שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Summary

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Abstract

חוקר organogenesis ברחם הוא תהליך מאתגר מבחינה טכנית ביונקי שליה בשל חוסר נגישות של חומרים כימיים לעוברים המתפתחים בתוך הרחם. שיטה חדשה שפותחה תרבות אגל vivo לשעבר זקופה מספקת חלופה אטרקטיבית למחקרים שבוצעו ברחם. תרבות אגל vivo לשעבר מספקת את היכולת לבחון ולטפל אינטראקציות הסלולר ומסלולי איתות מגוונים באמצעות שימוש בחסימה שונות ותרכובות הפעלה; בנוסף, את ההשפעות של חומרים כימיים תרופתיים שונים על התפתחות איברים ספציפיים ניתן ללמוד ללא תופעות לוואי בלתי רצויות של אספקת סמים מערכתית ברחם. בהשוואה לאחרים במערכות חוץ גופית, תרבות אגל לא רק מאפשרת ליכולת ללמוד אינטראקציות תלת-ממדי המורפוגנזה ותאי תאים, שלא יכול להיות מועתקות בשורות תאי יונקים, אלא גם דורשת פחות משמעותי reagents מאשר אחר vivo לשעבר ובפרוטוקולי מבחנה. מסמך זה מדגים נתיחה נכונה עכבר עוברית איבר וטכניקות תרבות טיפה זקופות, ואחריו immunofluorescence איבר השלם כדי להדגים את היעילות של השיטה. Vivo לשעבר שיטת תרבות אגל מאפשרת ההיווצרות של אדריכלות איבר דומה למה שרואה בvivo ויכול להיות מנוצל כדי ללמוד תהליכים קשים למחקר אחר בשל קטלני עוברית במודלי in vivo. כמערכת יישום מודל, מעכב מולקולה קטנה ישמש לחקור את התפקיד של כלי דם בהמורפוגנזה אשכים. vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה ניתנת להרחבה למערכות אחרות של העובר איברים, כגון ריאות ואפשרות אחרות, אם כי כל איבר חייב להיות בהרחבה למד לקבוע שינויים איבר ספציפי לפרוטוקול. מערכת תרבות איבר זה מספקת גמישות בניסויים עם איברי העובר, ותוצאות obtaineד באמצעות טכניקה זו תסייע לחוקרים להרוויח תובנות בהתפתחות עוברים.

Introduction

התחדשות איברים in vivo בבני האדם היא מוגבלת מאוד; לכן, הנדסת רקמות, התפתחות רקמות ואיברים מהתאים בודדים שנתרמו על ידי מארח, הופכת טיפול פוטנציאלי אטרקטיבי להחלפת איברים. עם זאת, לאסטרטגיה טיפולית זו כדי להצליח, גורמים ואינטראקציות הסלולר מעורבות בהמורפוגנזה של האיבר יש ללמוד ביסודיות והבינו היטב. בשל חוסר היכולת ללמוד פיתוח של איברים ספציפיים עם גישות מסורתיות, חוקרים פנו לעובר כל חלופה או תרבויות איבר שלמות. Kalaskar et al. ¹ הראה כי תרבות עובר כל vivo לשעבר מניבה תוצאות דומות (58% בעוברים בתרבית) בפיתוח הרחם, המצביע על כך שיטות תרבות vivo לשעבר הן אלטרנטיבה אפשרית ללימודי organogenesis.

מערכת אישית איבר תרבות, כגון זה vivo לשעבר droplet מערכת התרבות, מאפשרת לעצמאית ניתוח איבר שלם של השפעות מערכתיות, תוך התרת מניפולציה של מסלול איתות ספציפי או אינטראקציות הסלולר באמצעות תוספת של חומרים כימיים או נוגדנים תרופתיים. באופן מסורתי, המחקר של פיתוח איבר העוברי היה מוגבל לטכנולוגיות מהונדסים ועכבר נוקאאוט, בנוסף לחומרים כימיים תרופתיים נמסרו אימהי. עם זאת, יש בעיות טכניות הכרוכות בטכניקות אלה וטיפולים בvivo; רוב החששות סובבים סביב תופעות של השפעה על איברים שונים בו זמנית אשר לעתים קרובות תוצאות קטלניות עוברי. חשש נוסף של מחקרי מניפולציה התפתחות עוברים פרמקולוגית הוא ההשפעה האימהית של תרופות על התפתחות עוברית ברחם (למשל, חילוף חומרים אימהיים של התרופה לפני שהוא מגיע לעובר) ואם ריאגנטים כזה יכול לעבור את מחסום השליה.

טכניקת תרבות איבר השלמה תיארהכאן הותאם מפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Maatouk et al. ^2, שבו בלוטות מין העובר כל מודגרת בתרבויות טיפה זקופות vivo לשעבר. יתרון משמעותי אחד culturing בלוטות מין העובר הוא שמעכבי מולקולה קטנה יכולים בקלות לגשת לכל האיבר בדיפוזיה פשוטה. . DeFalco et al הראה כי ניצול vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה בשיתוף עם מעכבי מולקולה קטנה יכול לשמש כדי לחקור תהליכי איתות ואינטראקציות המתרחשות במהלך התפתחות בלוטת מין ^3; תהליכים אלה יהיו קשים לבחון in vivo בשל אתגרים טכניים (למשל, מעבר של תרופות דרך השליה או הקטלני של איברים המשפיעים מרובים באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות).

תרבות רביב היא לא רק שיפור בהיבטים מסוימים על בניסויים ברחם, אבל גם את זה הוא שיפור לעומת במבחנה ולשעבר viמערכות VO גם כן. השימוש בשורות תאים ללמוד המורפוגנזה קשה מאוד כי חסרים להם הסוגים השונים של תאים, חסרי רכיבים קריטיים מטריצה ​​תאית (ECM) המאפשרים את היווצרותה של אדריכלות איבר, ויכול להציג חפצים באיתות מפלים. למרות הנדסת רקמות עשתה שיפורים משמעותיים ביצירת פיגומי הדמית ECM, חוסר הידע לגביהם אותות נדרשים על ידי כל סוג תא בorganogenesis עושה את זה מאתגר לבנות מערכת איברים במבחנה. מערכות אחרות vivo לשעבר כבר הוקמו בעבר ללמוד organogenesis, או לייתר דיוק המורפוגנזה, והיו מוצלח מאוד עבור הדמיה חיה של איברי העובר באגרו ^{4, 5} Transwells, מסננים ^6, ומטריצות פיגום אחרות ^7,8. היתרון של מערכת תרבות הטיפה הוא שהיא מאפשרת המחקר של המורפוגנזה על ידי מתן האפשרות לניצול פחות חומרים כימיים, אשר often יקר, אלא גם נותן את מתח פן איבר, וזה חשוב ליכולות צמיחה ואיתות ^9.

בעכבר, המורפוגנזה אשך ראשונית מתרחשת בין העוברית (E) בשלבי E11.5 וE13.5; שלבים אלה מהווים את חלון הזמן האופטימלי לבחינת גורמים המשפיעים על התמיינות מין ספציפי. בין התהליכים הקריטיים המתרחשים במהלך היווצרות אשך הדור של אדריכלות כבל אשך ויצירת רשת כלי דם אשך ספציפי הם. ניצול לשעבר מערכת תרבות אגל זה vivo כל איבר, אחד הוא מסוגל לשנות כלי דם זכר ספציפי ומעכבים המורפוגנזה אשך באמצעות מעכבי מולקולה קטנה שחוסם את הפעילות של הקולטנים לגורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF); שיפוץ של כלי דם בתיווך VEGF הוא קריטי להתפתחות אשכים ^10-12. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאיברים אחרים ויכולה למקד את הזמן ספציפיחלונות של פיתוח. כל הר ההדמיה האיבר מאפשרת ההדמיה של מבנים חיוניים, כמו גם שינויים מבניים וסלולריים כתוצאה מהממשל של מעכבים שונים. חשוב לציין, מערכת זו יש יתרון בכך שהחוקר יכול לעקוף תופעות בלבול פוטנציאליות מממשל תרופה אימהי או שיבוש מערכתי בin vivo אסטרטגיות גן ממוקד. כך, מערכת כולה תרבות אגל vivo לשעבר איבר זה יכול לשפר באופן משמעותי את היכולת להבין את יחסי הגומלין והאיתות שמתרחשים במיוחד באיברים מסוימים במהלך התפתחות עוברית.

Protocol

כל העכברים המשמשים במחקרים אלה היו CD-1 עכברים המתקבלים מצ'ארלס ריבר מעבדות. ניסויי תרבות קודמים גם בוצעו בזנים אחרים, כגון C57BL / 6J (מידע לא מוצג), אבל כל זן יכול לשמש. נשים בוגרות בהריון היו כ ישנות 2-3 חודשים והיו מורדמים באמצעות שאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם ופתיחת בית חזה בין שתי המדינות לפני הסרת עובר. עכברים שוכנו בהתאם להנחיות NIH, ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של המרכז הרפואי בית החולים של סינסינטי הילדים.

1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות

1. הכן פתרון אתנול 70%. מים החיטוי deionized (להכנת תאי humidified ולהכנת פתרונות / דילול). לעקר כלים לנתיחה (מלקחיים, מספריים, ו -27 מזרקים מחט G) על ידי ריסוס למטה עם 70% אתנול.
2. הכןמלוח 10X נאגר פוספט (PBS) המכיל סידן ומגנזיום (80 גר 'NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גר' Na _{2 4} HPO, 2.4 גרם KH ₂ PO _4, 6.75 מיליליטר של 1 M CaCl _2, 3.75 מיליליטר של 1 M MgCl ₂ ). מערבבים להתמוסס במי autoclaved סטרילי 1 ליטר ואז לסנן עם נייר סינון. לדלל פי 10 עם מים כדי להפוך 1X PBS.
3. חום להשבית בסרום שור עוברי (FBS) על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולסנן לעקר עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
4. הכינו 38 מיליליטר בינוני 1X תרבות השלמה (המכונה DMEM המלא, cDMEM), בהיקף של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM), 10% מסוננים דילול FBS חום מומת ו1/100 של מניית פניצילין, סטרפטומיצין. זה בדרך כלל יש להשתמש טרי, אבל יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 חודש.
5. מחדש VEGFR טירוזין קינאז מונעי השני (TKI II) בDMSO לריכוז מניות של 5 מ"ג / מיליליטר, ולדלל מניות עם cDMEM לעשות פתרון עובד. קון הסופיcentration למחקר זה הוא 1.875 / מיליליטר מיקרוגרם בcDMEM. על פי ההמלצות של החברה, פתרונות מניות יציבים לתקופה של עד 6 חודשים ב -20 ° C. באשר לפתרונות עבודה, לעשות טרי ולהשתמש בו ביום.
   הערה: הריכוז של תרופה זו בפתרון עובד צריך להיות פי שתיים גבוהים מהריכוז הסופי הרצוי (שכן הוא יהיה מדולל כפול בטיפה). במקביל, להכין את אותו הנפח של cDMEM המכיל את אותו הנפח של DMSO לטיפול "השליטה".
6. הכן את חומרים כימיים עיכול זנב (50 מ"מ NaOH 1 M וטריס-HCl [pH 8.0]) בנפרד במים מזוקקים.
7. הפוך 25 מיקרומטר מניות של פריימרים XY PCR (XY קדימה 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'וXY הפוך 5'-CCG CTG המרכז לאמנות עכשווית AAT TCT TTG G-3') יחד במי nuclease חינם.
8. הכן חיץ 50X טה (242 גר 'Trizma בסיס, 57.1 מיליליטר קרחוני חומצה אצטית, Fi L 100 מ"ל מים 0.5 M EDTA, pH 8.5, ולהוסיף עד 1נפח סופי). הכן חיץ ריצת 1X טה (20 מיליליטר 50X טה מדולל במים לL 1 נפח כולל).
9. כדי ליצור פתרון 2.5% agarose (0.625 agarose גרם, 0.5 מיליליטר 50X טה מאגר, 24.5 מיליליטר מים), פתרון agarose חום במיקרוגל עד רתיחה, ולאחר מכן לתת מגניב עד בערך 55-65 מעלות צלזיוס (מסוגל לגעת). ברגע מגניב, להוסיף 2 μl של 1% פתרון ברומיד, ויוצקים ג'ל.
   זהירות! ברומיד הוא mutagen וטךטוגן; אנא השתמש בכפפות nitrile ופרוטוקול בטיחות נאותה בעת טיפול. לחלופין, ניתן להשתמש בחומרים אחרים שעלולים להיות פחות רעילים ג'ל פתרון או צבעים.
10. הכן פתרון חסימה (PBS עם 0.1%-100 X, 10% בסרום שור עוברי טריטון [FBS], ו -3% אלבומין בסרום שור [BSA]) לimmunofluorescence.
11. הכן פתרון כביסה (PBS עם 0.1% Triton X-100, 1% FBS, וBSA 3%) לimmunofluorescence.
12. הכן PBTx (PBS עם 0.1% Triton X-100) לimmunofluorescence.
13. הכן את תאי דגירה למ"קlture. מלא מנות גדולות פטרי (100 מ"מ קוטר) עם 35 מיליליטר מים autoclaved. הנח ליד המקום שבי נתיחה ותרבויות תבוצענה.

2. בידוד של העובר אשכים ממאסכאלאס

1. בדוק את נקבת העכבר לתקעי נרתיק בכל בוקר. בצהריים ביום שבו תקע הנרתיק מזוהה נחשבים E0.5. להרדים את נקבת העכבר בהריון בE11.5, באופן עקבי עם פרוטוקולי חיה אושרו.
2. לרסס את בטן עכבר עם 70% אתנול.
3. פתח את עור הבטן והצפק עם חתך בצורת V באמצעות מספריים קנס ולמשוך בחזרה דש של רקמה לחשוף איברים פנימיים.
4. אתר את השחלות בשני הקצוות של קרן הרחם. בעזרת מספריים, לחתוך בשחלה ורקמת החיבור להפריד הרחם המכיל את העוברים מהגוף של האם.
5. פתח את דופן הרחם בעדינות על ידי חיתוך בצד השני placentae, חושף את שקי החלמון. היזהר שלא puשק חלמון ncture להימנע עוברים מזיקים או לאבד.
6. חותך ליד placentae להסיר את שקי חלמון מכיל עובר ולמקם אותם לתוך צלחת המכילה PBS עם סידן ומגנזיום. נוכחותם של יוני סידן ומגנזיום תעזור מולקולות הידבקות תא תמיכה כדי לשמור על מבנה רקמה ולמנוע את הרקמה להידבק לכלים לנתיחה.
7. עם מלקחיים, להסיר את שק החלמון וamnion מהעובר על ידי ניקוב בזהירות את שק החלמון כדי ליצור חור שבעובר יכול להחליק החוצה. ברגע שהעובר הוא מחוץ לצק החלמון, חתך את חבל הטבור.
8. מכאן ולהבא, השתמש במיקרוסקופ ממוקם בברדס רקמת סטרילית תרבות. הסר את הראש של עובר ולהשליך על ידי צובט עם מלקחיים בכל צד של צוואר.
9. הסר את הזנב והמקום לתוך צינור microcentrifuge חדש לניתוח XY PCR כדי לקבוע מין של עובר.
   הערה: למרות שזה אופטימלי לבלוטות מין תרבות בהקדם האפשרי לאחר קציר, הוא גם קופהsible להסיר DNA זנב ולבצע genotyping XX / XY לפני התרבות, כך שיחסי המין של כל עובר ידוע ורק המין הרצוי צריך להיות מתורבת. בעוד genotyping נעשה, עוברים יכולים להישמר מופרדים (כך שהם יכולים להיות במעקב) על 4 מעלות צלזיוס או על קרח עד מוכן לתרבות. אזהרה אחת היא שתקופה זו בתנאים מחוץ הרחם או תרבות פוטנציאלית עלולה להשפיע כדאיות לתרבות או ההתפתחות הבאה בתרבות.
10. אבטח את העובר במצב שכיבה נגד תחתית צלחת התרבות על ידי מצמיד בתי השחי של עובר עם זוג אחד של מלקחיים (בדרך כלל המלקחיים שנערכו ביד החלשה). לשמור המלקחיים האלה במקום להחזיק את העובר עדיין בתהליך לנתיחה כולו.
11. עם זוג מלקחיים אחר, להסיר בטן עור מכסה בעדינות להסיר כבד, מעיים, ואיברים אחרים כדי לחשוף גב קיר גוף.
12. כבלוטות המין יהיה ממוקמים על קיר הגוף בחזרה בכל צד של אב העורקים הגב,כלי דם גדולים רצו לאורך קו האמצע של הגוף, לגרוף מתחת לרכס ואברי המין עם מלקחיים סגורים ולהסיר את הרכס ואברי המין על ידי פתיחת המלקחיים ומרימים. כבלוטות המין יהיו מחוברים לקיר באופן רופף, להיזהר שלא למשוך מהר מדי מבלי להסיר קשרים אלה או בלוטות המין יכול למתוח, גרימת נזק לאיברים.
13. הזז את הרכס ואברי המין לcDMEM בצלחת להסתגל רקמה לתקשורת.
14. הפרד את בלוטת מין מורכב-כליה בינים משאר הרכס ואברי המין באמצעות 27 מחטי G. השתמש במחט אחת לחתוך על ידי לחיצה, ולהשתמש האחרים כדי להנחות את הרקמה בצורה נכונה כדי לאפשר הפרדה אופטימלית. הימנע משימוש בתנועת ניסור נגד תחתית הצלחת, כמו מחטים חדות ייצרו רסיסים של פלסטיק שיכול להיצמד לרקמה. הקפד לשמור הכליה בינים מחוברים לבלוטת המין לחלוטין.

3. Culturing של בלוטת מין עם מונעי קטנה-מולקולה

1. להגדיר שני 20 μטפטפות l 15 μl כל אחד. חותך על 1-2 מ"מ מאחד הטיפים פיפטה המחסום באמצעות סכין נקי, מעוקר גילוח להעברת בלוטות המין ובנוסף השליטה cDMEM, בעוד פיפטה האחרות תשמש אך ורק לcDMEM טיפול תרופתי.
2. בשורה בלוטות מין עם מקביל לציר הארוך שלהם לקצה פיפטה, כך שניתן בקלות להיות pipetted באמצעות הקצה החתוך. היזהר של בלוטות מין דבק הפנימי של קצה פיפטה.
3. תווית צד אחד כטיפת שליטה ואחר כאגל המכיל סמים. רק שתי טיפות יכולות להתאים במכסת צלחת 35 מ"מ. ודא כי תוויות על עפעפיים להתאים את התוויות על צינורות microcentrifuge זנב המכיל רקמות.
4. 15 μl פיפטה של ​​cDMEM מכיל בלוטת מין יחידה לאגל במכסה של צלחת קטנה (35 מ"מ) תרבות (להשתמש רק בעפעפיים, כתחתית היא גבוהה מדי כדי להתאים בתוך תא צלחת פטרי humidified). fr מניחים שתי טיפות המכילה בלוטת מין נפרדת בכל צד של הצלחת, מופרד היטבאום עוד אחד. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שבלוטות המין הועברו לטיפין.
5. לאגל כאזור השליטה, להוסיף 15 μl נוסף של cDMEM מכיל DMSO (שנעשה בשלב 1.5) כדי להפוך את אגל בהיקף כולל של 30 μl. השתמש רק בפיפטה "השליטה" שלא לפנות לסמים.
6. לאגל האחר (לדוגמא טיפול תרופתית), להוסיף 15 μl של cDMEM TKI-II המכיל לעשות טיפה בהיקף כולל של 30 μl. השתמש רק בפיפטה המיועדת לדגימות שטופלו תרופתיות.
7. באמצעות פיפטה, פרוש טיפות בתבנית עגולה הרחבת עד שהם כ 15-18 מ"מ בקוטר ובלוטת המין ממוקמת בערך באמצע. כוון את בלוטת המין, כך שהוא שוכב על צדו ובלוטת המין והכליה בינים בקלות להבחין. כוון את הריאות, כך ששתי האונות שכבו.
   1. למרות קוטר טיפה עשוי להשתנות מעט, לוודא שבלוטות מין אינן צפהז ומוחזק במקום על ידי מתח פנים. ודא כי טיפות לא נוגעים זה בזה או בצד של המכסה. ללא המתח הפנים, האיברים יגדלו על המכסה במהלך התרבות ולשטח, ובכך לעוות מורפולוגיה איברים.
8. בזהירות להניח את המכסה צלחת התרבות המכילה טיפות זקופות על פני השטח של המים בצלחת הגדולה (100 מ"מ) מכשיר האדים. ודא שאין בועות לכודים מתחת לחלק התחתון של המכסה ושהוא שוכב על פני המים. לא להפוך את המכסה ולהיזהר לא לתת לכל מים לגעת בחלק העליון של המכסה שבו הטיפות נמצאות.
9. כדי ליצור תא קטן, humidified, מייד לכסות עם המכסה של צלחת מכשיר אדים הגדולה יותר כדי להקיף את תרבויות בלוטת המין. לפעול במהירות אפשרית כדי למזער את האידוי של תקשורת. ודא שיש לו את הצלחת קטנה יותר חדר בינו ואת המכסה של הצלחת הגדולה יותר כדי לנוע בחופשיות; אחרת, עיבוי עלול להפוך חותם ובחילופי אוויר מנעול לרקמות.
10. ברגע ששני מכסים קטנים ממוקמים לתוך התא, מקום מייד הקאמרית לתוך החממה. דגירה תרבויות אגל במשך 48 שעות בCO ₂ באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס.

תגובת שרשרת פולימראז 4. לקביעת המין של עוברים

1. הוסף את הזנבות העובריים לתחתית צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
2. הוסף לכל צינור 200 μl של 50 מ"מ NaOH.
3. מניחים על 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או עד שהוא נמס לגמרי רקמה.
4. הוסף 50 μl של 1M טריס-HCl ומערבולת קל וקצר.
5. בתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להפוך את תמהיל אב PCR טרי על ידי הכפלת כל כרך במספר הכולל של דגימות: 0.5 μl 25 מיקרומטר פתרון פריימר, 2.5 μl 10X תקי מאגר, 0.5 μl 10 מ"מ dNTPs (נוקלאוטידים), 19.3 μl nuclease- מים חופשיים, 0.2 DNA פולימראז תקי μl. מערבבים היטב.
6. להוסיף 23μl של תמהיל אב PCR לPCR צינורות המכילים lysate 3 μl של זנבות מתעכלים.
7. צינורות פליק לערבב אותם, ולאחר מכן לבצע ספין קצר להביא דוגמאות לחלק התחתון של הצינור.
8. הפעל XY תכנית (הקצר) PCR (טבלת 1).
9. טען את הדגימות (עם צבע 5x) וסולם ב-2.5% agarose ג'ל חיץ 1X טה.
10. הפעל את ג'ל אלקטרופורזה agarose עד ניתן לפתור להקות XX וXY.
11. תמונת ג'ל עם אור UV ולכידת תמונה.
12. נתח את כרומוזום X-הספציפי לעומת להקות כרומוזום Y-ספציפי (כרומוזום X = 331 זוגות בסיסים [נ"ב] וXY = 302 נ"ב) ^13; XY דגימות (זכר) תהיה שתי להקות של 331 ו- 302 נקודות בסיס, ואילו XX דגימות (נקבה) תופיע כלהקת 331 נ"ב יחידה.

5. Immunofluorescence הר איברים שלם

יום 1:

1. הסר את בלוטות המין מהתרבות באמצעות פיפטה 1000 μl עם קצה חתוך. אם תרצה, הם יכולים להיותהניח בצלחת של PBS כדי לשטוף את התקשורת וחומרים כימיים. הנח לPBS בצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge. גודל הצינור הקטן יותר לחסוך בחומרים כימיים ולהפוך אותו קל יותר לעקוב אחר דגימות בצינור.
   1. הקפד לשמור על שליטה ודגימות שטופלו, כמו גם דגימות XX וXY, בצינורות נפרדים ולהסיר אותם מתרבות עם סטים נפרדים של טפטפות, כדי למנוע זיהום פוטנציאלי לתרופה.
2. שטוף את בלוטות המין פעמיים עם PBS. בנקודה זו, פרוטוקול זה יכול להשתמש 1X PBS חסר סידן ומגנזיום. לשטוף אותם, לאפשר לבלוטות המין לשקוע לתחתית של התחתית (על ידי כוח הכבידה) ולאחר מכן להסיר את הנוזל מעל. היזהר שלא לאבד את בלוטות מין על ידי pipetting קרוב מדי אליהם.
3. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מהצינור. הוסף 250 μl של paraformaldehyde 4% PBS המכיל 0.1% Triton X-100, ולתת דגירה O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה. לחלופין, קיבעון זה יכול להיעשות לשעה 2 ב 4 ° C על כיסא נדנדה. זהירות! Paraformaldehyde הוא חומר רעיל, כך לעקוב אחרי פרוטוקול בטיחות בעת הטיפול.

יום 2:

4. יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים בPBTx μl 250 ב RT.
5. שטוף את בלוטות המין 3 פעמים עם 250 μl PBTx במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
6. לחסום את בלוטות מין שעות לפחות 1 ב250 μl חסימת פתרון ב RT על כיסא נדנדה.
7. להכתים את בלוטות המין O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה ב250 μl נוגדן ראשוני בדילול מלא בפתרון חסימה.

יום 3:

8. יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים ב250 פתרון כביסה μl.
9. שטוף את בלוטות המין 3 פעמים עם פתרון כביסה 250 μl במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
10. לחסום את בלוטות המין שעה 1 ב250 μl פתרון חסימה ב RT על כיסא נדנדה.
11. מכסה את צינור microcentrifuge עם נייר אלומיניום כדי להגן נוגדנים משני ניאון מהאור.
12. דגירה בלוטות המין 2-4 שעות ב RT על arocker ב250 נוגדנים משני μl המדולל בתמיסה המכילה חוסם Hoechst 33342. לחלופין, לבצע נוגדנים משני וHoechst 33342 O דגירה / N ב 4 ° C על נדנדה.
13. יש לשטוף את בלוטות המין פעמיים ב250 μl PBTx.
14. שטוף את בלוטות המין 3 פעמים ב250 μl PBTx במשך 10 דקות כל אחד ב RT על כיסא נדנדה.
15. באמצעות קצה פיפטה חתוך, להעביר בלוטות מין לשקופית עם נוזל מינימאלי. הסר נוזל עודף עם פיפטה, אבל לוודא שהרקמה לא להתייבש.
16. כוון את בלוטות המין באופנה רצויה עם מלקחיים, ולהוסיף במהירות ירידה של תקשורת הרכבה להר בלוטות המין בשקופית. ודא מעילי תקשורת הרכבה כל הדגימות לחלוטין; זה קריטי כדי למנוע לתת דגימות להתייבש.
17. coverslips שימוש (בסגנון מספר 1.5) בגודל מתאים כדי לכסות בעדינות דגימות. בואו התפשטות תקשורת הרכבה לפנות את כל פני השטח של coverslip. במידת צורך, מאוד קל ללחוץ על הפינות של coverslip כך שאין בועות אוויר גדולות.
18. לאטום את השקופיות עם לק ברור בקצוות כדי להפחית אידוי של תקשורת ההרכבה. חנות רכובה שקופיות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.

תוצאות

תרבות אגל vivo לשעבר מאפשרת לתמרן איברים שלמים, כגון בלוטת המין, ללמוד אינטראקציות ודינמיקה סלולריות. איור 1 מדגים בצורה צעד חכם כיצד להכין תרבות אגל האשכים E11.5. הצעדים הראשונים בפרוטוקול התרבות כוללים את ההסרה הראשונית של הרחם המכיל עובר מעכבר האמא (?...

Discussion

מחקר זה מדגים שיטת vivo לשעבר איבר שלמה טיפה שיש יישומים פוטנציאליים רבים ללימוד התפתחות העובר. טכניקה זו יכולה לשמש לאיברים מרובים, ומאפשרת לחוקר לענות על שאלות ביולוגיות שקשה לבחון באמצעות in vivo גישות בשל חוסר נגישות של עוברים וקטלניים עובריים פוטנציאל. יש ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)	Fisherbrand	12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible	Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps	GeneMate	T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L	Gilson	FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
Fine Scissors	FST	91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles	BD PrecisionGlide	309623
10 ml syringe	BD	305559
0.2 μM PES syringe filter	VWR	28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm	Whatman	1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish	Falcon/Corning	353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator	Eppendorf	CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet	Nuare	NU-425-400
Mini-centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL	GeneMate	R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel	Eppendorf	950040015
SMZ445 stereomicroscope	Nikon	SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software	Alpha Innotech Corporation	Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol	Fisher	BP2818-500
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4	Fisher	S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S671-3
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma	C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
XY PCR Primer	IDT	N/A
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP2482-1
1% Ethidium bromide solution	Fisher	BP1302-10	Toxic
Agarose	GeneMate	E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	367176-2.5KG
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions	Thermo Scientific	R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer	Denville	CB-4050-3
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500	Toxic
FluorMount-G	Southern Biotech	0100-01
Hydrogen Chloride (HCl)	Fisher	A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation	Bioexpress	0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered	Fisher	03-600-511	Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered	Sigma	D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem	EMD Millipore	676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody	Millipore	AB5535	Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody	BD Pharmingen	553370	Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signaling	9661S	Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)	Life Technologies	13-1900	Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen (Molecular Probes)	H1399	Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-165-153	Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A31572	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21206	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21208	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Life Technologies	A31573	Use at dilution: 1:500