Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Riepilogo

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Abstract

Indagare organogenesis in utero è un processo tecnicamente impegnativo in mammiferi placentati a causa dell'inaccessibilità di reagenti di embrioni che si sviluppano all'interno dell'utero. Un metodo di coltura delle gocce di nuova concezione ex vivo verticale fornisce una valida alternativa a studi effettuati in utero. L'ex vivo cultura gocciolina offre la possibilità di esaminare e manipolare interazioni cellulari e vie di segnalazione diverse attraverso l'uso di vari composti di blocco e attivazione; Inoltre, gli effetti di vari reagenti farmacologiche sullo sviluppo di organi specifici possono essere studiati senza effetti collaterali indesiderati di somministrazione di farmaci sistemici in utero. Rispetto ad altri sistemi in vitro, la cultura gocciolina consente non solo la capacità di studiare le interazioni tridimensionale morfogenesi e cellula-cellula, che non può essere riprodotto in linee cellulari di mammifero, ma richiede anche molto meno reagents di altri ex vivo e in vitro. protocolli Questo documento dimostra mouse corretta fetale dissezione organo e verticali tecniche di coltura gocciolina, seguito da tutta immunofluorescenza organo per dimostrare l'efficacia del metodo. La gocciolina metodo di coltura ex vivo permette la formazione di architettura organo paragonabile a quello osservato in vivo e può essere utilizzato per studiare processi altrimenti difficili da studio causa letalità embrionale in modelli in vivo. Come sistema domanda di modello, un inibitore piccola molecola sarà utilizzato per sondare il ruolo della vascolarizzazione nella morfogenesi testicolare. Questo droplet metodo di coltura ex vivo è espandibile fino a altri organi fetali, come polmone e potenzialmente altri, anche se ogni organo deve essere ampiamente studiata per determinare eventuali modifiche organo-specifiche al protocollo. Questo sistema di coltura di organi fornisce la flessibilità nella sperimentazione con organi fetali, e risultati richiederlod utilizzando questa tecnica aiuterà i ricercatori Acquisire conoscenze in sviluppo del feto.

Introduzione

La rigenerazione di organi in vivo nell'uomo è molto limitata; di conseguenza, l'ingegneria dei tessuti, lo sviluppo di tessuti e organi da cellule individuali donati da un host, sta diventando una terapia potenziale interessante per la sostituzione degli organi. Tuttavia, per questa strategia terapeutica per avere successo, i fattori e le interazioni cellulari coinvolti nella morfogenesi dell'organo devono essere accuratamente studiati e ben compresi. A causa della incapacità di studiare lo sviluppo di organi specifici con approcci tradizionali, i ricercatori si sono rivolti a embrione intero alternativa o intere culture d'organo. Kalaskar et al. ¹ hanno dimostrato che ex vivo cultura tutto l'embriogenesi produce risultati comparabili (nel 58% degli embrioni coltivati) per lo sviluppo nell'utero, suggerendo che ex vivo metodi di coltura sono un'alternativa fattibile per gli studi dell'organogenesi.

Un sistema di coltura organo individualizzato, come questo ex vivo droplet sistema di coltura, consente intera analisi organo indipendente dagli effetti sistemici, pur consentendo manipolazione di un percorso di segnalazione specifica o interazioni cellulari tramite aggiunta di reagenti farmacologici o anticorpi. Tradizionalmente, lo studio di sviluppo degli organi fetali è stata limitata alle tecnologie transgeniche e di topi knockout, in aggiunta ai reagenti farmacologici consegnati materna. Tuttavia, ci sono questioni tecniche che coinvolgono queste tecniche e trattamenti in vivo; la maggior parte delle preoccupazioni ruotano attorno gli effetti di influenzare vari organi contemporaneamente che spesso si traduce in letalità embrionale. Un ulteriore problema degli studi di manipolare sviluppo fetale farmacologicamente è l'effetto materno di farmaci in sviluppo embrionale in utero (ad esempio, il metabolismo materno della droga prima che raggiunga l'embrione) e se tali reagenti possono passare attraverso la barriera placentare.

La tecnica di tutta la cultura organo descrittaqui è stato adattato da un primo protocollo descritto da Maatouk et al. ^2, in cui interi gonadi fetali sono incubati in ex vivo culture gocciolina verticali. Un vantaggio significativo di coltura gonadi fetali è che gli inibitori piccole molecole possono facilmente accedere tutto l'organo per semplice diffusione. . DeFalco et al hanno dimostrato che utilizzando questo metodo ex vivo gocciolina cultura in combinazione con inibitori di piccole molecole può essere usato per studiare processi e interazioni che avvengono durante lo sviluppo delle gonadi ³ segnalazione; questi processi sarebbe difficile per esaminare in vivo a causa di problemi tecnici (ad esempio, il passaggio dei farmaci attraverso la placenta o letalità di incidere più organi che utilizzano approcci genetici e farmacologici).

La cultura gocciolina non è solo un miglioramento in alcuni aspetti oltre in utero sperimentazione, ma anche che è un miglioramento rispetto in vitro ed ex visistemi vo pure. L'uso di linee cellulari per studiare morfogenesi è estremamente difficile perché mancano i tipi cellulari diversi, mancano matrice extracellulare (ECM) componenti critici che permettano la formazione di architettura organo, e può esibire effetti in cascate di segnalazione. Anche se l'ingegneria dei tessuti ha introdotto notevoli miglioramenti nella creazione di ponteggi che simulano ECM, la mancanza di conoscenza per quanto riguarda i segnali che sono richieste da ogni tipo di cellula durante l'organogenesi rende difficile costruire un sistema di organi in vitro. Altri sistemi ex vivo sono stati precedentemente stabiliti per studiare organogenesi, o più specificamente morfogenesi, e hanno avuto molto successo per l'imaging dal vivo di organi fetali in agar ^4, transwells ^5, filtri ^{6 e} altre matrici ponteggio ^7,8. Il vantaggio del sistema di coltura goccia è che permette lo studio della morfogenesi, fornendo la capacità di utilizzare meno reattivi, che sono oFten costoso, ma dando anche la tensione superficiale organo, che è importante per la crescita e di segnalazione capacità ^9.

Nel topo, del testicolo morfogenesi iniziale si svolge tra embrionale (E) mette in scena E11.5 e E13.5; queste fasi comprendono la finestra temporale ottimale per l'esame i fattori che influenzano la differenziazione sesso-specifici. Tra i processi critici che si verificano durante la formazione del testicolo sono la generazione dell'architettura cavo testicolo e la formazione di una rete vascolare specifico testicolo. Utilizzando questo ex vivo tutto l'organo sistema di coltura gocciolina, si è in grado di alterare vascolarizzazione maschio-specifica e inibire testicolo morfogenesi attraverso l'uso di un inibitore piccola molecola che blocca l'attività dei recettori per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF); VEGF-mediata rimodellamento vascolare è fondamentale per lo sviluppo del testicolo ^10-12. Questa tecnica può essere applicata con successo ad altri organi e può bersagliare tempo specificofinestre di sviluppo. Whole-mount di imaging organo permette la visualizzazione di strutture vitali così come i cambiamenti strutturali e cellulari conseguenti alla somministrazione di vari inibitori. È importante sottolineare che questo sistema è vantaggioso in quanto il ricercatore può ignorare i potenziali effetti confondenti di somministrazione del farmaco materna o interruzione sistemico durante vivo strategie genetiche in mirate. Quindi, tutto questo organo ex vivo sistema di coltura delle gocce può migliorare significativamente la capacità di comprendere le interazioni e le segnalazioni che si verificano in particolare all'interno di particolari organi durante lo sviluppo fetale.

Protocollo

Tutti i topi utilizzati in questi studi erano topi CD-1 ottenuti da Charles River Laboratories. Cultura Precedenti esperimenti sono stati eseguiti su altri ceppi, quali C57BL / 6J (dati non mostrati), ma qualsiasi ceppo può essere utilizzato. Femmine adulte in stato di gravidanza sono stati di circa 2-3 mesi di vita e sono stati sacrificati tramite CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale e toracotomia bilaterale prima della rimozione embrione. I topi sono stati alloggiati in conformità alle linee guida NIH, e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale di Hospital Medical Center di Cincinnati per bambini.

1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti

1. Preparare una soluzione di etanolo al 70%. Acqua deionizzata Autoclave (per fare camere umidificati e per rendere / soluzioni diluizione). Sterilizzare strumenti di dissezione (pinze, forbici, e 27 G siringhe ad ago) a spruzzo verso il basso con il 70% di etanolo.
2. Preparare10X tampone fosfato salino (PBS) contenente calcio e magnesio (80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na ₂ HPO _4, 2,4 g KH ₂ PO _4, 6,75 ml di 1 M CaCl _2, 3,75 ml di 1 M MgCl ₂ ). Mescolare per sciogliere in 1 l di acqua in autoclave sterile e poi filtrare con carta da filtro. Diluire 10 volte con acqua per fare PBS 1X.
3. Calore inattivare siero fetale bovino (FBS), a 55 ° C per 30 min e filtro sterilizzare con un filtro a siringa da 0,22 micron.
4. Preparare 38 ml 1X terreno di coltura completo (chiamato completo DMEM, cDMEM), costituito da Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 10% filtrato diluizione inattivato al calore FBS e 1/100 di penicillina streptomicina magazzino. Questo di solito deve essere usato fresco, ma può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
5. Ricostituire il VEGFR tirosina chinasi Inhibitor II (TKI II) in DMSO per una concentrazione scorta di 5 mg / ml, e diluire azione con cDMEM per ottenere una soluzione di lavoro. L'aria finalecentrazione per questo studio è 1.875 mg / ml in cDMEM. Secondo le raccomandazioni della società, soluzioni madre sono stabili per un massimo di 6 mesi a -20 ° C. Per quanto riguarda le soluzioni di lavoro, fare fresco e utilizzare lo stesso giorno.
   Nota: La concentrazione di questo farmaco nella soluzione di lavoro dovrebbe essere due volte superiore alla concentrazione finale desiderata (dal momento che sarà diluito duplice in droplet). Allo stesso tempo, preparare lo stesso volume di cDMEM contenente lo stesso volume di DMSO per il trattamento "controllo".
6. Preparare i reagenti coda digestione (NaOH 50 mM e 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) separatamente in acqua distillata.
7. Fare un bilancio dei primer XY PCR 25 micron (XY Forward 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'e XY Reverse 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') insieme in acqua priva di nucleasi.
8. Preparare tampone 50X TAE (242 g Trizma Base, 57,1 ml acido acetico glaciale, 100 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,5, e aggiungere acqua per 1 L fiil volume finale). Preparare 1X tampone di corsa TAE (20 ml 50X TAE diluito con acqua a 1 L volume totale).
9. Per creare una soluzione di 2,5% di agarosio (0,625 g di agarosio, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml di acqua), soluzione di agarosio calore nel forno a microonde fino a ebollizione, poi lasciate raffreddare fino a circa 55-65 ° C (in grado di toccare). Una volta fredda, aggiungere 2 ml di 1% soluzione di bromuro di etidio, e versare il gel.
   ATTENZIONE! Etidio bromuro è un agente mutageno e teratogeno; si prega di utilizzare guanti di nitrile e corretto protocollo di sicurezza durante la manipolazione. In alternativa, possono essere utilizzati altri agenti gel risolvere potenzialmente meno tossici o coloranti.
10. Preparare la soluzione di saturazione (PBS con Triton X-100, siero 0,1% 10% fetale bovino [FBS], e il 3% di albumina sierica bovina [ASC]) per immunofluorescenza.
11. Preparare la soluzione di lavaggio (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% FBS e 3% BSA) per immunofluorescenza.
12. Preparare PBTx (PBS con 0,1% Triton X-100) per immunofluorescenza.
13. Preparare le camere di incubazione per culture. Riempire grandi piatti (diametro 100 mm) di Petri con 35 ml di acqua in autoclave. Posizionare vicino a dove saranno eseguite dissezione e culture.

2. Isolamento di fetale testicoli da Mus musculus

1. Controllare il mouse femminile per tappi vaginali ogni mattina. Mezzogiorno del giorno in cui viene rilevato il tappo vaginale è considerato E0.5. Eutanasia la femmina incinta mouse E11.5, in modo coerente con i protocolli animali approvati.
2. Spray giù addome del mouse con il 70% di etanolo.
3. Aprire la pelle del ventre e del peritoneo con un'incisione a forma di V con le forbici fini e tirare indietro lembo di tessuto per esporre gli organi interni.
4. Individuare le ovaie ad entrambe le estremità del corno uterino. Utilizzando le forbici, tagliare a dell'ovaio e del tessuto connettivo di separare l'utero contenente gli embrioni dal corpo della madre.
5. Aprire la parete uterina tagliando delicatamente il lato opposto della placenta, esponendo i sacchi di tuorlo. Essere attenti a non puncture sacco vitellino per evitare embrioni danneggiare o perdere.
6. Tagliare vicino alla placenta per rimuovere le sacche tuorlo-embrione contenente e metterli in un piatto contenente PBS con calcio e magnesio. La presenza di ioni calcio e magnesio contribuirà a molecole di adesione cellula di sostegno per mantenere l'architettura dei tessuti e prevenire il tessuto di attaccarsi agli strumenti di dissezione.
7. Con una pinza, togliere il sacco vitellino e amnion dall'embrione perforando con attenzione il sacco vitellino di creare un buco in cui l'embrione può scivolare fuori. Una volta che l'embrione è all'esterno del sacco vitellino, tagliare il cordone ombelicale.
8. Da questo punto in avanti, utilizzare un microscopio situato in una cappa coltura tissutale sterili. Togliere la testa di embrione e scartare pizzicando con una pinza su entrambi i lati del collo.
9. Rimuovere la coda e riporre in nuova provetta per l'analisi PCR XY per determinare il sesso dell'embrione.
   Nota: Mentre è ottimale per gonadi coltura più presto possibile dopo la raccolta, è anche posbile togliere DNA coda ed eseguire XX / XY genotipizzazione prima coltura, in modo che il sesso di ciascun embrione è nota e solo il sesso desiderato deve essere coltivato. Mentre la genotipizzazione è stato fatto, gli embrioni possono essere tenuti separati (in modo che possano essere seguiti) a 4 ° C o in ghiaccio fino al momento per la cultura. Un avvertimento è che questo periodo al di fuori delle condizioni di utero o di coltura può potenzialmente influenzare la vitalità della cultura o successivo sviluppo durante la coltura.
10. Fissare l'embrione in posizione supina contro il fondo del piatto cultura appuntando le ascelle di embrione con un paio di pinze (solitamente il forcipe tenuto in mano debole). Mantenere queste pinze in atto per tenere l'embrione ancora durante l'intero processo di dissezione.
11. Con altro paio di pinze, togliere la pelle che copre l'addome e rimuovere delicatamente il fegato, l'intestino e altri organi per esporre parete posteriore del corpo.
12. Come gonadi saranno situati sulla parete di fondo del corpo su entrambi i lati della aorta dorsale,un grande vaso sanguigno che corre lungo la linea mediana del corpo, paletta sotto la cresta urogenitale con una pinza chiuse e rimuovere la cresta urogenitale aprendo le pinze e sollevandolo. Come le gonadi saranno liberamente fissati alla parete, fare attenzione a non tirare troppo in fretta senza togliere queste connessioni o le gonadi possono allungare, causando danni agli organi.
13. Spostare la cresta urogenitale in cDMEM in un piatto per acclimatare il tessuto ai media.
14. Separare il complesso gonade-mesonefro dal resto della cresta urogenitale con 27 aghi G. Utilizzare un ago per tagliare premendo verso il basso, e utilizzare l'altro per guidare correttamente il tessuto per consentire la separazione ottimale. Evitare di utilizzare un movimento di taglio contro il fondo piatto, come aghi taglienti creerà schegge di plastica che possono attaccare al tessuto. Assicurarsi di mantenere le mesonefro completamente attaccato al gonade.

3. Coltura di gonadi con un inibitore della piccola molecola

1. Impostare due 20 μl pipette a 15 microlitri ciascuno. Tagliare a 1-2 mm fuori da una delle punte barriera pipetta usando una, lametta sterilizzata pulita per il trasferimento delle gonadi e l'aggiunta di controllo cDMEM, mentre l'altra pipetta saranno utilizzati esclusivamente per la droga trattati cDMEM.
2. Allineare gonadi con il loro asse lungo parallelo alla punta della pipetta in modo che possano facilmente essere pipettati usando la punta di cut-off. Fare attenzione di gonadi che attaccano all'interno del puntale.
3. Etichettare un lato come la goccia di controllo e l'altro come droplet-contenente il farmaco. Solo due gocce possono stare su un coperchio piatto da 35 mm. Assicurarsi che le etichette sui coperchi corrispondono le etichette sulle provette da microcentrifuga-tail-tessuto contenente.
4. Pipettare 15 ml di cDMEM contenenti una singola gonade in una goccia nel coperchio di una piccola (35 mm) piatto di coltura (utilizzare solo le palpebre, come i fondi sono troppo alti per adattarsi all'interno di una camera umidificata capsula di Petri). Mettere due gocce-gonadi contenente separati su entrambi i lati del piatto, fr ben separati,uno om un'altra. Controllare al microscopio per garantire che le gonadi sono state trasferite le goccioline.
5. Per la goccia designato come il controllo, aggiungere altri 15 ml di cDMEM contenenti DMSO (made in fase 1.5) per fare una goccia con un volume totale di 30 microlitri. Utilizzare solo la pipetta "di controllo", che non si metterà in contatto il farmaco.
6. All'altro droplet (droga campione trattato), aggiungere 15 ml di TKI-II contenente cDMEM fare una gocciolina con un volume totale di 30 microlitri. Usare solo la pipetta designato per i campioni trattati con farmaci.
7. Utilizzando la pipetta, sparsi le goccioline in un modello circolare in espansione fino a circa 15-18 mm di diametro e gonade si trova all'incirca a metà. Orientare gonade modo che si trova su un lato e gonade e mesonefro sono facilmente distinguibili. Orientare il polmone in modo che i due lobi distesi.
   1. Anche se il diametro delle gocce può variare leggermente, in modo che le gonadi non sono floating e sono tenuti in posizione da tensione superficiale. Assicurarsi che le goccioline non si tocchino tra loro o il lato del coperchio. Senza la tensione superficiale, gli organi cresceranno sul coperchio durante la cultura e appiattire distorcendo organo morfologia.
8. Posizionare accuratamente il coperchio piatto di coltura contenente goccioline verticalmente sulla superficie dell'acqua nel grande (100 mm) piatto umidificatore. Assicurarsi che non ci siano bolle intrappolate sotto il fondo del coperchio e che sia ben distesi sulla superficie dell'acqua. Non invertire il coperchio e fare attenzione a non lasciare che l'acqua tocca la parte superiore del coperchio dove si trovano le goccioline.
9. Per creare una piccola camera umidificata, coprire immediatamente con il coperchio del piatto dell'umidificatore più grande per racchiudere le culture gonade. Agire il più rapidamente possibile per minimizzare l'evaporazione dei media. Assicurarsi che il piatto più piccola ha spazio tra essa e il coperchio del piatto più grande per muoversi liberamente; in caso contrario, condensa può fare un sigillo e bricambio d'aria serratura al tessuto.
10. Una volta due piccoli coperchi sono poste nella camera, inserire immediatamente la camera nell'incubatrice. Incubare le culture delle gocce per 48 ore in un umidificata _incubatore CO 2 a 37 ° C.

4. Polymerase Chain Reaction per la determinazione del sesso degli embrioni

1. Aggiungere le code embrionali di fondo di un tubo da microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Aggiungere a ciascuna provetta 200 ml di NaOH 50 mM.
3. Posizionare a 95 ° C per 15 minuti o fino a quando il tessuto è completamente sciolto.
4. Aggiungere 50 ml di 1 M Tris-HCl e vortice leggermente e brevemente.
5. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, fare un nuovo master mix PCR moltiplicando ogni volume per il numero totale di campioni: 0.5 ml 25 micron soluzione Primer, 2,5 microlitri 10X Taq Buffer, 0,5 microlitri dNTP 10 mm (nucleotidi), 19.3 ml nuclease- acqua gratuita, 0,2 microlitri DNA polimerasi Taq. Mescolare bene.
6. Aggiungere 23ml di PCR master mix PCR tubi contenenti 3 ml lisato di code digerito.
7. Tubi Flick mescolarli, quindi eseguire una breve centrifuga per portare i campioni al fondo della provetta.
8. Eseguire il programma XY (Short) PCR (Tabella 1).
9. Caricare i campioni (con 5x colorante) e scala in un gel di agarosio 2,5% in tampone TAE 1X.
10. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio fino bande XX e XY possono essere risolti.
11. Immagine il gel con l'immagine cattura la luce UV e.
12. Analizzare il vs bande specifiche del cromosoma Y X-specifico cromosoma (cromosoma X = 331 paia di basi [bp] e XY = 302 bp) ^13; XY campioni (maschi) avranno due bande di 331 e di 302 bp, mentre i campioni XX (femmina) apparirà come una singola banda 331 bp.

5. Tutta immunofluorescenza Monte Organo

Giorno 1:

1. Rimuovere le gonadi della cultura con una pipetta 1000 ml con una punta di cut-off. Se lo si desidera, possono esserecollocato in un piatto di PBS per lavare media e di reagenti. Mettere in PBS in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. Il tubo di dimensioni inferiori conserverà reagenti e rendere più facile per tenere traccia dei campioni nel tubo.
   1. Essere sicuri di mantenere il controllo e campioni trattati, così come campioni XX e XY, in tubi separati e rimuoverli dalla cultura con gruppi separati di pipette per evitare la contaminazione potenziale farmaco.
2. Lavare le gonadi due volte con PBS. Da questo punto in poi, questo protocollo può utilizzare 1X PBS privo di calcio e magnesio. Lavarli, consentono gonadi a depositarsi sul fondo della provetta (per gravità) e quindi rimuovere il liquido sopra. Fare attenzione a non perdere gonadi pipettando troppo vicino a loro.
3. Rimuovere il più possibile PBS dal tubo. Aggiungere 250 ml di 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,1% Triton X-100, e lasciate incubare O / N a 4 ° C su un agitatore meccanico. In alternativa, questa fissazione può essere fatto per 2 ore a 4 ° C su un agitatore meccanico. ATTENZIONE! Paraforformaldeide è una sostanza tossica, in modo da seguire il protocollo di sicurezza durante la manipolazione.

2 ° giorno:

4. Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx a temperatura ambiente.
5. Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
6. Bloccare le gonadi almeno 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
7. Macchiare le gonadi O / N a 4 ° C su una sedia a dondolo in 250 microlitri anticorpo primario diluito in Blocking Solution.

3 ° giorno:

8. Sciacquare le gonadi due volte in 250 ml Soluzione di Lavaggio.
9. Lavare le gonadi 3 volte con 250 microlitri soluzione di lavaggio per 10 minuti ciascuno a RT su una sedia a dondolo.
10. Bloccare le gonadi 1 ora a 250 microlitri soluzione bloccante a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
11. Coprire il provetta con un foglio di alluminio per proteggere anticorpi secondari fluorescenti dalla luce.
12. Incubare le gonadi 2-4 ore a temperatura ambiente su arocker in 250 microlitri anticorpo secondario diluito in Blocking Solution contenente Hoechst 33342. In alternativa, eseguire anticorpo secondario e Hoechst 33342 incubazione O / N a 4 ° C sull'attuatore.
13. Sciacquare le gonadi due volte in 250 microlitri PBTx.
14. Lavare le gonadi 3 volte in 250 microlitri PBTx per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su una sedia a dondolo.
15. Usando un puntale di cut-off, il trasferimento gonadi su un vetrino con liquido minimo. Rimuovere il liquido in eccesso con la pipetta, ma fare in modo che il tessuto non si asciughi.
16. Orientare le gonadi in modo desiderato con una pinza, e aggiungere rapidamente una goccia di supporti di montaggio per montare le gonadi sulla diapositiva. Assicurarsi che le mani di montaggio dei media tutti i campioni completamente; è fondamentale per evitare di lasciare i campioni asciugarsi.
17. Utilizzare i coprioggetti (numero 1,5 stile) di dimensioni adeguate per coprire delicatamente i campioni. Lasciate che il montaggio dei media diffusione di contattare l'intera superficie del vetrino. Se necessario, premere molto leggermente sugli angoli del coprioggetto in modo chenon ci sono grosse bolle d'aria.
18. Sigillare i vetrini con smalto trasparente intorno ai bordi per ridurre l'evaporazione del mezzo di montaggio. Conservare diapositive montate al buio a 4 ° C.

Risultati

L'ex vivo cultura gocciolina permette di manipolare interi organi, come la gonade, per studiare le interazioni e le dinamiche cellulari. La Figura 1 mostra in modo graduale come preparare una cultura E11.5 gonadica goccia. I primi passi nel protocollo coltura comprendono la rimozione iniziale del utero-embrione contenente dal mouse madre (Figura 1A e 1B). Dopo la rimozione dell'utero dalla madre, la parete uterina viene tagliato e gli embrioni vengono liberati dal sacco...

Discussione

Questo studio dimostra un intero metodo gocciolina organo ex vivo che ha molte potenziali applicazioni per lo studio dello sviluppo del feto. Questa tecnica può essere utilizzata per più organi, e permette al ricercatore di affrontare questioni biologiche che sono difficili da valutare in vivo utilizzando approcci a causa dell'inaccessibilità di embrioni e potenziale letalità embrionale. Questo metodo di coltura ha ulteriori vantaggi rispetto ad altri approcci in vitro come linee cellu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)	Fisherbrand	12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible	Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps	GeneMate	T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L	Gilson	FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
Fine Scissors	FST	91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes	Denville	C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips	Denville	P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles	BD PrecisionGlide	309623
10 ml syringe	BD	305559
0.2 μM PES syringe filter	VWR	28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm	Whatman	1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish	Falcon/Corning	353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator	Eppendorf	CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet	Nuare	NU-425-400
Mini-centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL	GeneMate	R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel	Eppendorf	950040015
SMZ445 stereomicroscope	Nikon	SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software	Alpha Innotech Corporation	Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol	Fisher	BP2818-500
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4	Fisher	S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S671-3
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma	M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma	C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
XY PCR Primer	IDT	N/A
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Fisher	BP2482-1
1% Ethidium bromide solution	Fisher	BP1302-10	Toxic
Agarose	GeneMate	E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	367176-2.5KG
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions	Thermo Scientific	R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer	Denville	CB-4050-3
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500	Toxic
FluorMount-G	Southern Biotech	0100-01
Hydrogen Chloride (HCl)	Fisher	A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation	Bioexpress	0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered	Fisher	03-600-511	Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered	Sigma	D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem	EMD Millipore	676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody	Millipore	AB5535	Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody	BD Pharmingen	553370	Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signaling	9661S	Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)	Life Technologies	13-1900	Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen (Molecular Probes)	H1399	Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-165-153	Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A31572	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21206	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A21208	Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Life Technologies	A31573	Use at dilution: 1:500