón de manera que los dos lóbulos en posición plana.
   1. Aunque diámetro de gota puede variar ligeramente, asegúrese de que las gónadas no son floating y se mantiene en su lugar por la tensión superficial. Asegúrese de que las gotitas no se toquen entre sí o con el lado de la tapa. Sin la tensión de la superficie, los órganos crecerán en la tapa durante el cultivo y aplanar, distorsionando así la morfología de órganos.
8. Colocar con cuidado la tapa de la placa de cultivo que contenía las gotitas en posición vertical sobre la superficie del agua en el grande (100 mm) plato humidificador. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas debajo de la parte inferior de la tapa y que está acostado sobre la superficie del agua. No invierta la tapa y tener cuidado de no dejar que el agua toque la parte superior de la tapa donde se encuentran las gotas.
9. Para crear una pequeña cámara húmeda, cubrir inmediatamente con la tapa del plato humidificador grande para encerrar las culturas gónadas. Actuar lo más rápidamente posible para minimizar cualquier evaporación de medios de comunicación. Asegúrese de que el plato más pequeño tiene espacio entre ella y la tapa del plato más grande para moverse libremente; de lo contrario, la condensación puede hacer un sello y bel intercambio de aire de bloqueo para el tejido.
10. Una vez que dos pequeñas tapas se colocan en la cámara, coloque inmediatamente la cámara en la incubadora. Incubar las culturas de gotas durante 48 horas en un humidificado _incubadora de CO 2 a 37 ° C.

Reacción en Cadena de la Polimerasa 4. para determinar el sexo de los embriones

1. Añadir las colas embrionarias para fondo de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Añadir a cada tubo 200 l de NaOH 50 mM.
3. Coloca a 95 ° C durante 15 minutos o hasta que el tejido se haya disuelto completamente.
4. Añadir 50 l de 1 M Tris-HCl y agitar ligeramente y brevemente.
5. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, hacer una mezcla maestra de PCR fresca multiplicando cada volumen por el número total de muestras: 0,5 l de 25 mM solución Primer, 2,5 l de 10X Taq Buffer, 0,5 l mM dNTPs 10 (nucleótidos), 19,3 l nuclease- agua libre, 0,2 l de ADN polimerasa Taq. Mezclar bien.
6. Añadir 23l de mezcla maestra de PCR a PCR tubos que contienen 3 l de lisado de colas digeridos.
7. Tubos Flick para mezclar ellos, a continuación, realizar un breve centrifugado para llevar las muestras a la parte inferior del tubo.
8. Ejecutar XY programa (Short) PCR (Tabla 1).
9. Cargar las muestras (con tinte 5x) y la escalera en un gel de agarosa al 2,5% en tampón TAE 1X.
10. Ejecute la electroforesis en gel de agarosa hasta XX y XY bandas se pueden resolver.
11. Imagen del gel con la captura de imágenes de luz UV y.
12. Analizar el X-cromosoma específico vs Y bandas del cromosoma específico (cromosoma X = 331 pares de bases [pb] y XY = 302 pb) ^13; XY muestras (masculinas) tendrán dos bandas de 331 y 302 pb, mientras XX (femeninos) muestras aparecerán como una única banda de 331 pb.

5. Toda la inmunofluorescencia Monte Organ

Día 1:

1. Retire las gónadas de la cultura con una pipeta 1.000 l con una punta de corte. Si se desea, pueden estarcolocado en un plato de PBS para lavar medios y reactivos. Coloque en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. El tamaño de tubo más pequeño conservará reactivos y hacer más fácil hacer un seguimiento de las muestras en el tubo.
   1. Asegúrese de mantener el control y las muestras tratadas, así como muestras XX y XY, en tubos separados y eliminarlos de la cultura con conjuntos separados de pipetas para evitar la contaminación potencial de drogas.
2. Lávese las gónadas dos veces con PBS. A partir de ahora, este protocolo puede utilizar 1X PBS que carecen de calcio y magnesio. Para lavar ellos, permiten que las gónadas para hunden hasta el fondo del tubo (por gravedad) y luego eliminar el líquido anteriormente. Tenga cuidado de no perder gónadas pipeteando demasiado cerca de ellos.
3. Eliminar la mayor cantidad PBS como sea posible desde el tubo. Añadir 250 l de paraformaldehído al 4% en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100, y dejar incubar O / N a 4 ° C en un agitador. Alternativamente, esta fijación se puede realizar durante 2 horas a 4 ° C en un agitador. ¡CUIDADO! Paraformaldehyde es una sustancia tóxica, por lo que sigue el protocolo de seguridad al manejar.

Dia 2:

4. Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx a RT.
5. Lávese las gónadas 3 veces con 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador.
6. Bloquee las gónadas al menos 1 hora en 250 l de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador.
7. Teñir las gónadas O / N a 4 ° C en un rockero en 250 l de anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo.

Día 3:

8. Enjuague las gónadas dos veces en 250 Solución de lavado l.
9. Lávese las gónadas 3 veces con 250 l solución de lavado durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en una mecedora.
10. Bloquee las gónadas 1 h en 250 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador.
11. Cubra el tubo de microcentrífuga con papel de aluminio para proteger secundaria de anticuerpos fluorescentes de la luz.
12. Incubar las gónadas 04.02 horas a RT en arocker en 250 l de anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo que contiene Hoechst 33342. Alternativamente, realice anticuerpo secundario y Hoechst 33342 incubación O / N a 4 ° C en eje de balancín.
13. Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx.
14. Lávese las gónadas 3 veces en 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador.
15. Usando una punta de pipeta de corte, transferir gónadas en un portaobjetos con el líquido mínimo. Retire el exceso de líquido con la pipeta, pero asegúrese de que el tejido no se seque.
16. Orientar las gónadas en forma deseada con unas pinzas, y añadir rápidamente una gota de medio de montaje para montar las gónadas de la diapositiva. Asegúrese de que los abrigos de los medios de montaje todas las muestras por completo; es fundamental para evitar que las muestras se sequen.
17. Use cubreobjetos (número 1.5 del estilo) de tamaño adecuado para cubrir suavemente muestras. Deje de montaje propagación medios de comunicación para ponerse en contacto con toda la superficie del cubreobjetos. Si es necesario, pulse muy ligeramente en las esquinas de modo que el cubreobjetosno hay grandes burbujas de aire.
18. Sellar las diapositivas con claro esmalte de uñas en los bordes para reducir la evaporación de los medios de montaje. Tienda diapositivas montadas en la oscuridad a 4 ° C.

Resultados

El cultivo ex vivo de gota le permite a uno para manipular órganos enteros, como el de las gónadas, para estudiar las interacciones celulares y dinámicas. La figura 1 muestra de manera gradual cómo preparar una cultura E11.5 gonadal gotas. Los primeros pasos en el protocolo de cultivo incluyen la eliminación inicial del útero que contiene embrión del ratón madre (Figura 1A y 1B). Después de la extracción del útero de la madre, la pared uterina se corta y los embrione...

Discusión

Este estudio demuestra un método ex vivo gotita entera órgano que tiene muchas aplicaciones potenciales para el estudio del desarrollo fetal. Esta técnica se puede utilizar para múltiples órganos, y permite al investigador para abordar cuestiones biológicas que son difíciles de examinar usando enfoques in vivo debido a la inaccesibilidad de los embriones y el potencial letalidad embrionaria. Este método de cultivo tiene beneficios adicionales sobre otros enfoques in vitro, tales como l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)	Fisherbrand	12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible	Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps	GeneMate	T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L	Gilson	FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
Fine Scissors	FST	91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles	BD PrecisionGlide	309623
10 ml syringe	BD	305559
0.2 μM PES syringe filter	VWR	28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm	Whatman	1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish	Falcon/Corning	353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator	Eppendorf	CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet	Nuare	NU-425-400
Mini-centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL	GeneMate	R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel	Eppendorf	950040015
SMZ445 stereomicroscope	Nikon	SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software	Alpha Innotech Corporation	Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol	Fisher	BP2818-500
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4	Fisher	S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S671-3
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma	C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
XY PCR Primer	IDT	N/A
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP2482-1
1% Ethidium bromide solution	Fisher	BP1302-10	Toxic
Agarose	GeneMate	E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	367176-2.5KG
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions	Thermo Scientific	R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer	Denville	CB-4050-3
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500	Toxic
FluorMount-G	Southern Biotech	0100-01
Hydrogen Chloride (HCl)	Fisher	A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation	Bioexpress	0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered	Fisher	03-600-511	Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered	Sigma	D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem	EMD Millipore	676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody	Millipore	AB5535	Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody	BD Pharmingen	553370	Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signaling	9661S	Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)	Life Technologies	13-1900	Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen (Molecular Probes)	H1399	Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-165-153	Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A31572	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21206	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21208	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Life Technologies	A31573	Use at dilution: 1:500