Isolation des fractions de sous-nucléaire réplication virale Compartiment enrichies d'adénovirus-infectés cellules humaines normales

Résumé

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Résumé

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introduction

Les adénovirus contiennent un génome d'ADN double brin qui se réplique dans le noyau de la cellule infectée. Quand l'ADN viral entre dans le noyau, il se localise à proximité de corps nucléaires PML ^1. Après l'expression du gène précoce virale, l'architecture nucléaire est considérablement réorganisé, induire la formation de micro-environnements virales, appelées compartiments de la réplication virale (RC) ^2. Depuis adénovirus (Ad) RC sont des sites où la réplication du génome viral et l'expression des gènes tardifs viraux ont lieu, ils fournissent un environnement pour le recrutement de tous les facteurs viraux et cellulaires nécessaires qui participent à ces processus. Fait intéressant, une variété de protéines cellulaires responsables de la réponse antivirale cellulaire, tels que la réponse aux dommages de l'ADN, la réponse immunitaire innée et la suppression tumorale sont co-voulu ces sites virales ^2. Hubs réglementaires Ainsi, Ad RC peut être considérée comme favorisant la réplication virale efficace tout en régulant de façon concomitante de laréponse antivirale cellulaire, ce qui indique que ces structures jouent un rôle clé pour la compréhension des interactions cellulaires hôte-virus. Néanmoins, les mécanismes moléculaires de la formation RC, leur composition et les activités connexes sont mal comprises.

Adénoviral RC, RC ainsi que d'autres virus à ADN qui se répliquent dans le noyau ne sont pas associées à des membranes, par opposition à ³ RC cytoplasmique. De plus, ces structures induites par des virus sont susceptibles d'être entièrement composée de protéines et d'acides nucléiques. RC formé dans les cellules infectées par des virus à ARN (généralement appelé usines virales) ont été isolés, profitant de leur localisation cytoplasmique et le statut lié à la membrane, ce qui a facilité leur morphologique détaillée, la caractérisation fonctionnelle et biochimique ^4.

À notre connaissance, RC virale nucléaire n'a pas été isolé, peut-être en raison de la complexité de l'architecture nucléaire et l'absence de m intranucléaireembranes qui faciliteraient leur isolement. Leur étude a misé plutôt sur la microscopie par immunofluorescence, FISH et microscopie électronique en transmission. Cependant, malgré les complications inhérentes à isoler les structures subnucléaires, d'autres domaines nucléaires tels que nucléoles et corps de Cajal ont été isolés avant ^5,6. Depuis nucléoles et RC sont toutes deux composées de protéines et acides nucléiques, et ont un diamètre compris entre 0,5 - 5 um, nous avons supposé que RC doit aussi se prêter à l'isolement. Par conséquent, afin de caractériser plus précisément la composition moléculaire et les fonctions associées à RC, nous avons établi une nouvelle méthode pour isoler des fractions subnucléaires enrichis en RC. À cette fin, nous avons préparé des fractions de sous-nucléaire en utilisant des gradients de vitesse et des coussins de saccharose similaires aux procédures utilisées pour isoler nucléoles ⁷ ou d'autres domaines nucléaires ^{6 et} établi un système exempt de cellules qui permet l'étude de la composition moléculaire et activités associésRC. Cette technique devrait donc progresser la compréhension des interactions cellulaires virus-hôte et représente un outil puissant qui devrait également faciliter l'analyse détaillée du RC d'autres virus qui se répliquent dans le noyau et induire la formation de compartiments de réplication de dimensions similaires à celles formées dans adénovirus -cellules infectées, comme les virus de l'herpès, papillomavirus, ou polyomavirus.

Protocole

1. HFF Culture cellulaire et Ad-infection

1. Propager le virus wt Ad5 dans des monocouches de cellules HEK-293 et que les unités formant titre fluorescentes (FFU) sur les cellules HFF ⁸ comme décrit précédemment.
2. Cultiver des fibroblastes humains (HFF prépuce) dans 10 ml de DMEM / 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans des plats de culture de 100 mm stériles à 37 ° C et _5% de CO2 dans un incubateur humidifié. Déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de Neubauer en comptant les cellules dans les quatre ensembles de 16 carrés. Le nombre de cellules par ml est obtenue en calculant le nombre moyen de cellules dans les quatre séries de 16 carrés et en multipliant ce nombre par 10 ^4. Pour chaque post-infection de temps inclus dans l'étape 1.3, utilisez 1 x 10 ⁷ cellules HFF.
3. Mock-infecter ou infecter les cellules HFF avec l'adénovirus de type 5 (Ad5) de type sauvage (WT) (H5pg4100 ^{8) dans} des boîtes de culture de tissu de 100 mm en utilisant 1 ml de Ad5 dans DMEM par plat à une MOI de 30 focus Unité Formant ou FFU , par cellule. Incuber pendant 2 h en Ahumidified incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO _2, à bascule avec soin les plats toutes les 15 minutes afin d'assurer une répartition homogène de l'inoculum de virus sur les cellules. Après ce temps, sortez le moyen et ajoutez DMEM frais complété avec 10% de FBS et incuber pendant 16, 24 ou 36 heures dans un incubateur humidifié de culture de cellules à 37 ^{° C} et 5% de CO _2. Passez à l'étape 2.1.

2. Préparation des fractions de sous-nucléaire Enrichi en adénovirus RC

1. Récolte Ad5-infecté ou cellules HFF pseudo-infectées avec un racloir de cellules et de recueillir les cellules dans des tubes de centrifugeuse stériles. Déterminer le nombre de cellules comme dans l'étape 1.2. Utilisez 1 x 10 ⁷ cellules pour chaque post-infection de temps spécifiée dans l'étape 1.3.
2. Centrifuger les cellules à 220 xg, 4 ° C pendant 5 min.
3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS glacé (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na ₂ HPO ₄ et 1,8 mM de _KH 2 _PO 4). Laver culot cellulaires 3 fois à l'aide de 5 ml de PBS glacé par lavage. A cet effet, centrifuger les cellules à 220 xg, 4 ° C pendant 5 min, décanter et jeter le surnageant (SN), et remettre le culot cellulaire par pipetage doux.
4. Pour interrompre la membrane plasmique, remettre en suspension le culot cellulaire dans 700 ul de tampon hypotonique glacé (10 mM de HEPES pH 7,9, 10 mM de KCl, MgCl 1,5 mM de _2, 0,5 mM de DTT, 20 μ g / ml fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) un mélange de la cystéine, la sérine, les inhibiteurs de thréonine et aspartyl protéase comprenant 10 μ g / ml inhibiteur de trypsine pancréatique bovine, 10 μ g / ml de pepstatine A et 10 μ g / ml N-acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L -argininal) et laisser les cellules gonflent sur la glace pendant 3 heures.
5. Lyse des cellules en utilisant un homogénéisateur avec une ample Un pilon type de téflon. Effectuez 80 dounce coups et des échantillons de surveiller chaque 20 coups par microscopie à champ clair pour assurer que toutes les cellules ont été lysées, mais que les noyaux ont not été endommagé ou rompu.
6. Centrifuger l'homogénat de cellules à 300 g, 4 ° C pendant 5 min. Rangez la SN que la fraction cytoplasmique à -20 ºC dans un tube de centrifugeuse.
7. Pour éliminer les débris cellulaires à partir de noyaux, remettre en suspension le culot dans 750 μ l de solution 1 (S1) (0,25 M de saccharose, ₁₀ mM de MgCl2 à 20 pg / ml PMSF, un mélange de cystéine, la sérine, les inhibiteurs de thréonine et aspartyl proteases, y compris 10 μ g inhibiteur / ml pancréatique bovine par la trypsine, 10 μ g / ml de pepstatine A et 10 μ g / ml N-acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal) et la couche sur un volume égal de solution 2 (S2) (0,35 M de saccharose, mM MgCl 0,5 _2, 20 μ g / ml de PMSF, un mélange de cystéine, la sérine, les inhibiteurs de thréonine et aspartyl proteases, y compris 10 μ g / ml inhibiteur de trypsine pancréatique bovine, 10 μ g / ml de pepstatine A et 10 μ g / ml N-acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal). Centrifuge à 1400 xg, 4 ° C pendant 5 min.
8. Jeter le SN utilisant une micropipette. Éviter de perturber le culot.
9. Remettre en suspension le culot contenant des noyaux isolés dans 750 μ l de S2.
10. Pour isoler des fractions subnucléaires enrichis par l'adénovirus RC (RCF), remises en suspension Soniquer noyaux avec un bain à ultrasons, utilisant deux impulsions 5 min, ou jusqu'à ce que tous les noyaux sont lysées comme observé par microscopie à champ clair. Utilisez de la glace dans le bain à ultrasons que nécessaire pour conserver les échantillons à ou inférieure à 4 ° C.
11. Couche les noyaux traités aux ultrasons sur un volume égal de solution 3 (S3) (0,88 M de saccharose, 0,5 _mM de MgCl2) et centrifuger à 3000 xg, 4 ° C pendant 10 min. Stocker le 1,5 ml surnageant comme la fraction nucléoplasmique (NPL) à -70 ºC. Reprendre le culot dans 700 μ l de S2 et magasin comme RCF à -70 ºC.

3. Les analyses Western Blot de RCF

REMARQUE: Pour l'analyse Western Blot de NPL et RCF fractions set côté 640 ul de NPL et 300 μ l pour RCF du volume total obtenu à l'étape 2.11.

1. Mélanger 15 μ l de chaque fraction dans subnucléaire 2x tampon de Laemmli (SDS 4%, 20% de glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,004% de bleu de bromophénol, 0,125 M de Tris HCl pH 6,8) et à 95 ° C bouillir pendant 5 min. Charger les échantillons dans une électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate-polyacrylamide de sodium à 10% (SDS-PAGE) et gel dénaturant les protéines séparées pendant 1,5 heure, à 20 milliampères (mA).
2. Transfert protéines par électrotransfert pendant 1,5 heure à 400 mA sur polyvinylidène (PVDF) membranes.
3. Bloquer membrane pendant 2 heures à la température ambiante en utilisant du lait en poudre écrémé 3% dans PBS.
4. Incuber O / N à 4 ° C avec un anticorps primaire contre ADN viral liaison aux protéines E2A (B6-8 ^{9) à une} dilution de 1: 500 dans le lait sec PBS / 0,3% sans matières grasses.
5. Membrane Laver 3 fois avec du PBS / 0,1% de Tween 20 pendant 10 minutes.
6. Incuber la membrane avec un anticorps de souris anti IgG secondairetibody couplé à la peroxydase de raifort (HRP) à une dilution de 1: 10000 dans du PBS pendant 2 heures à température ambiante.
7. Laver la membrane 3 fois avec du PBS / 0,1% de Tween 20 pendant 10 minutes.
8. Développer la membrane en utilisant chimioluminescence amplifiée et les films X-ray.

4. ADN viral Détection RCF

REMARQUE: Pour l'isolement de l'ADN des deux fractions NPL et RCF, utiliser 210 μ l pour Npl et 100 μ l pour RCF du volume total obtenu à l'étape 2.11.

1. Incuber sous-fractions nucléaires pendant 1 heure à 55 ° C avec 1 mg / ml de protéinase K et 0,5% de Tween 20.
2. Inactiver la proteinase K en faisant incuber les échantillons pendant 10 min à 95 ° C.
3. Centrifuger les échantillons à 20 000 x g, à température ambiante pendant 2 min.
4. Recueillir le SN. Précipiter l'ADN avec 1/10 de volume de 3M acétate de sodium et un volume d'isopropanol, O / N à 4 ° C.
5. Centrifuger les échantillons à 20 000 x g, à température ambiante pendant 10 min.
6. Jeter le u SNchanter une micropipette. Laver le culot avec de l'éthanol 70% et centrifuger à 20 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
7. Remettre en suspension l'ADN dans 10 μ l de 10 mM Tris-HCl pH 7,4
8. Quantifier l'ADN en utilisant un spectrophotomètre en mesurant la densité optique (DO) à 260 nm.
9. Pour amplifier l'ADN viral, en utilisant 100 ng d'ADN de chaque fraction subnucléaire dans une réaction de PCR standard en utilisant l'ADN polymerase Taq dans 25 μ l de volume de réaction avec des amorces qui permettent l'amplification d'une région à l'intérieur de l'unité de transcription tardif majeur, du nucléotide 7273 de nucléotide 7353 (81 pb) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Utiliser les conditions suivantes du cycle: la dénaturation initiale pendant 3 min à 95 ° C, suivi par 20 cycles d'amplification (1 min à 95 ° C, recuit pendant 1 min à 62 ° C et l'extension de 30 secondes à 72 ° C) et une étape d'extension finale pour 3 min à 72 ° C.
10. Exécutez le produit de PCR dans 2% des gels d'agarose, à 90 V. Stain avec éthidiumbromure à 0,5 μ g / ml concentration finale et visualiser l'ADN pour corroborer l'enrichissement de l'ADN viral dans le RCF. Manipulez le bromure d'éthidium avec une extrême prudence et assurez-vous toujours de porter des gants, que ce composé est un agent mutagène puissant. Eliminer le bromure d'éthidium selon les directives institutionnelles.

5. tardifs viraux ARNm Détection RCF

REMARQUE: Pour l'isolement de l'ARN à partir des deux fractions NPL et RCF, utiliser 640 μ l pour Npl et 300 μ l pour RCF du volume total obtenu à l'étape 2.11.

1. Isoler l'ARN à partir des fractions en utilisant subnucléaires Trizol selon les instructions du fabricant. Reprendre l'ARN dans 50 μ l de DEPC (diethilpyrocarbonate) imprégnées d'eau.
2. Quantifier l'ARN en utilisant un spectrophotomètre pour mesurer la DO à 260 nm (on obtient environ 3 μ g). Stocker l'ARN dans 50 ng / ul aliquotes à -70 ºC.
3. Vérifiez ARN purifiél'absence de contamination de l'ADN en effectuant une réaction de PCR de contrôle en l'absence de transcriptase inverse (RT), en utilisant 5 ng d'ARN total et les conditions de cycle décrites à l'étape 4.9.
   1. Si la contamination de l'ADN est absent ne amplicon doit être produite. En cas de contamination de l'ADN est présent, les échantillons incuber avec 10 U de DNase I, 10 U d'inhibiteur de RNase, 0,1 M de Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M de KCl et 15 _mM de MgCl2 pendant 30 minutes à 37 ° C. Passez à ré-isoler l'ARN comme dans l'étape 5.1.
4. Pour analyser l'ARNm viral associé aux FCR, amplifier 100 ng d'ARN à partir de chaque fraction subnucléaire par RT-PCR en utilisant des amorces conçues pour détecter l'ARNm tardif adénoviral de différentes familles de gènes (tableau 1).
   1. Pour la transcription inverse (RT), en utilisant 100 ng d'ARN, à partir de chaque fraction subnucléaire dans une réaction RT standard en utilisant M-MuLV RT enzyme dans 20 μ l de volume de réaction pendant 1 h à 42 ° C et 10 min à 70 ° C.
   2. Pour l'amplification, utilisez 1μ l de l'ADNc dans des réactions de PCR, comme à l'étape 4.9. Utiliser les conditions suivantes du cycle: la dénaturation initiale pendant 3 min à 95 ° C, suivi par 25 cycles d'amplification (1 min à 95 ° C, recuit pendant 1 min à la température indiquée dans le tableau 1 et l'extension de 30 secondes à 72 ° C) et une étape d'extension finale pendant 3 min à 72 ° C.
5. Exécutez les produits de RT-PCR dans 2% des gels d'agarose, à 90 gels V. tache avec du bromure d'éthidium à 0,5 μ g / ml concentration finale et de visualiser à corroborer association virale fin de l'ARNm du RCF. Manipulez le bromure d'éthidium comme indiqué dans l'étape 4.10.

6. immunofluorescence Visualisation de RCF

REMARQUE: Carry-out cette procédure sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination des échantillons avec les particules de poussière, et de filtrer toutes les solutions avant utilisation.

1. Spot 5 ul de la fraction RCF obtenu à l'étape 2.10 désastreusecte sur une lame revêtue de silane.
2. Laissez la tache sécher pendant environ 5 min à température ambiante.
3. Réhydrater par lentement et indirectement pipetage 500 μ l de PBS dans une goutte à côté de la place RCF et laisser couler en inclinant la diapositive. Égoutter l'excès de PBS sur le côté.
4. Bloc en recouvrant l'échantillon avec 500 μ l de PBS / 5% de sérum albumine bovine (BSA) pendant 2 h à température ambiante.
5. Laver la lame 3 fois par doucement et indirectement pipetage 500 μ l de PBS sur l'échantillon. Inclinez la glissière pour évacuer l'excès de PBS.
6. Incuber l'échantillon avec un anticorps primaire contre E2A liaison à l'ADN viral de protéine (B6-8 ⁹⁾ à une dilution de 1: 500 dans du PBS pendant 2 heures à température ambiante. Couvrir l'échantillon tacheté de 20 μ l de la solution d'anticorps et incuber dans une chambre humide pour éviter le séchage.
7. Laver l'échantillon 3 fois avec du PBS / 0,02% de Tween 20 et indirectement par doucement pipetant 500 μ l de PBS sur l'échantillon. Inclinez la glissière pour évacuer l'exsolution de lavage de processus.
8. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire anti- IgG de souris couplé à un fluorophore qui est excitée à 488 nm à une dilution de 1: 2000 dans du PBS, pendant 1 heure à 4 ° C. Couvrir l'échantillon tacheté de 20 μ l de la solution d'anticorps et incuber dans une chambre humide pour éviter le séchage.
9. Laver l'échantillon 3 fois avec du PBS / 0,02% de Tween 20 et indirectement par doucement pipetant 500 μ l de PBS sur l'échantillon. Inclinez la glissière pour évacuer la solution de lavage en excès.
10. Couvrir l'échantillon repéré sur la diapositive avec une lamelle en utilisant 2 μ L PBS / 10% du glycérol comme milieu de montage. Sceller avec du vernis à ongles transparent et al magasin -20 ºC.
11. Analyser les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence, avec un objectif 63x et un 1.4 Ouverture numérique (NA) à une longueur d'onde de 488 nm.

Résultats

Étant donné que les compartiments de replication virale (RC) sont des structures virales induites subnucléaires composées de protéines et acides nucléiques, similaire à d'autres domaines nucléaires, ils se sont avérés être prête à l'isolement par des gradients de vitesse sur la base des caractéristiques biochimiques. Les étapes critiques dans le protocole de fractionnement sont illustrés dans la Figure 1. A chaque étape les échantillons doivent être surveillé...

Discussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080