Gelişmiş Darkfield Mikroskopi ve Hiperspektral Haritalama ile histolojik Örneklerinde Metal Oksit Nanopartiküller Kimlik

Özet

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Özet

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Giriş

Nanomalzemeler giderek sanayi ve çeşitli uygulamalar kullanılır, daha hızlı, ekonomik ve böyle elektron mikroskobu gibi geleneksel yöntemlerine daha uygundur nano görüntüleme ve karakterizasyon yöntemlere ihtiyaç vardır. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ¹ ve toplam iç yansıma (TIR) ​​ya da sıfıra yaklaşır olarak kaybolan alan bazlı yaklaşımlar dahil olmak üzere birçok optik teknikler istihdam edilmiştir hücre, doku ve canlı sistemlerin, ile nanoparçacık (NP) etkileşimleri için görselleştirmek Alan Tarama optik mikroskopi (NSOM) ^2,3. Ancak bu çoğu uzman olmayan laboratuarları ⁴ ulaşamayacağı high-end analitik yaklaşımlar vardır. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) da dahil olmak üzere elektron mikroskobu, aynı zamanda hücrelerin ^5,6,7,8 ile NP etkileşimi incelemek için kullanılır olmuştur. Yüksek açılı halka şeklindeki karanlık alan (HAADF) taramalı transmisyon elektron mikroskopisi NPS etkileşimini incelemek için kullanılır olmuşturvirüs ^9. Mikroskopisi NP-hücre etkileşimleri ¹⁰ incelemek için kullanılan bir başka popüler bir tekniktir.

Son yıllarda, karanlık alan bazlı hiperspektral görüntüleme (SHE) teknikleri biyolojik matrisler ¹¹ NPs çalışmak için gelecek vaat eden bir analitik araç olarak kullanılmıştır. HSI sistemleri hiperküp ya datacube ^{12 olarak} bilinen konumsal ve spektrum verileri, bir üç boyutlu bir temsilini üretir. Spektral varyasyon mekansal harita malzemesi tanımlanması için kullanılır. Bilinen malzemelerin spektral profil oluşturulur ve bilinmeyen numunelerin ile karşılaştırma yapmak için, referans kütüphaneleri olarak kullanılır. HSI sistemleriyle en önemli avantajlarından biri, böylece bilinen, benzer kompozisyon başka referans parçacık bağlayarak yanı sıra ya da ex vivo in vivo konumu ve bilinmeyen NPS dağılımını kuran spektroskopi ile görüntüleme birleştirmek için onun yeteneği olduğunu.

Birçok avantajı vardırgeleneksel görüntüleme teknikleri üzerinde HSI sistemleri kullanılarak: minimum numune hazırlama gereklidir; örnek hazırlama doğada genellikle tahribatsız; görüntü toplama ve analiz hızlıdır; teknik, düşük maliyetli ¹³ olduğu; ve karışık bileşimin ve / veya karmaşık matrisler bileşiklerin uzamsal dağılımı ve analiz daha kolay ¹⁴ gerçekleştirilir.

Değerli örnekleri içeren nanomateryal araştırma için en önemli hususlar biri potansiyel art arda bir veya birden fazla yöntemlerle örnekleri incelemek için izin veren bir tahribatsız görüntüleme yöntemi, mevcudiyetidir. Tekrarlanan veya birden analizler tek bir yöntemle temin olmaz kapsamlı veri setlerini geliştirilmesi arzu edilebilir. Bu bağlamda için, optik özelliklerini inceleyerek numuneyi analiz etmek en güvenli yoludur. Gelişmiş bir karanlık alan mikroskobu (EDFM) ve HSI sistemi kullanılarak örneğin optik tepkisini incelemek için - yani reflectance, aynı zamanda absorbans ve transmitans - özelliği, kimlik ve karakterizasyonu ¹⁵ gerçekleştirilebilir. Potansiyel karakterizasyon uç noktalar göreli büyüklüğü ve numune içindeki nanopartiküller veya aglomera ve nanopartiküllerin dağılımının şekli bir değerlendirmesini içermektedir.

Bu yazıda, bir spektral açı eşleyicisi (SAM) olarak ifade edilen bir piksel eşleme spektral algoritmasına dayalı bir HSI sistemi kullanılarak ölüm sonrası dokuda metal oksit nanopartiküller için spesifik eşleme yöntemleri tarif eder. Bu hayvan modelleri mühendislik nanomateryallerin maruziyetin sağlık etkilerini değerlendirmek için kullanılır, burada in vivo Nanotoksikoloji araştırma, güncel ve geleceğe tamamlayacak potansiyele sahip çünkü bu özel uygulamaya seçti. Bu yöntemin uygulanması, aynı zamanda, doku ya da hayvan modelleri kullanan nano ölçekli ilaç verme araştırmayı olabilir. O boyunca, özellikle nano partıkuler emilim, dağılım, metabolizma ve atılım olarakrgans ve dokuların bu sistem ile incelenebilir. Geniş uygulama çeşitli biyomedikal araştırmalar ¹¹ kullanılmak için araştırılmaktadır.

Bu yöntem, elementel bileşimler ^16-19 çeşitli nanopartiküller maruz kalan (örneğin, çeşitli dokuların türleri, bronkoalveolar lavaj örnekleri, kan smear) farklı biyolojik numunelerin değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Bundan başka, bu yöntem, in vivo ve nano ölçekli ilaç verme çalışmaları ¹¹ için ilgili olan, in vitro, in nanopartikül biodistribution araştırılması için de faydalıdıdr. Biyolojik numuneler ötesinde, EDFM ve HSI örneğin atık su ²⁰ çevre numuneleri içinde nano-tanecikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. O nanoparçacık penetrasyonu önlemede kişisel koruyucu donanımların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir çünkü Mesleki maruziyet değerlendirmesi, hem de bu tekniğin kullanılması ile sağlanabilir. Ayrıca, araştırma team şu anda mesleki maruziyet değerlendirmelerinin toplanan nanopartiküller filtre medya örneklerinin değerlendirilmesi için benzer bir EDFM ve HSI protokolünü geliştirmektedir. EDFM ve HSI bu farklı örnek tiplerinin hazırlanması değişebilir olmakla birlikte, bunlar kolaylıkla optik sistem tarafından görüntülenmiştir edilebilir şekilde hazırlanır önemlidir. Geleneksel aydınlık mikroskobu ile görüntülenmiştir eğer Tipik olarak, örnek hazırlanmalıdır. ¹¹ piyasada mevcut birçok hiperspektral görüntüleme sistemleri vardır.

Protokol

Hayvan protokolleri araştırmacıların işbirliği kurumu, Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi. Özel malzemeler ve bu kağıt için kullanılan ekipmanın bir listesi Tablo 1'de bulunabilir.

Dokuların 1. Numune Hazırlama

1. Daha önce anlatılan yöntemlere ^21-23 uyarınca histolojik veya immünohistokimyasal için metal oksit nano maruz hayvan dokuları hazırlayın.

2. Görüntüleme

1. Mikroskop başlatılıyor
   NOT: Bu çalışma için, bir araştırma notu mikroskop, yüksek performanslı karanlık alan ışık kaynağı ile donatılmış, kullanılan motorlu XY denetleyicisi, 14-bit derinliği hiperspektral kamera ve çok amaçlı lensler (10X hava, 40X hava, 100X immersiyon yağı) . Burada kullanılan sistem 100X (immersiyon yağı) büyütme 64 nm uzaysal çözünürlüğe sahiptir. Bu damızlık için kullanılan kondensery Köhler ve kritik hem de aydınlatma özelliklere sahiptir ve örnek üzerinde eğik açılarda yüksek collimated ışığı odaklanır.
   1. Takın ve ışık kaynağı, (karanlık alan görüntüleme için) XY denetleyicisi, optik kamera, hiperspektral kamera ve bilgisayar sistemi açın. % 75 güç ışık kaynağı ayarlayın; maksimum yüksekliğe sahne yükseltmek; Gelişmiş karanlık alan görüntüleme için veya yansıyan aydınlık görüntüleme için mikroskop arkasındaki kolimatör için kondansatöre ışık kılavuzu bağlayın.
      NOT:% 75 güç ışık kaynağı ayarlayarak, yine donuk ve parlak pikseller arasındaki kontrast için izin verirken mat piksel artırır görünümünün tüm alanı içinde, tüm piksellerin yeterli, düzgün aydınlatma var.
   2. Çalışma konumuna Yoğuşturucuyu kaldırın. Herhangi bir kabarcık oluşumu önleyerek, dikkatli bir şekilde yoğunlaştırıcı mercek üzerinde A tipi immersiyon 3-5 damla uygulanır. Kabarcıklar oluşturan gerekiyorsa, yağı silin ve yeniden uygulayın.
   3. Slayt o yerleştirinsahne n adet. Daldırma yağı slayt ile temas edinceye kadar yavaşça yoğuşturucuyu yükseltmek. Bu yağ slayt temas ettiği aydınlatma hızla parlatma halka boyunca fark olacaktır.
2. Yerine 10X objektif koyun. Odak ve Okülerin yoluyla inceleyerek Kondansörü hizalayın.
   1. Parlaklık maksimuma kadar kaba objektif odak topuzu aracılığıyla yukarı ve aşağı sahne hareket ettirin.
   2. Maksimum parlaklık bulunana kadar kondansatör yukarı odaklanmak ve aşağı kondansatör ayar düğmesi üzerinden hareket ettirin. Görüş alanındaki olası en parlak merkezi bir noktada oluşturulmaya çalışılır.
   3. Gerekirse, parlak nokta ortalamak için gerekli kondansatör hizalama düğmelerini ayarlayın.
   4. Odak haline parlak nokta getirmek için ince objektif odak düğmesini kullanın. Farklı bir büyütme elde etmek için hedefleri değiştirirken, odak düzlemi yeniden ayarlayın. 100X objektif kullanan zaman th geliştirmek için lamel üzerine immersiyon bir damla uygulamake görüntüsü ve objektif lens zarar vermemek.
3. Yakalama Görüntüler
   1. Bir ilgi bölgesini bulmak için sahne denetleyicisi kullanın. Bu bölge, deney ihtiyaçlarına göre belirlenecektir. Metal oksit nanopartiküller ile kaplanmış alanlar genellikle onlarsız alanlarda daha parlak görünür gibi tipik göstergesi, çevredeki bölgeleri ile yüksek kontrastlı olacak.
   2. Aydınlatma dengelenmesi için gerekli kondansatör odağı ayarlamak, ince objektif odak düğmesini kullanarak odak noktası haline bölgeyi getirin. Görüş alanı içinde yüksek kontrastlı, iyi tanımlanmış bölgeyi Kavuşmak.
   3. (Hiperspektral kamera) belirleyin (optik kamera için) ne görüntü veya datacubes yakalanan ve ne sırayla olacak. Tipik haliyle, optik görüntüler 10X hava amacı, 40X objektif hava ve 100X yağ batırma objektifi ve 100X yağ daldırma objektif ile bir mukabil HSI datacube elde edilmiştir.
      1. Optik görüntüleme yazılımını açın. Ayarlar & "tıklayın# 8221; Menü çubuğundaki. "Yakalama olayı için Görüntü Yakalama Button" seçeneğini seçin. (TIFF Bu deney için kullanılan) saklanan görüntü formatını seçin; Bir dosya adı atamak; göz ve saklanan görüntü klasörü seçin; Varsayılan timelapse tutmak; "Tamam" a tıklayın.
      2. "Poz" menüsünde yüksek kontrast görüntü oluşturmak pozlama ayarlarını seçin (bu çalışmada,% 0.0 seviyesinde, 3.0 dB kazanç ve 35 ms deklanşör kullanılmıştır).
      3. Menü çubuğundaki "Image" düğmesine tıklayarak görüntüyü yakalayın. Içerik sağlamak amacıyla, mikroskop amaçları değiştirerek, yüksek büyütmede ek olarak pek çok düşük büyütme karanlık alan resimler çeker.
         NOT: Bu optik görüntü görünümü ve daha sonra görsel muayene için daha iyi estetik görünüm daha geniş bir alana sahip olma eğilimi olarak, hiperspektral kamera ile çekilecek olan herhangi datacubes aynı büyütme optik görüntüler yakalayın. Bu, herhangi bir DATAC esastırbu hedefi değiştirme mikroskop optik iletim spektrumları, yakalanan spektrumları değişen ve böylece spektral açı Eşleştiricisi (SAM) doğruluğunu azaltarak değiştirmek olasıdır kadar sonra spektral, kullanım tutarlı büyütme analiz edilecektir UBE. Tek datacube farklı bir amacı elde başka datacube karşılaştırıldığında ise, SAM fonksiyonu çalışmayabilir.
   4. Hiperspektral kamera mikroskop ışık kaynağı düğmesini yönlendirerek hiperspektral kamera görüntüleme dedektörü seçin. Işık hiperspektral kameraya yönelik, hiçbir görüntü, optik kamera yazılımı gösterilecektir. Adım 2.4.4 belirtildiği gibi tek ihtiyacınız olabilir, en aza indirmek ancak optik görüntüleme yazılımı penceresini kapatmak yok.
4. Datacubes yakalama
   1. HSI datacubes kazanılması için hiperspektral görüntüleme yazılımını açın. Işık kılavuzu hiperspektral kamera yöneliktir emin olun.
   2. Aç "Hyperspectral Mikroskop HSI Mikroskop Kontrolleri "" menü çubuğunda ve seç ".
   3. Objektif büyütme ayarlayın ve yolu kaydedin. Belirgin hiçbir üzerine yazma meydana tüm görüntüleri ve dosyaları isim emin olun. Geniş alanları yakalamak için gerekli olan ek zaman önemli miktarda, görünüm veya çizgiler (Bu çalışma için 720 satır kullanmak) sayısı alanını ayarlayarak ayarları alan yakalama değiştirin. Son olarak, pozlama süresini (bu çalışmada 0.25 sn) ayarlayın. Varsayılan her şeyi bırakın ve resmi görebilmek için "Önizleme HSİ" butonuna tıklayınız.
      Not: görünür yoğunluğu grafiği yatay eksende kaydedilecektir HSI datacube gösterir. Dikey eksen HSI datacube yakalanır spektrumları dalga boylarını gösterir. Spektral dalga boyuna karşılık gelen yoğunluk grafiği üzerinde herhangi bir pozisyonda imleci yerleştirmek görüntünün genelinde tüm noktaların yoğunluklarını neden, o dalga boyunda, gösterilecek.
   4. Bu görüntüdeki doruklarına keskinleştirmek için ince objektif odak ayarlayarak bu önizleme dayalı Odak. Bu çok zorsa, optik kameranın odak uzunluğu oldukça benzer, yani optik görüntüleme yazılımı yüklemek ve optik kamera, odak kaydırma çubuğunu kaydırmak ve ardından hiperspektral görüntüleme yazılımı dönün ve hiperspektral kamera kaydırma çubuğunu iade .
   5. Ya da pozlama süresini ayarlamak için önizleme iptal ederek kaynak parlaklık, kondansatör odağı ayarlayarak bu önizleme yoğunluğunu ayarlayın. İkinci en iyi sonuçları verir, ancak artan pozlama süresi görüntü uzun sürebilir. Amaç daha önemli pikler yeterince büyük, fakat dedektör için maksimum yoğunluğu aşmayan olmak içindir; Burada ideal aralık 1000 ile 16.000 adettir.
   6. "Yakalama" tıklayın. Mikroskop karanlık mevcut görüntü almak isteyebilir. Uyum rahatsız etmeyecek şekilde, üst kaydırma çubuğunu ya da dikkatlice açıklığı (yönlendirve diğer optik herhangi odak noktası) ve "Tamam" a tıklayın. Doğru konuma kaydırma çubuğunu veya diyafram Restore ve görüntü belirir istemi yine "Tamam" a tıklayın. Yaklaşık 5 dakika kat daha tipik olmasına rağmen Görüntüleme, 30 dakika kadar sürebilir. Uzun pozlama kat daha uzun görüntüleme sürelerine yol. Bir ilerleme göstergesi mevcuttur. İlerleme göstergesi tamamlanmadan önce fiziksel kapsamı rahatsız etmemek için dikkatli olun.
   7. Adları ile dört yeni pencereler dikkat edin: "Mevcut bantlar listesi", "# 1zoom", "# 1scroll" ve "1. RGB bandı". Bu gelecekteki tüm referanslar için datacube olduğu gibi "# 1RGB bant" penceresi maksimize.
   8. Sağ datacube tıklayın ve TIFF olarak kaydedin ve "Tamam" a tıklayın. Bitmiş görüntüleme Eğer; Tüm örnekler kenara; Suda% 70 izopropanol ile tüm petrol maruz kalan yüzeyleri temizlemek; maksimum yüksekliğe sahne yükseltmek; faaliyet dışı pozisyonuna asgari yükseklik ve basına alt kondansatör; kapamakveya aşağı ışık kaynağına, sahne denetleyici ve kameralar çıkarın.

Referans Spektral Kütüphaneleri Oluşturma 3.

1. Referans Spectra Seçimi
   1. HSI spektral profiller matris bağlı olmasından dolayı, deney örnekleri ile aynı matris içinde ihtiva ilgi malzemesini ihtiva etmek için bilinen bir pozitif kontrol seçin.
      1. Bu çalışma için, topik maruz çalışma deneysel domuz derisi dokuya karşılaştırma için metal oksit olarak nanopartiküller pozitif kontrol, yüksek dozlarda enjekte domuz deri kullanın. Süspansiyon içinde metal oksit nanopartiküllerinin spektral profiller, farklı matrislerde üretilen incelenmiş ve histolojik deney örnekleri için uygun olmayan bir pozitif kontrol olarak bulunmuştur.
   2. Aşama 2.4 anlatıldığı gibi pozitif kontrol bir datacube edinin., Hiperspektral kamerayı kullanarak.
      1. Özellikle dikkatli olun zaman seBu iç partikül filtresi malzemelerini tespit edecek olan birincil metrik olarak, yoğunluğu tting. Detektör (burada, 16000 adet) doyma noktasının üzerinde herhangi yoğunlukları (2.4.5 adıma bakın.) Geçersiz veri neden olur.
   3. Sağ görüntü penceresinde tıklatın ve "Z-profil spektrum" sol tıklayın. Bir pop-up Spektral Profili penceresi açılacaktır. Datacube üzerinde ilgi piksel, özellikle parlak olanlar veya güvenle ilgi malzemesi temsil olarak tespit edilebilir olanlar üzerine tıklayın bıraktı. Ilişkili spektrumunu gösteren spektral Profil penceresini gözlemleyin. Özellikle de düşük ve en yüksek değeri olan ve dalga boyu kendisine karşılık bir not alın.
      1. Çevre dokuya çok parlak akraba, kolayca tanımlanabilir parçacıkları ile özellikle olanlardır ilgi alanları tıklayarak pozitif kontrol numunesi, anket ölçme yaparken. Bu parçacıklar mater olması en muhtemelÖzellikle metalleri durumunda ilgi IALS.
   4. Datacube mevcut parçacıkları tanımlamak için "Parçacık Analizi" menüsü altında "Partikül Filtresi" aracını kullanın. Yeni açılan pencerede, "Spektral Max aşıldı gerekir" gözlemlemek. Bu aşamada 3.1.3 gözlemler tarafından belirlenecektir. Bu ilgi malzemelerden daha arka pikselden daha yüksek, ancak daha düşük olduğu için bu değeri ayarlayın. "Geçerli Veri Max" maksimum yoğunluk (burada, 16.000 adet) olduğunu.
      1. Varsayılan diğer parametreleri bırakın, ama "Boyut Eşik" kutucuğunu ayarlayarak büyüklüğüne göre nesneler dahil değildir. Ya bu noktada, ya da analiz çalıştırdıktan sonra bu verileri kaydetmek. Bu deney için, aşağıdaki parametreleri kullanın: Spektral Max aşıldı Must: 5,000; Geçerli Veri Max: 16000; Boyut Eşik (piksel): Tüm parametreler ayarlandıktan 400, "Tamam" düğmesine tıklayın.
   5. Detayları ile ortaya çıkan grafik gözlemleyinbelirtilen yoğunluk eşik içinde tespit parçacıklar; Bu veriler ihraç edilebilir. Ilgi malzemenin karakteristik maksimum dalgaboyu yansıma biliniyorsa, benzer bir "Azami WL" değerine sahip olan partikülleri seçmek; Aksi takdirde, "Tüm seçmek" butonuna tıklayınız. Daha sonra "Export" üzerine tıklayın; "Kime Spektral Kütüphanesi". Bir dosya adı daha sonra "Tamam" butonuna tıklayınız seçiniz.
2. Yanlış pozitif Spectra Kaldır
   1. Bir negatif kontrol olarak hizmet edecek bir örnek seçin. Bu gibi bir numune hazırlanmıştır ve deney örnekleri ilgi malzemeye benzer veya aynı nanopartiküllerin olmaması garanti olması dışında aynı şekilde muamele edilmiş olmalıdır.
      NOT: Bu HSI spektral profiller matriks bağlı olarak negatif kontrol matrisi, deney örneklerinin matris ile aynı olması önemlidir. Bu çalışma için, negatif olarak metal oksit Nanomalzemelerin maruz değildi domuz cildi kullanılankontrol eder.
   2. Hiper bantlı kamerayı kullanarak, aşama 2.4.7 tarif edildiği gibi negatif kontrol birkaç datacubes elde edilir. (Bu, bazı kirletici referans spektrumları olabilir durumunda özellikle önemlidir) en az bir gerekli olduğu, ancak daha fazla seçiciliğini arttırmak için yakalanabilir.
   3. Aşağıdaki adımlarda belirtildiği şekilde, seri adımda yakalanan 3.2.2 (negatif kontroller) her datacube karşı adım 3.1 (pozitif kontrol) toplanan spektral kütüphane filtrelemek için hiperspektral görüntüleme yazılımını kullanın:
      NOT: Ayrı bir dosyaya sonuçlanan filtre spektral kütüphane kaydedin ve ilgi malzeme için referans spektral kütüphane olarak kullanmak.
      1. Ana program araç çubuğunda bulunan Analiz menüsü altında "Filtre Spektral Kitaplığı" tıklayın. "Aç" seçeneğini tıklayın; "Yeni Dosya" ve adım 3.1 oluşturulan spektral kütüphane seçin. Girdi dosyası olarak pozitif kontrol için. "Tamam" ı tıklayın.
      2. Earici kaynak, Spektral Veri kutusunun altında "Görüntü" seçeneğini seçin. İşleme Parametreleri kutusuna altında varsayılan ayarları saklayın. Filtreli Kütüphanelerinin bir çıkış Name (bu orijinalinden daha farklı olmalıdır, ya da toplanan ham spektral kütüphane kaybolur) seçin. "Tamam" ı tıklayın.
      3. "Aç" seçeneğini tıklayın; "Yeni Dosya" ve kaynak görüntüyü seçmek istendiğinde negatif kontrol için adım 3.2.2 yakalanan ilk datacube seçin.
         NOT: Yazılım spektral kütüphane analiz ve negatif kontrol datacube herhangi spektrumunu eşleşen her spektrum kaldıracaktır. Seçim kriterleri arka planı çıkarma dolayısıyla yanlış pozitif olasılığını azaltır. Bu (bu özet otomatik olarak kaydedilir olmadığını not) yapıldığında özeti sunulacak.
      4. Adım 3.2.3.3 sonrasında ortaya çıkan (oluşturulan son filtrelenmiş spektral kitaplığı seçin, adım 3.2.3.2 co: Ek filtreleme isteniyorsa, dışında adım 3.2.3.1 itibaren tekrarlayın.mpletes); adım 3.2.3.3 yılında adım 3.2.2 sonraki datacube seçin.
         NOT: Numuneler ışık önemli miktarda (örn karbon nanotüpler) ve dağılım lamba spektrum için düzeltme ve normalize gerekli olabilir / veya negatif kontrol karşı pozitif kontrol spektral kütüphane filtreleme zaman sıfır spektrumları kalırsa. Bu koşullar Çalışmamızda için ortaya çıkmadı ve böylece bu düzeltme yapılmadı.

4. Görüntü Analizi

1. Spektral Açı Haritalama
   1. Tüm deney datacubes adım 2.4 aşağıdaki elde edilmiş bir kez hiperspektral görüntüleme yazılımı kullanarak, spektral menüsünden, Haritalama Yöntemleri alt menüsünden "Spektral Açı Eşleyicisi'ni" (SAM) açın. Spektral açı Eşleyicisi geometrik dalga boyunun bir fonksiyonu olarak yoğunluk değişiklikleri analiz ederek spektrumları karşılaştırır (yani, onların yoğunluğunu normalleştirilmesi ve açılar yeniden karşılaştırarak iki spektrumları karşılaştırırHer spektrumları grafik) ²⁴ iz quired.
   2. Açık datacube ile pop-up pencerede deneysel datacube adını seçin ve "OK" butonuna tıklayınız. Hiçbir dosya adları listede ise, "açık" tıklayın; "Yeni dosya", deneysel datacube seçin, ardından "Tamam" a tıklayın.
      1. Sonlu üyeyi Koleksiyonu adı verilen yeni bir pop-up penceresi gözlemleyin: SAM. Daha sonra "Spektral Kütüphane dosyadan" seçeneğini seçin, menü çubuğunda "Al" a tıklayın. Adlı spektral Kütüphane Giriş Dosya görünecektir Bir pop-up penceresi. Adımda 3.2.3 oluşturulan referans spektral Kütüphanesi açın. ve "Tamam" a tıklayın. "Giriş Spektral Library" adlı yeni bir pop-up penceresi gözlemleyin.
      2. "Tüm Ürünleri Seç" seçeneğini tıklayın; "Tamam" doğru "Renk" linkine tıklayın ve seçin tıklayın "Tüm varsayılan renkleri uygula." Click "Uygula" ardından "Tümünü seç" ve ardından çıkış dosya adı seçin"Tamam" düğmesine tıklayın. Spektral Açı Mapper verileri analiz etmek ve kaydetmek için birkaç saniye sürer.
   3. Hiperspektral görüntüleme yazılımı datacube açın. Resim penceresinin Yerleşimi menüsünde "Sınıflandırma" seçin, ardından dosya adına gidin ve "Tamam" a tıklayın. Kullanıcı şimdi onlar görüntüde eşleştirmek nerede olduğunu görmek için kütüphaneden herhangi spektrum kaplamasını sağlayabilirsiniz.
   4. Aşama 4.2 açıklandığı gibi birleşik bir renk şeması (örneğin başka bir yazılım tarafından kolay analiz için olduğu gibi, istenirse, görüntü penceresinde Yerleşimi menüsünden açılan "Etkileşimli sınıf aracı" Seçenek menüsünden "Sınıflar Birleştirme" seçeneğini işaretleyin .).
   5. (Tipik olarak "sınıflandırılamayan" dışındaki her şeyin listesi "sınıflara üssü haline birleştirmek için") birleştirmek ve "temel sınıf" listesinde tek bir spektrum seçin, ardından "Tamam" a tıklayın, tüm sınıflandırmaları vurgulayın. Olacak şimdi repres Bu renkSeçilen tüm spektrumları KBB.
   6. Seçilen renk üzerine tıklayın ve tüm eşleşen spektrumları o renkte gösterilecektir.
   7. Varsayılan olarak siyah "sınıflandırılamayan" renkler kutusunda, üzerinde siyah bir arka plan, cIick üzerinde eşleşen spektrumları gösterecek bir iki renkli bir görüntü elde etmek için. Bir iki renkli bir görüntü gözlemleyin. Bu adım "sınıflandırılamayan" renkler kutusunda tekrar tıklayarak ters olabilir.
   8. Sağ herhangi bindirmeleri anda aktif olmak üzere, bir TIFF olarak kaydetmek için tıklayın.
      NOT: Gelecekteki görüntüleme işleme için bir iki renkli görüntü kullanılacaktır.
   9. Haritalama istatistiklerini elde etmek "İnteraktif Sınıf Aracı" penceresinde Seçenek menüsünden "Sınıf Dağılımı" seçeneğini seçin. Bu veriler, birçok piksel bağlanılmayan (sınıflandırılmamış) ve kaç çıkar malzemesi olarak tespit edildi ne kadar temsil ediyor. Piksel sayısı eşlenen parçacıkların sayısı ile uyuşmuyor unutmayın. Bu bilgileri otomatik r değilecorded.
2. Hiperspektral Parçacık Analiz Görüntüler Haritalı
   1. NIH ImageJ yazılım görüntüleri açın.
   2. Alt, "Eşik" işlevini ayarlayın Görüntü menüsünü kullanın. Diğer tüm malzemelerden ilgi parçacıkları ayırt parametreleri seçin. Bu çalışma için aşağıdaki eşik parametreleri kullanın: varsayılan eşik yönteminde, renk kırmızı, renk uzayı HSB, koyu arka plan onay, renk, doygunluk ve parlaklık kontrol pas onay kutularını kontrol etti.
      NOT: Bu duruma göre önemli ölçüde değişebilir. Eşlenmiş bir datacube analiz ederken, bu tek bir renge ilgili tüm sınıfları birleştirecek ve görüntü (4.1.8 için 4.1.4 adımları) oluşturmadan önce tüm sınıflandırılmamış renkleri ile bu renk overlaying tarafından basitleştirilmiş olabilir.
   3. , Bölgenin bilgi almak anlamına gelecektir işlevi, minimum ve maksimum değerleri "parçacıklar Analiz", analiz menüsünü kullanın. Boyut 0-sonsuz, dairesellik: Bu çalışma için, burada parametreleri kullanın0-1, gösteri şey, görüntüleme sonuçları onay kutusunu kontrol etti.
   4. İstatistiksel analiz için, benzer kontrol örneklerinde bulunan parçacıkların sayısı ve boyutu ile istatistiksel karşılaştırma sağlayan başka bir yazılım programına bu veri ihracat. Biz ImageJ verilerinin analizi için bir elektronik tablo kullanmanızı öneririz. Adım 4.2.4 sonra sonuçları tabloda görüntülenen veriler bir elektronik kopyalanması gerekir. ORTALAMA işlevi bir parçacığın ortalama boyutunu belirlemek için Konum kolonu üzerinde kullanılabilir iken MAX, parçacıkların sayısını belirlemek için, ilk (başlıksız) kolonu üzerinde kullanılabilir. Gelecekte, deneysel doğrulama (örn, TEM) boyutlandırma için kurulmuş bir standarda karşı ortalama boyutunu belirlerken bu fonksiyonu araştırmak için takip edilecektir.

Sonuçlar

Hyperspektral mikroskopi spektrofotometri edilene benzer bir şekilde malzemeleri belirlemek için kabiliyeti için yararlıdır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, her bir malzemenin çeşitli özellik spektrumu ve eşi olmayan yansıtma bir genel şekle sahiptir. Bundan başka, Şekil 1, spektral profiller matriks bağlı doğasını göstermektedir: histolojik doku örneklerinde üç metal oksitler, her (üst panel) için spektral profiller sulu süspansiyon içinde üç metal oksitler her biri için spektral profiller (farklıdır alt panel). Aynı matriste bilinmeyen numunelerin karakteristik spektral profiller haritalama ile, bu teknik bir malzemenin varlığını veya yokluğunu belirlemek için yararlıdır ve aynı zamanda yarı-nicel örnekleri malzemenin nispi miktarları karşılaştırın.

Pozitif kontrol cilt örneklerinden oluşturulan referans spektral kütüphaneler deneysel eşleme için uygunderi numuneleri. Şekil 2 de görüldüğü gibi, referans spektral kütüphaneleri karşılık gelen pozitif kontrol de harita ve karşılık gelen negatif kontrol ile eşleşmeyen.

Tekniğin en önemli avantajı, örneklerde söz konusu malzemelerin düşük seviyelerde tespit etmek için, hem de kirletici maddelere karşı ayırt etme yeteneğidir. . Örneğin, tek tek nanotüpler 20-30 g sıçan ²⁵ 40 ug kadar düşük dozlarda inhalasyon sırasında akciğerlerin gözlemlenebilir Şekil 3, bu histolojik deri örneklerinde gösterilmiştir: bazı parçacıklar karanlık alan optik görüntü kolaylıkla belirgin iken (sütun 2), diğerleri aydınlık mikroskobu (sütun 1) ya da diğer yöntemler kullanılarak kaçırmış olabileceğini hiperspektral görüntüleme (sütun 3) kullanılarak tespit edilir. Karanlık alan HSI kullanımı da basit aydınlık mikroskobu üzerinde özgüllüğünü artırmak için hizmet vermektedir. Bu görüntüler daha sonra, analizin daha nicel formlarına maruz olan nImageJ ile otably partikül analizi.

Geliştirilmiş karanlık alan mikroskopi da hiperspektral görüntüleme yokluğunda çeşitli uygulamaları vardır. İlk yüksek kalite, yüksek kontrastlı görüntüler oluşturmak için yeteneğidir. Bu en iyi örneğin, ilgi konusu parçacıklar aydınlık muadillerine göre kolaylıkla tanımlanabilir, Şekil 3 ile gösterilmiştir. Hiper bantlı haritalama yokluğunda, dikkatli bir ilgi parçacıktan bir kirletici parçacık kafa önlemek için gerekli olsa da bu görüntüleri de kantitatif partikül analizine tabi olabilir.

Spektral kitaplıkları (süspansiyonda nanopartiküller) ile karşılaştırıldığında Şekil 1. Referans spektral kütüphaneler (doku matrisi). Bu rakam nan bir referans spektral kütüphane üreten önemini göstermektedirdeney örnekleri ile aynı matris içinde ilgi omaterials. Ilk satır bu çalışmada (alümina, silika ve seryum) her malzeme için referans spektral kütüphane (RSL) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu RSL pozitif kontrol doku örneği negatif kontrol doku örneklerinden karşı süzüldü Bu protokol, tarif edilen yöntemle hazırlanmıştır. İkinci satır bir bardak slayt sıvı süspansiyon ilgi nanopartiküller oluşturulan spektral kütüphaneleri (SL) gösterir. Daha kavisli ve daha az farklı zirve yaklaşık 650 arasında bir dalga boyunda yaklaşık 600 silika, bir zirve için alümina NP süspansiyon SL görülmüştür, oysa alüminyum için, 500 ve 650 dalga boyunda iki modlu bir tepe RSL bulunan oldu Bir daha kavisli ve daha az belirgin zirve arou de silika NP süspansiyon SL görüldü ise rsl mevcutDaha az belirgin tepe Bu NPler gömülü olduğu matris oluşturur anlaşılacağı etrafında 560 de seryum dioksit NP süspansiyon SL görülmüştür, oysa nd seryum için 600, iki modlu bir pik, RSL, 520 ve 620 dalga boyunda saptandı gibi belirli deney için SL oluşturmak için kontrolleri seçerken önemli olabilir spektrumları bir kayma.

Şekil 2. Referans spektral kütüphaneler (doku matrisi) pozitif kontrol ve negatif kontrol domuz deri dokusunun haritalanmıştır. Her RSL (sol sütun) karşılık gelen pozitif kontrol (orta sütunda) iyi eşler ve onun negatif kontrol (sağ sütun) karşılık gelen eşleşmiyor ki bu rakam., Deneysel örnekleri haritalama uygun olarak RSL'lerin teyidi olarak hizmet vermektedir Lütfen h tıklayınere bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Metal oksit nanopartiküller maruz deneysel domuz cilt dokusunun Şekil 3. Hiperspektral haritalama. Sırasıyla, epidermis, dermis ve derialtı dokusu: üstten alta satırlar farklı yüzeysel gelen derin katmana derinin katmanları, karşılık gelmektedir. Ilk satır süspansiyon alümina NP maruz bir cilt örneğinden epidermis stratum corneum göstermektedir; İkinci sıra süspansiyonda NPs silis maruz bırakılmıştır; ve üçüncü sıra süspansiyon içinde NPs CERIA için. Her sütun farklı tekniklerle görüntülü derinin aynı bölgede gösteriyor. İlk sütun bir kırmızı kare içine alan büyütülmüş olan aydınlık mikroskobu (40X mag .; ölçek çubuğu = 50 mikron), karşılık (100X mag; ölçek çubuğu = 10 um) gelişmiş karanlık alan mikroskobu ile (EDFBeyaz oklar yüksek kontrast NPS işaret ediyor ikinci sütunda, M). Üçüncü kolon, aynı yüksek kontrast NPs (beyaz oklar) gösteren bir hiperbantlı kamera (SBE) elde edildi. EDFM ve HSI görüntüleri 100X büyütmede alındı; Ölçek çubuğu 10 mikron =. Dördüncü sütun alümina NPS yeşil, kırmızı silis NP ve seria NP gösterilmektedir her maruziyet grubu için ayrı ayrı rsl karşı eşleştirilmiş HSI görüntü gösterir, sarı, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Geleneksel histolojik lekeleme, metal oksit nanopartiküllerinin belirlenmesini ve analiz geçirmiş doku örnekleri EDFM, HSI haritalama ve görüntü analiz teknikleri bir kombinasyonu ile elde edilebilir için. Bu örnekler uygun görselleştirme için 5-10 um kalınlığında kesitlere ayrıldı edilmesi önemlidir, histoloji ve imünohistokimya için numune hazırlamada esneklik (leke tipi, örneğin, sabit ya da dondurulmuş dokuları kullanılarak) varken. Burada kullanılan örnekler hematoksilin ve eosin ile boyanmış ve dakika, cam mikroskop lamları üzerine monte edilmiş, formalin ile sabitlenmiş ve parafine gömülmüş önce 6 um kalınlığında bir döner mikrotom kesit edildi. Bir ex vivo deri penetrasyon toksikoloji işbirliğinden domuz deri dokuları, bu çalışma için kullanıldı. Dokuların sulu süspansiyonlarda, metal oksit nanopartiküllerinin (alüminyum oksit, silis, seryum oksit) maruz bırakıldı. Ilgi bölgesi (ler) in tespiti (yüksek kontrast elemeNTS) EDFM ile müteakip HSI haritalama ve analiz kolaylaştıran önemli bir ilk adımdır. Pozitif ve negatif kontrol örnekleri görüntülü ve başvuru için bir spektral kütüphane oluşturmak amacıyla ilk analiz edilmelidir. Pozitif kontrol toplanan spektrumları bir pozitif kontrol spektral kütüphane ihraç edilmektedir. Daha sonra, negatif kontrol görüntülerden bütün spektrumlar özgüllüğünün geliştirilmesi için pozitif kontrol spektral kütüphanesinden çıkarılır (yanlış pozitif azaltmak için). Elde edilen filtre spektral kütüphanesi olan söz konusu malzemelerin analizi için karşılık vermektedir RSL olarak kabul edilir. Tüm doku örnekleri aynı görüntüleme sürecinden geçmeleri ve RSL karşı eşleştirilir. Ortaya çıkan görüntü siyah arka plan üzerinde ilgi unsurları ile tek alanlar içerecektir. Bu görüntü daha sonra ImageJ görüş alanı başına eşlenmiş parçacıkların alanı elde etmek onun eşik ve parçacık analizi fonksiyonları kullanılarak analiz edilebilir. ImageJ elde edilen sayısal veri ihracat olabilirdaha fazla analiz için bir elektronik tabloya ed.

Bu biyolojik örnekler birbirlerinden doğal farklıdır ve boyama yöntemleri EDFM ve HSI aracılığıyla görselleştirme etkileyebilir olarak, pozlama ayarları numunenin belirli bir tip için en yüksek kontrastlı görüntü üretir ne uygun olarak belirlenmesi gerektiğini dikkate almak önemlidir. Yanlış pozitif azaltılması spektral kütüphanelerin filtrasyon yoluyla elde edilebilmesine rağmen, bu kirlenmeye karşı gelen spektrumları potansiyel olumlu denetimin spektral kütüphanesinden filtrelenmiş olabilir gibi, bu ilgi elemanı ile kirlenmesini kaçınmışlardır güvenilir negatif kontroller elde etmek için önemlidir yanlış negatif oranlarının artırılması. Sp üretmek biriken parçacıkların yüksek sayıda alanları: Ayrıca, hiperspektral görüntüleme yazılımı ile saptanabilir spektrum yoğunluğu aralığı, belirli yazılım sınırını aşmak olamaz (Bu çalışma için, yani 16.000 adettir)yoğunluk sınırının üzerinde ectral yoğunluklarının yanlış negatif sayısının artması riskine karşı, spektral kütüphane dışına bırakılır.

HSI sistemi, geleneksel yöntemlere göre birçok avantaj sağladığını da, dikkate alınması gereken bazı dezavantajları ve sınırlamalar vardır. Biri büyük işlem gücü gerekebilir toplanan optik veri büyük miktar. Başka bir referans spektral kütüphaneler oluşturulan edilirken HSI, özellikle başlangıç ​​aşamalarında, zaman yoğun olabilir olduğunu. Ayrıca, görüntüleme süresi, basit karanlık alan görüntüleme olmadığı kadar yavaş yapım, görüntü yakalama başına birkaç dakika gerekebilir; Ancak, yine de elektron mikroskobu ile numune alma hazırlığı ve görselleştirme gerçekleştirmek daha hızlıdır. Ayrıca, karmaşık sistemler son derece uzmanlaşmış kontrollerin geliştirilmesini gerektirmektedir ve ²⁶ zorlu standart, evrensel bir referans kütüphanelerinin kurulması yapmak çoklu karakteristik spektrumları, neden olabilir. Son olarak, teknolojiBireysel atomları çözebilirsiniz gibi atomik kuvvet mikroskobu veya transmisyon elektron mikroskopisi olarak probe- veya elektron mikroskopi teknikleri, daha düşük çözünürlükte nique sonuçları. Bu tekniğin çözünürlüğü nedeniyle nanometre düzeyinde veya hassas bir alt mikron seviyesinde malzemelerin bulmak için partikül boyutlarını ölçmek için yüksek hassasiyetli aracı olmaktan önler onun fotonik doğası, sınırlıdır. Teknik, bazı doku bölmeleri veya hücresel organel içindeki parçacıkları saptamak mümkün olsa da (örneğin hücre çekirdekleri gibi) 1'den büyük um, küçük organelleri veya özellikler bu yöntemle doğru görselleştirmek için zorlamaktadır. Ayrıca kendi uzamsal çözünürlük verilen notun, bir, bu yöntem tek nanopartiküller ve aglomeralarla ¹¹ arasında ayırt edemiyor.

Diğer hususlar şunlardır: (böyle asil metaller gibi) bazı malzemeler daha kolay analı yapabilirsiniz, hangi çok daha yüksek yansıtma ve farklı spektral profilleri varze ve bu araç ile Işıksal haritası. Bu tür yarı-metalik araştırıldı oksitler ve karbon bazlı nano ^{24, 27,} gibi diğer nedeniyle temel bileşikler şekline daha zor olabilir, ve matris bağlı olabilir. Tarafından Mercer ve ark., Iki fare soluma çalışmalarında, bu çalışmada kullanılan birine benzer bir sistem akciğer ve çevre dokuların ile son derece yüksek kontrastlı dayalı ikincil organlarda karbon nanotüpler bulmak amacıyla kullanılmıştır. Karbon fiberlerin benzersiz şekli tanımlanması için yeterli bir özelliği olduğu için ancak hiperspektral haritalama, her iki çalışmada da olasılıkla gösterilmemiştir. Normal biyofizik süreçlerle belirli organları ilgilendiren nanopartiküller yatırılması (ve genellikle kendisi çalışmanın konusu) öngörülemeyen olduğundan, uygulanabilir bir pozitif kontrol belirlenmesi zor olabilir ve kontrol m nasıl nesil göz önüne alınmasını gerektirir: Başka bir göz dokularında özellikle ilgilidirilgi konusu bir malzeme durumunu etkilemez uş. Spektral kütüphane ilgi bozulmamış nanopartiküller oluşturulur Örneğin, nedeniyle değişiklik nedeniyle, örneğin parçacık (değişmesi sonucu spektrumları değişikliklere dokuların veya hücrelerin bu aynı nanopartiküller kütüphaneyi eşleme zor olabilir pH, çözünme, aglomerasyon, protein bağlama) ve genel mikroçevresinin veya matris. Son olarak, teknik olarak yarı-kantitatif doğada sınırlıdır: sadece kolay bir malzemenin toplam organı yükünü karakterize gibi görevleri yerine getirmek için kullanılabilir anlamına gelir içindeki çözünürlüğü, diğer iki boyutlu mikroskopi teknikleri gibi nicel olabilir.

Genel olarak, EDFM ve HSI, TEM, HAADF ve DIC gibi geleneksel nano malzeme görüntüleme ve karakterizasyon teknikleri, oranla birkaç avantaj sağlamaktadır. EDFM / HSI daha yoğun konvansiyonel kıyasla zaman ve maliyet tasarrufu daha hızlı görüntü elde etme ve analizi için izin verirtional teknikleri. Buna ek olarak, EDFM / HSI için numune hazırlanması zaman kazandırır ve daha sonra diğer teknikler kullanılabilir çünkü bu da belirli bir örnek daha esnek analizi için izin veren, genellikle en az tahribatsız hem de. Bundan başka, bir çok HSI bileşimlerin nano ölçekli maddelerin analizi için matrislerin çeşitli sağlayan çok yönlüdür. Araştırma ekibi teknolojisinin özgüllük derinlemesine bir değerlendirmesi dahil diğer malzemeler ve örnek türleri için burada anlatılan yöntemi geliştirmek için çalışıyor. Araştırma ekibi tarafından soruşturma altında eleştirel bir sonraki adım, geleneksel altın standartlarına karşı bu tekniklerin doğrulama (örneğin, Raman, TEM, SEM) malzeme ve ilgi doku tipleri için.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.