Identificación de las nanopartículas de óxido de metal en muestras histológicas por Enhanced Mapeo de campo oscuro Microscopía y hiperespectrales

Resumen

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Resumen

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Introducción

Como los nanomateriales se utilizan cada vez más en una variedad de industrias y aplicaciones, existe una necesidad de métodos de imagen nanoescala y caracterización que son más rápida, asequible y conveniente que las modalidades tradicionales, como la microscopía electrónica. Para visualizar de nanopartículas (NP) interacciones con las células, los tejidos y los sistemas vivos, han sido empleadas muchas técnicas ópticas, incluyendo contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopia ¹ y enfoques basados ​​en el campo evanescente, como reflexión total interna (TIR) ​​o casi microscopía de barrido de campo óptico (NSOM) ^2,3. Sin embargo, estos son los enfoques analíticos de gama alta, fuera del alcance de la mayoría de los laboratorios no especializados ^4. La microscopía electrónica, incluyendo microscopía electrónica de transmisión (TEM), también se ha utilizado para estudiar la interacción con las células NP ^5,6,7,8. Alto ángulo anular campo oscuro (HAADF) microscopía de barrido electrónico de transmisión se ha utilizado para estudiar la interacción de PNcon virus ^9. La microscopía confocal es otra técnica popular usado para estudiar las interacciones célula-NP ^10.

En los últimos años, las imágenes hiperespectrales (HSI) técnicas basadas en campo oscuro se han utilizado como una herramienta analítica prometedora para el estudio de NPs en matrices biológicas ^11. Sistemas de HSI generar una representación tridimensional de datos espaciales y espectrales, conocidos como un hipercubo o cubo de datos ^12. El mapa espacial de la variación espectral se utiliza para la identificación de los materiales. Perfiles espectrales de materiales conocidos pueden ser generados y utilizados como bibliotecas de referencia para la comparación con muestras desconocidas. Una de las principales ventajas con sistemas de HSI es su capacidad de combinar formación de imágenes con la espectroscopia, estableciendo de ese modo la ubicación y distribución de los NPs desconocidos in vivo o ex vivo, así como su vinculación a otra partícula de referencia conocida, la composición similar.

Hay varias ventajas deutilizando sistemas HSI sobre las técnicas de imagen convencionales: se requiere preparación de la muestra mínima; preparación de la muestra es típicamente no destructiva en la naturaleza; adquisición y análisis de imágenes es más rápida; la técnica es rentable ^13; y la distribución espacial y el análisis de los compuestos de composición mixta y / o en matrices complejas se logra más fácilmente ^14.

Para la investigación nanomateriales con muestras preciosos, una de las consideraciones más importantes es la disponibilidad de un método de imagen no destructiva, que permite el potencial para examinar repetidamente muestras mediante uno o más métodos. Repetidas o múltiples análisis pueden ser deseables para desarrollar conjuntos de datos exhaustivos que no estarían disponibles en un solo método. En este sentido, el estudio de sus propiedades ópticas es la forma más segura de analizar la muestra. Mediante el uso de un microscopio de campo oscuro mejorada (EDFM) y el sistema de HSI para estudiar la respuesta óptica de la muestra - a saber Reflectance, sino también de absorbancia y transmitancia - identificación de características y caracterización se puede realizar ^15. Los puntos finales de caracterización de potenciales incluyen una evaluación de tamaño relativo y la forma de nanopartículas o aglomerados y distribución de las nanopartículas dentro de una muestra.

En este trabajo, se describen los métodos de asignación específica para nanopartículas de óxido de metal en el tejido post-mortem utilizando un sistema HSI basado en un algoritmo de coincidencia píxel espectral se refiere como un asignador ángulo espectral (SAM). Elegimos esta aplicación en particular, ya que tiene el potencial para complementar actual y futura en la investigación nanotoxicología vivo, en el que se utilizan modelos animales para evaluar las implicaciones para la salud de la exposición a los nanomateriales artificiales. La aplicación de este método también podría informar a la investigación de administración de fármacos a nanoescala que utiliza modelos de tejidos o animales. En particular, la absorción de nanopartículas, distribución, metabolismo y excreción en toda organs y tejidos podrían ser investigados con este sistema. Una amplia variedad de aplicaciones están siendo investigados para su uso en investigación biomédica ^11.

Este método podría ser utilizado para la evaluación de diferentes muestras biológicas (tales como tipos diversos tejidos, muestras de lavado broncoalveolar, y frotis de sangre) que han sido expuestas a las nanopartículas de una variedad de composiciones elementales ^16-19. Además, este método es útil para el estudio de biodistribución de nanopartículas in vivo e in vitro, lo que es pertinente para los estudios de administración de fármacos a nanoescala ^11. Más allá de muestras biológicas, EDFM y HSI se pueden utilizar para evaluar las nanopartículas en muestras ambientales, tales como aguas residuales ^20. Evaluación de la exposición ocupacional puede ser facilitada por el uso de esta técnica, así, ya que se puede utilizar para evaluar la eficacia del equipo de protección personal en la prevención de la penetración de nanopartículas. Además, el TE investigaciónam está desarrollando actualmente un EDFM similar y protocolo de HSI para la evaluación de muestras de medios filtrantes de nanopartículas obtenidos de las evaluaciones de exposición ocupacional. Si bien la preparación de estos diferentes tipos de muestras para EDFM y HSI puede variar, es importante que están preparados de tal manera que puedan ser fácilmente visualizados por el sistema óptico. Típicamente, la muestra se debe preparar como si fuera a ser visualizado a través de microscopía de campo claro tradicional. Hay varios sistemas de imagen hiperespectral disponibles en el mercado ^11.

Protocolo

Protocolos animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la entidad colaboradora de los investigadores, la Universidad de Stony Brook. Una lista de los materiales y equipos utilizados para este trabajo específico se puede encontrar en la Tabla 1.

1. Preparación de muestras de los tejidos

1. Preparar los tejidos animales expuestos a nanopartículas de óxido de metal para la tinción histológica o inmunohistoquímico según los métodos descritos anteriormente ^21-23.

2. Imaging

1. Iniciando el Microscopio
   NOTA: Para este estudio, se utilizó un microscopio de grado de investigación, equipado con una fuente de luz de campo oscuro de alto rendimiento, el controlador XY motorizada etapa, 14-bit cámara hiperespectral profundidad y múltiples lentes del objetivo (aire 10X, aire 40X, aceite de inmersión 100X) . El sistema utilizado aquí tiene una resolución espacial de 64 nm a 100X (inmersión en aceite) ampliación. El condensador se utiliza para esta ganaderíay tiene tanto Koehler y críticos características de iluminación y se enfoca una luz altamente colimado en ángulos oblicuos en la muestra.
   1. Conecte y encienda la fuente de luz, el controlador XY, cámara óptica (para la imagen de campo oscuro), cámara hiperespectral y sistema informático. Ajuste la fuente de luz al poder el 75%; subir al escenario a la altura máxima; conectar la guía de luz al condensador para formación de imágenes de campo oscuro mejorada o para el colimador en la parte posterior del microscopio para obtener imágenes de campo claro reflejada.
      NOTA: Al establecer la fuente de luz a la energía del 75%, no hay suficiente iluminación y uniforme de todos los píxeles dentro de todo el campo de visión que mejora más apagados píxeles al tiempo que permite el contraste entre mates y brillantes píxeles.
   2. Eleve el condensador a la posición de funcionamiento. Aplicar 3-5 gotas de tipo-A aceite de inmersión sobre la lente condensadora con cuidado, evitando la formación de burbujas. Limpie el aceite y volver a aplicar, si las burbujas deben formar.
   3. Coloque el o diapositivan el escenario. Levante lentamente el condensador hasta que el aceite de inmersión entra en contacto con la diapositiva. Este será perceptible a través del anillo brillo rápidamente de la iluminación donde el aceite se pone en contacto con la corredera.
2. Ponga el objetivo de 10X en su lugar. Enfoque y alinear el condensador mediante el examen a través de los oculares.
   1. Mueva el escenario arriba y abajo a través de la perilla de enfoque objetivo gruesa hasta que se maximiza el brillo.
   2. Mover el condensador enfocar arriba y abajo a través de la perilla de ajuste del condensador hasta que se encuentre el máximo brillo. Intento de crear el lugar central más brillante posible en el campo de visión.
   3. Ajuste el perillas alineación condensador según sea necesario para centrar el punto brillante, si es necesario.
   4. Utilice el botón de enfoque objetivo bien para llevar el punto brillante en el foco. Al cambiar los objetivos de obtener un aumento, se debe ajustar el plano de enfoque. Cuando se utiliza el objetivo 100X, aplicar una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos para mejorar THe imagen y evitar daños a la lente del objetivo.
3. Captura de imágenes
   1. Utilice el controlador etapa para encontrar una región de interés. Esta región será determinado por las necesidades del experimento. Un indicador típico será de alto contraste con las regiones circundantes, como las áreas bañadas con nanopartículas de óxido de metal a menudo aparecen más brillantes que las zonas sin ellos.
   2. Traiga la región en foco usando el botón de enfoque objetivo bien, ajustar el enfoque según sea necesario para equilibrar la iluminación del condensador. Lograr una región de alto contraste, bien definido dentro del campo de visión.
   3. Determine qué imágenes (para la cámara óptica) o datacubes (para la cámara hiperespectral) serán capturados, y en qué secuencia. Típicamente, las imágenes ópticas se obtienen con un objetivo de 10X aire, aire objetivo 40X, 100X y objetivo de inmersión en aceite y un cubo de datos HSI correspondiente con un objetivo de inmersión en aceite 100X.
      1. Abra el software de imagen óptico. Haga clic en "Configuración y# 8221; en la barra de menú. Seleccione el "Botón de captura de imagen para el evento de captura". Seleccione el formato de imagen almacenada (TIFF se utilizó para este experimento); asignar un nombre de archivo; buscar y seleccionar una carpeta de imágenes almacenados; mantener timelapse predeterminado; haga clic en "Aceptar".
      2. Seleccione los ajustes de exposición que crean la imagen de contraste más alto en el menú de "exposición" (para este estudio, un nivel de 0,0%, la ganancia de 3,0 dB, y el obturador de 35 ms se utilizaron).
      3. Captura de la imagen haciendo clic en el botón "Imagen" en la barra de menú. Captura de imágenes de campo oscuro varios bajo aumento además de aquellos en la alta ampliación cambiando los objetivos del microscopio, con el fin de proporcionar un contexto.
         NOTA: Capturar imágenes ópticas con la misma ampliación como cualquier datacubes que serán capturadas con la cámara hiperespectral, ya que estas imágenes ópticas tienden a tener un mayor campo de visión y una mejor apariencia estética para la inspección visual después. Es esencial que cualquier DatacUBE que posteriormente serán analizados espectralmente uso ampliación consistente, ya que es posible que al cambiar el objetivo alterará los espectros de transmisión de la óptica del microscopio, el cambio de los espectros capturado, y reduciendo de este modo la exactitud de la mapper ángulo espectral (SAM). Si uno cubo de datos es comparado con otro cubo de datos obtenidos con un objetivo diferente, la función SAM no funcione.
   4. Seleccione el detector de imagen de la cámara hiperespectral redirigiendo la perilla de la fuente de luz en el microscopio a la cámara hiperespectral. Si la luz se dirige hacia la cámara hiperespectral, ninguna imagen se mostrará en el software de la cámara óptica. Minimice, pero no cierre la ventana del software de imágenes ópticas, como uno que puede necesitar como se especifica en el paso 2.4.4.
4. Captura Datacubes
   1. Abra el software de imágenes hiperespectrales para la adquisición de datacubes HSI. Asegúrese de que la guía de luz se dirige a la cámara hiperespectral.
   2. Abrir "HypMicroscopio erspectral "en la barra de menú y seleccione" Controles HSI microscopio ".
   3. Ajuste el aumento del objetivo y el camino de salvar. Asegúrese de nombrar todas las imágenes y archivos distintivamente así no se produce sobreescritura. Cambiar el área de captura en la configuración mediante el ajuste del campo de visión o el número de líneas (720 líneas utilizar para este estudio), con una cantidad significativa de tiempo adicional requerido para la captura de áreas más grandes. Por último, establecer el tiempo de exposición (0.25 seg para este estudio). Deja todo lo demás para predeterminado y haga clic en "Vista previa HSI" para ver la imagen.
      Nota: El gráfico de la intensidad que aparece muestra el cubo de datos HSI que se grabará en el eje horizontal. El eje vertical representa las longitudes de onda del espectro que se va a capturar en el cubo de datos HSI. Al colocar el cursor en cualquier posición en el gráfico de intensidad correspondiente a una longitud de onda espectral hace que las intensidades de todos los puntos a través de la imagen, en esa longitud de onda, para ser mostrado.
   4. enfocará basándose en esta vista previa ajustando el enfoque objetivo fina para afilar los picos en esta imagen. Si esto es demasiado difícil, la longitud focal de la cámara óptica es bastante similar, por lo que cargar el software de imagen óptica y desplazar la barra deslizante hacia la cámara óptica, el enfoque, y luego volver al software de imágenes hiperespectrales y regresar la barra deslizante a la cámara hiperespectral .
   5. Ajuste la intensidad de esta vista previa ajustando brillo de la fuente, el enfoque del condensador, o al cancelar la vista previa para ajustar el tiempo de exposición. Esta última produce los mejores resultados, pero aumentó el tiempo de exposición puede tardar más tiempo en la imagen. El objetivo es que los picos más importantes a ser suficientemente grande, pero no superior a la intensidad máxima para el detector; aquí, el rango ideal es de entre 1.000 y 16.000 unidades.
   6. Haga clic en "capturar". El microscopio le pedirá que tomar una imagen de corriente oscura. Reorientar la barra deslizante superior o abertura (con cuidado, para no molestar a la alineacióny el enfoque de cualquiera de las otras ópticas) y haga clic en "Aceptar". Restaurar la barra deslizante o la abertura en la posición correcta y haga clic en "Aceptar" cuando mensaje para que aparezca la imagen. Imaging puede tardar hasta 30 minutos, aunque los tiempos de unos 5 minutos son más típicas. Tiempos de exposición más largos conducen a los tiempos de imagen más largos. Un indicador de progreso está presente. Tenga cuidado de no alterar físicamente el alcance antes de que el indicador de progreso se complete.
   7. Observar cuatro ventanas nuevas con los nombres: "lista de bandas disponibles", "# 1zoom", "# 1scroll" y "# 1 banda RGB". Maximizar la ventana de "banda # 1RGB" ya que es el cubo de datos para todas las referencias futuras.
   8. Haga clic derecho en el cubo de datos y guardarlo como un archivo TIFF y haga clic en "Aceptar". Si la imagen de terminar; guardar todas las muestras; limpiar todas las superficies expuestas al petróleo con isopropanol al 70% en agua; plantear el escenario a la altura máxima; condensador inferior a la altura mínima y de prensa en su posición no operativa; cerrarabajo o desconecte la fuente de luz, el controlador de la etapa, y las cámaras.

3. Creación de referencia espectrales Bibliotecas

1. Selección de Referencia Spectra
   1. Seleccionar un control positivo que se sabe que contienen el material de interés contenida en la misma matriz que las muestras experimentales, ya que los perfiles espectrales son HSI matriz-dependiente.
      1. Para este estudio, el uso de piel porcina inyectados con altas dosis de nanopartículas de óxido de metal como controles positivos para comparación con el tejido de la piel porcina experimental a partir de un estudio de exposición tópica. Los perfiles espectrales de las nanopartículas de óxido de metal en suspensión se generaron y se examinaron y se encontró que un control positivo inapropiado para las muestras experimentales histológicos debido a las diferentes matrices.
   2. Obtener un cubo de datos desde el control positivo como se describe en el paso 2.4., El uso de la cámara hiperespectral.
      1. Tenga especial cuidado cuando sestalació n la intensidad, ya que esta es la métrica principal por el cual el filtro de partículas interna identificará los materiales. Cualquier intensidades por encima del punto del detector (en este caso, 16.000 unidades) darán como resultado la saturación de datos no válidos (consulte el paso 2.4.5.).
   3. Haga clic derecho en la ventana de la imagen, ya la izquierda, haga clic en "espectro Z-perfil". Aparecerá una ventana espectral perfil emergente. Haz clic izquierdo en píxeles de interés en el cubo de datos, en particular los más brillantes o los que se pueden identificar con seguridad como la representación del material de interés. Observe la ventana de perfil espectral que muestra el espectro asociado. Tomar nota particularmente de su valor más bajo y más alto, y que la longitud de onda corresponde a la misma.
      1. Cuando la topografía de la muestra de control positivo, encuesta haciendo clic en las regiones de interés que son muy brillantes en relación con el tejido circundante, especialmente aquellos con partículas fácilmente identificables. Estas partículas tienen más probabilidades de ser el matermate- de interés, especialmente en el caso de los metales.
   4. Utilice la herramienta "Filtro de partículas" en el menú "Análisis de partículas" para identificar las partículas presentes en el cubo de datos. En la nueva ventana emergente, observar el "Spectral Max debe superar". Esto será determinado por las observaciones en el paso 3.1.3. Establezca este valor por lo que es más alto que los píxeles del fondo, pero inferior a los materiales de interés. El "Válido Datos Max" es la intensidad máxima (en este caso, 16.000 unidades).
      1. Deja otros parámetros por defecto, pero excluir objetos basados ​​en el tamaño mediante el ajuste de la casilla "Tamaño Umbral". Guarde esta información, ya sea en este momento o después de ejecutar el análisis. Para este experimento, utilice los siguientes parámetros: Spectral Max debe superar: 5000; Válido Datos Max: 16.000; Tamaño Umbral (píxeles): 400. Una vez que todos los parámetros se han establecido, haga clic en "Aceptar".
   5. Observe el gráfico resultante con los detalles departículas detectadas en el umbral de intensidad indicada; estos datos se pueden exportar. Si se conoce la longitud de onda característica máxima reflectancia del material de interés, seleccione aquellas partículas que tienen un valor similar "Max WL"; de lo contrario, haga clic en "seleccionar todo". Luego haga clic en "Exportar"; "Para espectral Biblioteca". Elige un nombre de archivo y luego haga clic en "Aceptar".
2. Retire Spectra falsos positivos
   1. Seleccione una muestra que servirá como control negativo. Dicha muestra debe haber sido preparada y tratada de la misma manera que todas las muestras experimentales salvo que la ausencia de nanopartículas similares o idénticos al material de interés está garantizada.
      NOTA: Es importante que la matriz del control negativo es la misma que la matriz de las muestras experimentales, como perfiles espectrales son HSI matriz-dependiente. Para este estudio, se utilizó piel de cerdo que no fue expuesto a los nanomateriales de óxido de metal como negativocontroles.
   2. Obtener varias datacubes del control negativo como se describe en el paso 2.4.7, utilizando la cámara hiperespectral. Por lo menos uno está obligado, pero más puede ser capturado para aumentar la selectividad (esto es especialmente importante en el caso de que algún contaminante puede estar en los espectros de referencia).
   3. Utilice el software de imágenes hiperespectrales para filtrar la biblioteca espectral recogido en el paso 3.1 (control positivo) en contra de cada cubo de datos capturados en el paso 3.2.2 (controles negativos) en serie, como se indica en los siguientes pasos:
      NOTA: Guarde el resultado, biblioteca espectral filtrada en un archivo separado, y el uso como la biblioteca espectral de referencia para el material de interés.
      1. Haga clic en "Filtro espectral Biblioteca" en el menú Análisis, situado en la barra de herramientas principal del programa. Haga clic en "Abrir"; "Nuevo Archivo" y seleccione la biblioteca espectral creada en el paso 3.1. para el control positivo como el archivo de entrada. Haga clic en "Aceptar".
      2. Delanterofuente xternal, seleccione "Imagen" en el cuadro de datos espectrales. Mantenga la configuración predeterminada en el cuadro Parámetros de procesamiento. Seleccione un Nombre Salida Para Filtered Biblioteca (esto debe ser diferente de la original, o la biblioteca espectral cruda recogida se perderá). Haga clic en "Aceptar".
      3. Haga clic en "Abrir"; "Nuevo Archivo" y seleccionar el primer cubo de datos capturados en el paso 3.2.2 para el control negativo, cuando se le solicite para seleccionar una imagen de origen.
         NOTA: El software analizará la biblioteca espectral y quitar cada espectro que coincide con cualquier espectro del cubo de datos de control negativo. Extracción del fondo de los criterios de selección por lo tanto reduce el potencial de falsos positivos. Un resumen estará disponible cuando se hace esto (nota que este resumen no se guarda automáticamente).
      4. Si se desea un filtrado adicional, repita desde el paso 3.2.3.1, excepto: paso 3.2.3.2, seleccione la última biblioteca espectral filtrada creado (lo que resulta después del paso 3.2.3.3 co.mpletes); en el paso 3.2.3.3, seleccione el siguiente cubo de datos desde el paso 3.2.2.
         NOTA: Corrección y normalización para el espectro de la lámpara puede ser necesario si las muestras se dispersan una cantidad considerable de luz (por ejemplo, los nanotubos de carbono) y / o si los espectros de cero permanecen al filtrar una biblioteca espectral control positivo frente a un control negativo. Estas circunstancias no surgen para nuestro estudio y por tanto no se llevó a cabo esta corrección.

Análisis 4. Imagen

1. Mapeo espectral Angulo
   1. Abra el "Angle Mapper espectral" (SAM) en el menú espectral, Métodos Asignación submenú, utilizando el software de imagen hiperespectral una vez que todos los datacubes experimentales han sido adquiridos siguiente paso 2.4. El asignador de ángulo espectral compara los espectros mediante el análisis geométricamente los cambios en la intensidad como una función de longitud de onda (es decir, compara dos espectros mediante la normalización de su intensidad y la comparación de los ángulos recesarias para trazar la gráfica de cada espectros) ^24.
   2. Con el cubo de datos abierta, seleccione el nombre del cubo de datos experimentales en la ventana emergente y haga clic en "Aceptar". Si no aparecen los nombres de archivo, haga clic en "abrir"; "Nuevo archivo", elija el cubo de datos experimentales, a continuación, haga clic en "Aceptar".
      1. Observar una nueva ventana emergente llamada endmember Colección: SAM. Haga clic en "Importar" en la barra de menú y seleccione "de archivo de la biblioteca espectral". Una ventana emergente aparecerá llamado espectral Biblioteca de archivos de entrada. Abra la biblioteca espectral de referencia que se ha creado en el paso 3.2.3. y haga clic en "Aceptar". Observar una nueva ventana emergente llamado "Entrada espectral Biblioteca".
      2. Haga clic en "Seleccionar Todos los Artículos"; haga clic en "Aceptar", haga clic derecho en "Color" y seleccione "Aplicar colores por defecto para todos." Haga clic en "Seleccionar todo", seguido de "Aplicar" y luego seleccione el nombre de un archivo de salidad Haga clic en "Aceptar". El ángulo Mapper espectral tardará unos segundos para analizar y guardar los datos.
   3. Abrir el cubo de datos en el software de imágenes hiperespectrales. Seleccione "Clasificación" en el menú de superposición de la ventana de la imagen, a continuación, desplácese hasta el nombre del archivo y haga clic en "Aceptar". Ahora el usuario puede superponer cualquier espectro de la biblioteca para ver dónde se asignan a la imagen.
   4. Seleccione la opción "Combinar clases" en el menú de opciones en la "herramienta de clase interactiva" abierto a través del menú de superposición en la ventana de la imagen, si se desea un esquema de color unificado, como para facilitar su análisis por otro software (como se describe en el paso 4.2 .).
   5. Resalte todas las clasificaciones de combinar (por lo general, de todo menos "no clasificados" en las "clases de fusionar en la base de" la lista) y seleccione un solo espectro de la lista "clase base", a continuación, haga clic en "Aceptar". Ese color lo hará ahora REPRESent todos los espectros seleccionado.
   6. Haga clic en el color seleccionado y todos los espectros a juego se mostrará en ese color.
   7. Para obtener una imagen dicromática que mostrará los espectros juego sobre un fondo negro, cIick en el cuadro de colores "no clasificados", que es negro por defecto. Observar una imagen dicromática. Este paso se puede revertir, haga clic de nuevo en el cuadro de colores "no clasificados".
   8. Haga clic derecho para guardar la imagen como TIFF, incluyendo cualquier superposiciones actualmente activo.
      NOTA: Para el futuro procesamiento de imágenes, se utilizará una imagen dicromático.
   9. Seleccione "Clase de distribución" en el menú de opciones en la ventana "Herramienta interactiva Clase" para adquirir las estadísticas de mapeo. Estos datos representan el número de píxeles estaban sin asignar (sin clasificar) y cuántos fueron identificados como el material de interés. Tenga en cuenta que el número de píxeles no se corresponde con el número de partículas mapeadas. Esta información no es automáticamente recorded.
2. Análisis de partículas en hiperespectrales Mapped Imágenes
   1. Abra las imágenes en el software NIH ImageJ.
   2. Utilice el menú Imagen, Ajuste submenú, la función "Umbral". Seleccione los parámetros que diferencian a las partículas de interés de todos los demás materiales. Utilice los siguientes parámetros de umbral para este estudio: método del umbral predeterminado, color rojo, espacio de color HSB, comprobado oscura casilla fondo, casillas de verificación de paso controladas de tono, saturación y brillo.
      NOTA: Esto puede variar significativamente de un caso a otro. Al analizar un cubo de datos asignada, esto se puede simplificar mediante la unificación de todas las clases correspondientes a un solo color y la superposición de ese color con todos los colores no clasificados antes de generar la imagen (pasos 4.1.4 a 4.1.8).
   3. Utilice el menú Analizar, función, que será recuperar la información para el área, media, valores mínimo y máximo "Analizar partículas". Para este estudio, utilizar los parámetros aquí: tamaño 0-infinito, la circularidad0-1, muestran nada, comprueba los resultados de visualización de casilla.
   4. Para el análisis estadístico, exportar estos datos a otro programa de software que permite la comparación estadística con el número y tamaño de las partículas situadas en las muestras de control similares. Sugerimos utilizar una hoja de cálculo para el análisis de los datos ImageJ. Los datos que se muestran en la tabla de resultados después del paso 4.2.4 se deben copiar en una hoja de cálculo. La función MAX se puede utilizar en la columna de la primera (sin título) para determinar el número de partículas, mientras que la función PROMEDIO se puede utilizar en la columna de la zona para determinar el tamaño promedio de una partícula. En el futuro, se perseguirá la validación experimental para investigar esta función en la determinación de tamaño medio contra un estándar establecido para determinar el tamaño (por ejemplo, TEM).

Resultados

Microscopía hiperespectral es útil por su capacidad para identificar los materiales de una manera similar a la espectrofotometría. Como se indica en la Figura 1, cada material tiene varios espectros característica y una forma general de su reflectancia, que es único. Además, la Figura 1 ilustra la naturaleza de la matriz dependiente de los perfiles espectrales: los perfiles espectrales para cada uno de los tres óxidos de metales en muestras de tejidos histológicos (panel superior) son diferentes de los perfiles espectrales para cada uno de los tres óxidos metálicos en suspensión acuosa ( panel inferior). Mediante la cartografía de los perfiles espectrales características a muestras desconocidas en la misma matriz, la técnica es útil para determinar la presencia o ausencia de un material, y también puede comparar semi-cuantitativamente cantidades relativas de material en las muestras.

Las bibliotecas espectrales de referencia creadas a partir de muestras de piel de control positivo son apropiados para el mapeo a experimentalmuestras de piel. Como se observa en la Figura 2, las bibliotecas espectrales de referencia mapa bien a los controles positivos correspondientes y no se asignan a los correspondientes controles negativos.

La ventaja más importante de la técnica es su capacidad para detectar niveles bajos de materiales de interés en las muestras, así como para diferenciarlos de los contaminantes. . Por ejemplo, los nanotubos individuales se pueden observar en los pulmones durante la inhalación de dosis tan bajas como 40 mg en un 20-30 g de rata ²⁵ Figura 3 demuestra esto en muestras de piel histológicos: mientras que algunas partículas son fácilmente evidentes en la imagen óptica de campo oscuro (columna 2), otros se detectan utilizando imágenes hiperespectrales (columna 3) que podrían haberse perdido mediante microscopía de campo claro (columna 1) u otros métodos. El uso de campo oscuro HSI también sirve para mejorar la especificidad más sencilla la microscopía de campo claro. Estas imágenes pueden entonces ser objeto de más formas cuantitativas de análisis, nanálisis de partículas otably mediante ImageJ.

Microscopía de campo oscuro mejorada tiene varias aplicaciones diferentes, incluso en ausencia de imágenes hiperespectrales. La primera es su capacidad para generar alta calidad, imágenes de alto contraste. Esto se demuestra mejor en la Figura 3, en la que las partículas de interés son fácilmente identificables en comparación con sus homólogos de campo claro. Estas imágenes también pueden ser objeto de análisis de partículas cuantitativa, aunque en ausencia de la cartografía hiperespectrales, la precaución es necesaria para evitar confundir una partícula contaminante de una partícula de interés.

Figura 1. Referencia bibliotecas espectrales (la matriz de tejido) en comparación con las bibliotecas espectrales (nanopartículas en suspensión). Esta figura demuestra la importancia de generar una biblioteca espectral de referencia desde nanomaterials de interés de la misma matriz que las muestras experimentales. La primera fila muestra la biblioteca espectral de referencia (RSL) para cada material en este estudio (alúmina, sílice y óxido de cerio). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este RSL fue creado por el método descrito en este protocolo, cuando se filtraron las muestras de tejido de control positivo contra muestras de tejido de control negativo. La segunda fila muestra las bibliotecas espectrales (SL) creados a partir de las nanopartículas de interés en suspensión líquida en un portaobjetos de vidrio. Para alúmina, un pico bimodal en longitudes de onda de 500 y 650 se encontró en el RSL, mientras que un pico más curvada y distintivo es menor se observó en la alúmina NP suspensión SL en alrededor de 600. Para sílice, un pico a una longitud de onda de alrededor de 650 era presente en el RSL, mientras que un pico más curva y menos distintiva fue visto en el PN de sílice suspensión SL en around 600. Para ceria, un pico bimodal se encontró en longitudes de onda de 520 y 620 en el RSL, mientras que un pico distintivo es menor se observó en la ceria NP suspensión SL en alrededor de 560. Esto sugiere que la matriz en la que están incrustados los NPs crea un cambio en los espectros que puede ser considerable cuando la selección de los controles para crear la SL para el experimento como específico.

Figura 2. Referencia bibliotecas espectrales (la matriz de tejido) mapeados en el control positivo y control negativo tejido de la piel porcina. Esta figura sirve como confirmación de los RSL según corresponda para el mapeo de muestras experimentales, en que cada RSL (columna izquierda) mapea bien a su control positivo (columna central) que corresponde y no se asigna a su control negativo (columna derecha) correspondiente. Por favor, haga clic hERE para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. hiperespectral experimental mapeo de tejido de la piel porcina expuestos a nanopartículas de óxido de metal. Filas de arriba a abajo corresponden a las diferentes capas de la piel, de superficial a capa más profunda: la epidermis, la dermis y el tejido subcutáneo, respectivamente. La primera fila muestra el estrato córneo de la epidermis de una muestra de piel que fue expuesto a NPs de alúmina en la suspensión; la segunda fila fue expuesto a la sílice PN en suspensión; y la tercera fila de ceria PN en suspensión. Cada columna representa la misma zona de la piel fotografiado con diferentes técnicas. La primera columna corresponde a la microscopía de campo claro (40X mag .; barra de escala = 50 m), donde se magnificó el área encerrada en un cuadrado rojo (100X mag; barra de escala = 10 micras) con una mejora de la microscopía de campo oscuro (EDFM) en la segunda columna, donde flechas blancas apuntan al alto contraste PN. La tercera columna se obtuvo con una cámara hiperespectral (HSI), mostrando las mismas NPs de alto contraste (flechas blancas). EDFM y HSI imágenes fueron tomadas con una ampliación de 100X; barra de escala = 10 micras. La cuarta columna muestra la imagen HSI asignada en contra de la respectiva RSL para cada grupo de exposición, donde PN alúmina se muestran en verde, PN sílice en rojo y óxido de cerio PN en amarillo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Para muestras de tejido que han sido sometidos a tinción histológica convencional, la identificación y análisis de las nanopartículas de óxido de metal se pueden conseguir a través de una combinación de EDFM, mapeo HSI, y técnicas de análisis de imagen. Si bien no es la flexibilidad en la preparación de muestras para histología o inmunohistoquímica (por ejemplo, utilizando tejidos fijados o congelados; tipo de mancha), es importante que las muestras se seccionaron a un espesor de 5.10 micras para la visualización óptima. Las muestras utilizadas aquí fueron fijados con formalina y embebidos en parafina antes de seccionar con un micrótomo rotatorio a 6 m de espesor, montado sobre portaobjetos de vidrio, se tiñeron con hematoxilina y eosina y coverslipped. Tejidos de la piel de cerdo procedentes de una colaboración toxicología penetración cutánea ex vivo se utilizaron para este estudio. Los tejidos fueron expuestos a nanopartículas de óxido de metal (alúmina, sílice, óxido de cerio) en suspensiones acuosas. La detección de la región (s) de interés (eleme alto contrasteNTS) con EDFM es un primer paso crítico que facilita el mapeo posterior HSI y análisis. Muestras de control positivo y negativo deben ser reflejados y se analizaron primero con el fin de crear una biblioteca espectral para referencia. Los espectros de recogida del control positivo se exportan a una biblioteca espectral control positivo. A continuación, todos los espectros de las imágenes de control negativo se resta de la biblioteca espectral del control positivo con el fin de mejorar la especificidad (reducir los falsos positivos). La biblioteca espectral filtrada resultante se considera el RSL que sirve para el análisis de materiales de interés. Todas las muestras de tejido se someten al mismo proceso de formación de imágenes y se asignan contra el RSL. La imagen resultante contendrá sólo las zonas con elementos de interés sobre un fondo negro. Esta imagen podría entonces ser analizada con ImageJ utilizando sus funciones de umbral y el análisis de partículas para obtener el área de las partículas mapeadas por campo de visión. Los datos numéricos obtenidos a partir de ImageJ pueden ser de exportacióned a una hoja de cálculo para su posterior análisis.

Es importante tener en cuenta que a medida que las muestras biológicas son intrínsecamente diferentes entre sí, y los métodos de tinción pueden afectar la visualización a través EDFM y HSI, los ajustes de exposición deben ser determinadas de acuerdo a lo que produce la mejor imagen de alto contraste para un tipo específico de la muestra. Aunque la reducción de falsos positivos se puede lograr a través de la filtración de las bibliotecas espectrales, es crucial para obtener controles negativos fiables que han evitado la contaminación con el elemento de interés, como los espectros correspondientes a esta contaminación podría potencialmente ser filtrada desde la biblioteca espectral del control positivo , el aumento de las tasas de falsos negativos. Además, el rango de intensidad del espectro que es detectable con el software de imágenes hiperespectrales no puede superar el límite del software en particular (para este estudio, es decir 16.000 unidades): áreas con un alto número de partículas acumuladas que producen spintensidades ectral superiores al límite de intensidad se quedan fuera de la biblioteca espectral, debido al riesgo de aumentar el número de falsos negativos.

Mientras que el sistema HSI confiere muchas ventajas sobre los métodos tradicionales, hay algunos inconvenientes y limitaciones a considerar. Una es que la gran cantidad de datos ópticos recogidos pueden requerir poder sustancial de computación. Otra es que HSI puede ser que requiere mucho tiempo, sobre todo en las etapas iniciales, cuando se están creando bibliotecas espectrales de referencia. Además, el tiempo de formación de imágenes puede requerir varios minutos por la captura de imágenes, por lo que es más lenta que la imagen de campo oscuro sencilla; Sin embargo, todavía es más rápido que la realización de la preparación de muestreo y visualización mediante microscopía electrónica. Además, los sistemas complejos pueden dar lugar a múltiples espectros característicos, que requieren el desarrollo de controles de alta especialización y hacen que la creación de bibliotecas de referencia universales estandarizados difíciles ^26. Por último, la tecnologíaresultados nique en una resolución más baja que las técnicas probe- o microscopía de electrones, como la microscopía de fuerza atómica o microscopía electrónica de transmisión, que pueden resolver los átomos individuales. La resolución de esta técnica es limitada debido a su naturaleza fotónica, que le impide ser una herramienta de alta precisión para la medición de tamaños de partículas a nivel nanométrico o para localizar con precisión los materiales a un nivel inferior a la micra. Mientras que la técnica puede ser capaz de identificar partículas dentro de ciertos compartimentos de tejidos u orgánulos celulares mayor que 1 m (tales como núcleos de célula), orgánulos más pequeños o características son difíciles de visualizar con precisión con este método. También hay que resaltar, por su resolución espacial, este método no puede diferenciar entre las nanopartículas individuales y aglomerados ^11.

Otras consideraciones incluyen: ciertos materiales (tales como metales nobles) tienen mucho más alta reflectancia y perfiles espectrales distintas, que puede hacer que sean más fáciles de Analyze y mapa espectralmente con esta herramienta. Otros, tales como los óxidos de semi-metálicas investigadas en este estudio y los nanomateriales a base de carbono ^{24, 27,} pueden ser más difícil debido a su composición elemental, forma, y dependiendo de la matriz. En dos estudios de inhalación murinos por Mercer et al., Se utilizó un sistema similar a la empleada en este estudio con el fin de localizar los nanotubos de carbono en el pulmón y en los órganos secundarios en función de su notablemente alto contraste con los tejidos circundantes. Sin embargo, la cartografía hiperespectrales no se demostró en ninguno de los estudios, probablemente debido a la forma única de fibras de carbono era un rasgo suficiente para su identificación. Otra consideración se refiere específicamente a los tejidos: desde el depósito de nanopartículas de interés para los órganos específicos a través de procesos biofísicos normales es impredecible (ya menudo en sí el objeto de estudio), la determinación de un control positivo aplicable puede ser difícil y requiere la consideración de cómo la generación del control mvuelo afectar el estado de un material de interés. Por ejemplo, si una biblioteca espectral se crea a partir de nanopartículas cristalinas de interés, puede ser difícil para mapear la biblioteca para esos mismos nanopartículas en tejidos o células debido a cambios en los espectros resultantes de la alteración de la partícula (por ejemplo, debido al cambio en pH, la disolución, la aglomeración, la proteína de unión) y el microambiente o matriz general. Por último, la técnica está limitada en su naturaleza semi-cuantitativa: sólo puede ser tan cuantitativa como otras técnicas de microscopía de dos dimensiones de resolución similar, lo que significa que no se puede utilizar fácilmente para realizar tareas tales como la caracterización de carga órgano total de un material.

En general, EDFM y HSI proporcionan varias ventajas sobre las técnicas de imagen nanomaterial y caracterización convencionales, tales como TEM, HAADF y DIC. EDFM / HSI permite la adquisición y análisis de imágenes más rápido, lo que ahorra tiempo y costes en comparación con más conven intensivatécnicas cionales. Además, la preparación de muestras para EDFM / HSI es típicamente tanto mínima y no destructivo, lo que ahorra tiempo y también permite el análisis más flexible de una muestra dada, ya que entonces se puede utilizar para otras técnicas. Además, HSI es versátil, permitiendo análisis de los materiales a nanoescala de muchas composiciones y en una variedad de matrices. El equipo de investigación está trabajando para perfeccionar el método descrito aquí por otros materiales y tipos de muestras, incluyendo una evaluación a fondo de la especificidad de la tecnología. Un siguiente paso crítico siendo investigado por el equipo de investigación es la validación de estas técnicas en contra de las normas de oro tradicionales (por ejemplo, Raman, TEM, SEM) para los materiales y tipos de tejidos de interés.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.