Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

Resumen

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Resumen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introducción

Los adenovirus contienen un genoma de doble cadena de ADN que se replica en el núcleo de la célula infectada. Cuando el ADN viral entra en el núcleo, se localiza adyacente a cuerpos nucleares de PML ^1. Después de la expresión génica viral temprana, la arquitectura nuclear se reorganiza de manera espectacular, inducir la formación de microambientes virales, denominado compartimentos de replicación viral (RC) ^2. Desde adenovirus (Ad) RC son sitios donde la replicación del genoma viral y la expresión de genes tardíos virales tienen lugar, que proporcionan un entorno para el reclutamiento de todos los factores virales y celulares necesarias que participan en estos procesos. Curiosamente, una variedad de proteínas celulares responsables de la respuesta antiviral celular, tales como la respuesta al daño del ADN, la respuesta inmune innata y la supresión de tumores son cooptados a estos sitios virales ^2. Hubs reguladoras Por lo tanto, Ad RC se puede considerar que promueven la replicación viral eficaz, mientras que de forma concomitante la regulación de larespuesta antiviral celular, lo que indica que estas estructuras son la clave para la comprensión de las interacciones de células virus-huésped. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la formación de RC, su composición y actividades asociadas, son poco conocidos.

Adenoviral RC, así como RC de otros virus de ADN que se replican en el núcleo no están asociados a las membranas, en contraste con RC citoplasmática ^3. Por otra parte, estas estructuras inducidas por virus son susceptibles de ser compuesto en su totalidad de proteínas y ácidos nucleicos. RC formado en las células infectadas con los virus de ARN (generalmente denominado fábricas víricas) han sido aislados, tomando ventaja de su localización citoplasmática y el estado unido a la membrana, que ha facilitado su morfológica detallada, caracterización funcional y bioquímico ^4.

Para nuestro conocimiento, nuclear viral RC no se han aislado, tal vez debido a la complejidad de la arquitectura nuclear y la ausencia de m intranuclearembranes que facilitarían su aislamiento. Su estudio se ha basado más bien en microscopía de inmunofluorescencia, FISH y microscopía electrónica de transmisión. Sin embargo, a pesar de las complicaciones inherentes a aislar estructuras subnuclear, otros ámbitos nucleares como nucleolos y Cuerpos de Cajal se han aislado antes de ^5,6. Desde nucleolos y RC están ambas compuestas de proteínas y ácidos nucleicos, y tienen un diámetro entre 0.5 - 5 micras, la hipótesis de que RC también debe ser susceptible de aislamiento. Por lo tanto, con el fin de caracterizar con más precisión la composición molecular y funciones asociadas a RC, establecimos un nuevo método para aislar fracciones enriquecidas con subnuclear RC. Con este fin, hemos preparado fracciones sub-nuclear utilizando gradientes de velocidad y cojines de sacarosa similares a los procedimientos utilizados para aislar nucleolos ⁷ u otros dominios nucleares ⁶ y establecimos un sistema libre de células que permite el estudio de la composición molecular y actividades asociadas deRC. Por tanto, esta técnica debe avanzar en la comprensión de las interacciones celulares virus-huésped y representa una poderosa herramienta que también debe facilitar el análisis detallado de RC de otros virus que se replican en el núcleo e inducir la formación de compartimentos de replicación de dimensiones similares a las formadas en adenovirus las células infectadas, como, herpesvirus, papilomavirus o poliomavirus.

Protocolo

1. HFF Cultivo Celular y Ad-infección

1. Propagar virus Ad5 WT en monocapas de células HEK-293 y título como unidades formadoras de fluorescentes (FFU) sobre las células HFF tal como se describe anteriormente ^8.
2. Crecer fibroblastos de prepucio humano (HFF) en 10 ml de DMEM / 10% suero bovino fetal (FBS) en placas estériles de cultivo de 100 mm a 37 ºC y 5% de CO ₂ en un incubador humidificado. Determinar el número de células usando una cámara de Neubauer contando las células en los cuatro conjuntos de 16 cuadrados. El número de células por ml se obtiene mediante el cálculo del número medio de células en los cuatro conjuntos de 16 cuadrados y multiplicando este número por 10 ^4. Para cada tiempo después de la infección incluido en el paso 1.3, use 1 x 10 ⁷ células HFF.
3. Mock-infectar o infectar células HFF con adenovirus tipo 5 (Ad5) de tipo salvaje (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ en 100 mm platos de cultivo de tejidos utilizando 1 ml de Ad5 en DMEM por plato en una MOI de 30 Focus Forming Unidad o FFU , por célula. Incubar durante 2 horas en ahumidified incubadora de cultivo celular a 37 ºC y 5% de CO _2, meciéndose cuidadosamente los platos cada 15 minutos para asegurar la distribución homogénea del inóculo del virus sobre las células. Después de este tiempo, retirar el medio y añadir DMEM suplementado con 10% de SFB y se incuba durante 16, 24 o 36 horas en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 ^º C y 5% de CO _2. Continúe con el paso 2.1.

2. Preparación de las fracciones Sub-nuclear Enriquecido con adenovirus RC

1. Infectados Ad5-cosecha o células HFF falsamente infectadas con un raspador de células y recoger las células en tubos de centrífuga estériles. Determinar el número de células como en el paso 1.2. Utilice 1 x 10 ⁷ células por cada vez que después de la infección se especifica en el paso 1.3.
2. Centrifugar las células a 220 xg, 4 ° C durante 5 min.
3. Resuspender el sedimento celular en PBS enfriado con hielo (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ y 1,8 mM KH ₂ PO _4). Sedimento celular Washs 3 veces con 5 ml de helado de PBS por lavado. Para ello, centrifugar las células a 220 xg, 4 ° C durante 5 minutos, decantar y desechar el sobrenadante (SN), y volver a suspender el sedimento celular por pipeteo suave.
4. Para interrumpir la membrana plasmática, resuspender el sedimento celular en 700 mu l de tampón hipotónico enfriado con hielo (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl _2, DTT 0,5 mM, 20 μ g / ml fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) , una mezcla de cisteína, serina, treonina y los inhibidores de la aspartil proteasa incluyendo 10 μ g / ml de inhibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A y 10 μ g / ml N acetil-L-leucil-L-leucil-L -argininal) y dejar que las células se hinchan en hielo durante 3 horas.
5. Lyse las células usando un homogeneizador con una mano de mortero tipo teflón holgada. Realizar 80 Dounce golpes y muestras del monitor cada 20 golpes por microscopía de campo claro para garantizar que todas las células se han lisado, pero que los núcleos tienen not sido dañado o roto.
6. Centrifugar el homogeneizado celular a 300 xg, 4 ° C durante 5 min. Almacenar el SN como la fracción citoplasmática a -20 ºC en un tubo de centrífuga.
7. Para eliminar los desechos celulares a partir de núcleos, resuspender el precipitado en 750 μ l de solución 1 (S1) (0,25 M de sacarosa, 10 mM de MgCl _{2 20} mu g / ml PMSF, una mezcla de cisteína, serina, inhibidores de la treonina y la aspartil proteasa incluyendo 10 μ g / ml de inhibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A y 10 μ g / ml N acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal) y la capa sobre un volumen igual de solución de 2 (S2) (0,35 M de sacarosa, 0,5 mM de MgCl _2, 20 μ g / ml PMSF, una mezcla de cisteína, serina, inhibidores de la treonina y la aspartil proteasa incluyendo 10 μ g / ml de inhibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A y 10 μ g / ml N acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal). Centrifuge a 1.400 xg, 4 ° C durante 5 min.
8. Deseche el SN utilizando una micropipeta. Evite perturbar el sedimento.
9. Resuspender el sedimento que contiene núcleos aislados en 750 μ l de S2.
10. Para aislar fracciones subnucleares enriquecidos con adenovirus RC (RCF), sonicado se volvieron a suspender los núcleos con un baño de ultrasonidos, utilizando dos pulsos 5 min, o hasta que todos los núcleos son lisadas como se observa por microscopía de campo claro. Utilice hielo en baño ultrasónico, según sea necesario para mantener las muestras en o por debajo de 4 ° C.
11. Capa de los núcleos sonicadas sobre un volumen igual de solución de 3 (S3) (0,88 M de sacarosa, 0,5 mM de MgCl ₂₎ y centrifugar a 3000 xg, 4 ° C durante 10 min. Guarde el 1,5 ml de sobrenadante como la fracción nucleoplasmic (NPL) a -70 ºC. Resuspender el precipitado en 700 μ l de S2 y tienda como RCF a -70 ºC.

3. Los análisis Western Blot de RCF

NOTA: Para el análisis Western Blot de morosidad y RCF fracciones set lado 640 mu l para Npl y 300 μ l de RCF a partir del volumen total obtenido en el paso 2.11.

1. Mezclar 15 μ l de cada fracción subnuclear en 2x tampón de Laemmli (4% SDS, 20% de glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, 0,004% de azul de bromofenol, 0,125 M Tris HCl pH 6,8) y se deja hervir a 95 ºC durante 5 min. Cargar las muestras en una electroforesis en 10% de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) gel desnaturalizante y las proteínas separadas durante 1,5 h, a 20 miliamperios (mA).
2. Transferencia de proteínas por electrotransferencia durante 1,5 horas a 400 mA en difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas.
3. Bloquear la membrana durante 2 horas a RT utilizando leche seca sin grasa 3% en PBS.
4. Incubar O / N a 4 ºC con el anticuerpo primario contra la proteína viral de unión al ADN E2A (B6-8 ⁹⁾ a una dilución 1: 500 en leche en polvo PBS / 0,3% sin grasa.
5. Membrana Lavar 3 veces con PBS / Tween 20 0,1% durante 10 min.
6. Incubar la membrana con un ratón anti IgG secundariatibody acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución 1: 10.000 en PBS durante 2 horas a RT.
7. Lavar la membrana 3 veces con PBS / Tween 20 0,1% durante 10 min.
8. Desarrollar la membrana mediante un aumento de quimioluminiscencia y películas de rayos X.

4. Viral Detección de ADN en el marco de cooperación regional

NOTA: Para el aislamiento de ADN de ambas fracciones de morosidad y RCF, utilice 210 μ l para Npl y 100 μ l de RCF del volumen total obtenido en el paso 2.11.

1. Incubar fracciones sub-nucleares durante 1 hora a 55 ºC con 1 mg / ml de proteinasa K y 0,5% de Tween 20.
2. Inactivar proteinasa K mediante incubación de las muestras durante 10 min a 95 ° C.
3. Centrifugar las muestras a 20.000 xg, a temperatura ambiente durante 2 min.
4. Recoger el SN. Precipitar el DNA con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M y un volumen de isopropanol, O / N a 4 ° C.
5. Centrifugar las muestras a 20.000 xg, a temperatura ambiente durante 10 min.
6. Deseche la u SNcantar una micropipeta. Lavar el sedimento con etanol al 70% y centrifugar a 20.000 xg, 4 ° C durante 5 min.
7. Resuspender el ADN en 10 μ l de 10 mM Tris-HCl pH 7,4
8. Cuantificar el ADN usando un espectrofotómetro mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 260 nm.
9. Para amplificar el ADN viral, utilice 100 ng de ADN de cada fracción subnuclear en una reacción de PCR estándar usando ADN polimerasa Taq en 25 μ l de volumen de reacción con los cebadores que permiten la amplificación de una región dentro de la unidad de transcripción tardía Major, desde el nucleótido 7273 a nucleótido 7353 (81 pb) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Use las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial de 3 min a 95 ºC, seguido de 20 ciclos de amplificación (1 min a 95 ºC, recocido durante 1 min a 62 ºC y extensión durante 30 segundos a 72 ºC) y una etapa de extensión final de 3 min a 72 ºC.
10. Ejecute el producto de PCR en geles de agarosa al 2%, a 90 V. manchas con etidiobromuro de 0,5 μ g / ml concentración final y visualizar el ADN para corroborar el enriquecimiento de ADN viral en el marco de cooperación regional. Maneje bromuro de etidio con extrema precaución y siempre asegúrese de usar guantes, ya que este compuesto es un mutágeno potente. Deseche bromuro de etidio de acuerdo con las directrices institucionales.

5. Late Viral Detección de mRNA en RCF

NOTA: Para el aislamiento de ARN de las dos fracciones de morosidad y RCF, utilice 640 μ l para Npl y 300 μ l de RCF a partir del volumen total obtenido en el paso 2.11.

1. Aislar el ARN a partir de fracciones subnuclear utilizando Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resuspender el ARN en 50 μ l de DEPC (diethilpyrocarbonate) de agua tratada.
2. Cuantificar el ARN utilizando un espectrofotómetro para medir la DO a 260 nm (se obtienen aproximadamente 3 μ g). Guarde el ARN en 50 ng / mu l alícuotas a -70 ºC.
3. Compruebe ARN purificadopor la ausencia de contaminación de ADN mediante la realización de una reacción de PCR de control en ausencia de transcriptasa inversa (RT), usando 5 ng de ARN total y las condiciones de ciclo descrito en el paso 4.9.
   1. Si la contaminación de ADN está ausente no amplicón debe ser producido. Si la contaminación de ADN está presente, incubar las muestras con 10 U de DNasa I, 10 U de inhibidor de RNasa, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl y 15 mM de MgCl ₂ durante 30 min a 37 ºC. Proceda para volver a aislar el ARN como en el paso 5.1.
4. Para analizar mRNA viral asociado al RCF, amplificar 100 ng de RNA de cada fracción subnuclear por RT-PCR usando cebadores diseñados para detectar mRNA tarde adenoviral de diferentes familias de genes (Tabla 1).
   1. Para la transcripción inversa (RT), utilice 100 ng de ARN, de cada fracción subnuclear en una reacción estándar utilizando la enzima RT M-MuLV RT en 20 μ l de volumen de reacción durante 1 hora a 42 ºC y 10 min a 70 ºC.
   2. Para la amplificación, utilizar 1μ l del cDNA en las reacciones de PCR, como en el paso 4.9. Use las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial de 3 min a 95 ºC, seguido de 25 ciclos de amplificación (1 min a 95 ºC, recocido durante 1 min a la temperatura especificada en la Tabla 1 y la extensión durante 30 segundos a 72 ºC) y una paso de extensión final durante 3 minutos a 72 ºC.
5. Ejecute los productos de RT-PCR en geles de agarosa al 2%, en 90 geles V. mancha con bromuro de etidio a 0,5 μ g / ml concentración final y visualizar corroborar viral asociación finales ARNm al RCF. Maneje bromuro de etidio como se indica en el paso 4.10.

6. La inmunofluorescencia Visualización de RCF

NOTA: El equipaje de este procedimiento bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las muestras con las partículas de polvo, y filtrar todas las soluciones antes de su uso.

1. Spot 5 mu l de la fracción RCF obtenido en el paso 2.10 gravectly en un portaobjetos recubiertos con silano.
2. Deje que el punto seco durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Re-hidratar lentamente e indirectamente pipetear 500 μ l de PBS en una gota al lado del punto de RCF y dejar que fluya por la inclinación del tobogán. Escurrir el exceso de PBS desde el lado.
4. Bloquear cubriendo la muestra con 500 μ l de PBS / 5% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 2 horas a RT.
5. Lave la diapositiva 3 veces suavemente e indirectamente pipetear 500 l μ de PBS sobre la muestra. Incline la diapositiva para drenar el exceso de PBS.
6. Incubar la muestra con el anticuerpo primario contra la proteína de unión al ADN viral E2A (B6-8 ⁹⁾ a una dilución 1: 500 en PBS durante 2 horas a RT. Cubrir la muestra manchada con 20 μ l de la solución de anticuerpo y se incuba en una cámara húmeda para evitar el secado.
7. Lavar la muestra 3 veces con PBS / 0,02% de Tween 20 por suavemente e indirectamente pipeteando 500 μ l de PBS sobre la muestra. Incline la diapositiva para drenar el exsolución de lavado proceso.
8. Se incuban las muestras con el ratón anti anticuerpo secundario IgG acoplado a un fluoróforo que se excita a 488 nm en una dilución 1: 2000 en PBS, durante 1 hora a 4 ºC. Cubrir la muestra manchada con 20 μ l de la solución de anticuerpo y se incuba en una cámara húmeda para evitar el secado.
9. Lavar la muestra 3 veces con PBS / 0,02% de Tween 20 por suavemente e indirectamente pipeteando 500 μ l de PBS sobre la muestra. Incline la diapositiva para drenar el exceso de solución de lavado.
10. Cubrir la muestra manchada sobre el portaobjetos con un cubreobjetos usando 2 μ l de PBS / 10% de glicerol como medio de montaje. Selle con esmalte de uñas transparente y almacenar al -20 ºC.
11. Analizar las muestras usando un microscopio de fluorescencia, con un objetivo 63x y un 1,4 Apertura numérica (NA) a una longitud de onda de 488 nm.

Resultados

Puesto que los compartimentos de replicación viral (RC) son estructuras inducidas por virus subnuclear compuestas de proteínas y ácidos nucleicos, similar a otros dominios nucleares, que resultó ser susceptible de aislamiento mediante gradientes de velocidad en base a características bioquímicas. Los pasos críticos en el protocolo de fraccionamiento se ilustran en la figura 1. En cada paso las muestras deben ser supervisados ​​por microscopía de campo claro para garantizar la integridad de l...

Discusión

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080