Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

Resumen

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Resumen

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG₁). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

Introducción

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today¹. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat². Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population³. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage⁴. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.

Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat⁵ and decomposed samples⁶ but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs^7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork⁹, beef¹⁰ and catfish¹¹. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available¹², and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States¹. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats.

Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses¹³, but it is rarely used for identifying proteins in meat^14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

Protocolo

Declaración de Ética: El estudio se realizó de acuerdo con las directrices internacionales y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad Nacional de Chiayi, aprobación ID: 99022. El uso de la muestra de cetáceos fue permitido por el Consejo de Agricultura de Taiwán (Permiso de Investigación 100M-02.1-C-99).

1. Preparación de la muestra del músculo y SDS-PAGE

Nota: Las muestras de músculo de 23 especies, incluyendo 16 especies de mamíferos marinos, 5 especies de mamíferos terrestres, el atún y el pollo se utilizaron en este estudio (Tabla 1). Las muestras de músculo de cetáceos se obtuvieron de individuos varados, la captura incidental de la pesca, y la confiscación. Conejo, rata, perro, y los tejidos musculares de pollo se obtuvieron a partir del Centro de Diagnóstico de Enfermedades Animales de la Universidad Nacional de Chiayi. Las muestras de carne de res, cerdo, cordero, y el atún se adquirieron en un supermercado local. La muestra de músculo de foca común (Phoca vitulina ) fue proporcionado por Farglory Ocean Park. se utilizó dodecil de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para separar las proteínas solubles con diferentes pesos moleculares en muestras de músculo.

1. Almacenar todas las muestras a -20 ° C hasta su uso.
2. Mortero pre-enfriamiento a -20 ° C. A continuación, poner 3 g de muestra de músculo congelado en él.
3. Homogeneizar la muestra con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría utilizando un homogeneizador de tejidos.
4. Centrifugar la muestra homogeneizada a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recoger los sobrenadantes y almacenarla a -20 ° C hasta su uso.
5. Preparar 5 ml de 5% gel de apilamiento (3,07 ml de agua destilada, 1,25 ml de tampón de gel superior 4x de pH 6,8, 625 l de 40% de acrilamida, 50 l de 10% de persulfato de amonio (APS), y 5 l de tetrametiletilendiamina ( TEMED)) y 10 ml de 15% de gel de separación (3,65 ml de agua destilada, 2,5 ml de 4x inferior tampón de gel de pH 8,8, 3,75 ml de 40% de acrilamida, 100 l de 10% de APS,y 4 l de TEMED).
   1. En la celda de electroforesis, se vierte gel de apilamiento (5% de acrilamida) en la parte superior del gel de separación (15% de acrilamida) después de que éste se haya solidificado. Inserte un peine de gel en el gel de apilamiento.
6. Realizar PAGE de acuerdo con las siguientes condiciones: condición inicial de ejecución: 100 voltios, 20 min y la condición final: 120 voltios, 40 min.
7. Tinción del gel con azul brillante de Coomassie a temperatura ambiente durante 30 min hasta que el gel es uniformemente de color azul.
   Nota: La tinción se completa cuando el gel ya no es visible en la solución de colorante.
8. Destain con solución de ácido acético (10%) a temperatura ambiente durante 1 hr. Bandas comenzarán a aparecer. Continuar la decoloración se deben a 4 ° C durante la noche hasta que el fondo es claro.

2. Síntesis de péptidos y Producción de anticuerpos monoclonales

1. Recuperar las secuencias de aminoácidos de Mb de GenBank incluyendo el atún, pollo, avestruz, mamíferos domésticos, sello y 18 especiesde los cetáceos (Tabla 2).
2. Alinear las secuencias utilizando el software adecuado ^16:
   1. Iniciar el explorador de alineación seleccionando la Align: Editar / Construir alineación en la barra de inicio; seleccione Crear nueva alineación y haga clic en OK. Aparecerá un cuadro de diálogo preguntando "¿Está construyendo un alineamiento de secuencias de ADN o proteínas?"
   2. Haga clic en el botón "proteína"; seleccione Datos: Open: Recuperar secuencias de archivo y seleccione el archivo de secuencias; seleccione Editar: Seleccionar todo comando de menú para seleccionar todos los sitios para cada secuencia en el conjunto de datos para crear un alineamiento de secuencias múltiples.
   3. Seleccione Alineación: Alinear por ClustalW en el menú principal para alinear las secuencias de datos seleccionados utilizando el algoritmo ClustalW; seleccione "BLOSUM" como el peso de proteínas de matriz a continuación, haga clic en el botón OK.
3. Analizar la alineación de la secuencia:
   1. Concéntrese en 5 SI reactivo antigénicoTES ^17: 1 sitio (AKVEADVA, 15-22), el sitio 2 (KASEDLK, 56-62), el sitio 3 (ATKHKI, 94-99), el sitio 4 (HVLHSRH, 113-119) y el sitio 5 (KYKELGY, 145- 151) y encontrar el fragmento conservado entre los cetáceos. Un * (asterisco; símbolo de consenso en la alineación (Protocolo 2.2.3)) indica las posiciones que tienen un único residuo, totalmente conservada. Se encontraron las siguientes fragmentos conservados en los cetáceos: secuencia KASEDLKKHG (que incluye el sitio 2) y la secuencia HVLHSRHP (que incluye el sitio 4).
4. Sintetizar fragmentos de secuencia candidatos de acuerdo con el análisis de la secuencia, y el conjugado con una proteína de ovoalbúmina (OVA) como proteína portadora usando servicios comerciales.
   1. Añadir aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, metionina) a la N-terminal de sitio reactivo antigénico para prevenir el péptido de la descomposición (por ejemplo, M-KASEDLKKHG).
   2. Alargar el C-terminal de sitio reactivo antigénico para exponer el sitio antigénico núcleo a la de inmunocitos. Además, conjupuerta del péptido con OVA mediante la adición de una cisteína (Cys, C) a la C-terminal (por ejemplo, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. Emulsionar adyuvante completo de Freund para inmunógeno 1 o adyuvante incompleto de Freund para inmunógeno 2 con un volumen igual de cada péptido sintético en PBS (3 ml, concentración final de 30 a 50 g / 100 l).
6. Inocular inmunógeno 1 (0,1 mg) por vía subcutánea en cada uno de los ratones 5 hembras BALB / c.
7. Realizar inyecciones de refuerzo subcutáneas cinco veces usando inmunógeno 2 en intervalos de dos semanas y recoger los sueros de ensayo por muestreo clip de la cola de los ratones antes de cada refuerzo.
8. Determinar el título de los sueros para la primera proyección.
   1. Disolver 100 g de péptido libre en 25 ml de tampón de reacción y parte alícuota de 50 l de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Añadir solución de reactivo de acoplamiento 10 l en cada pocillo y mezclar la placa. Incubar la placa durante 2 horas a temperatura ambiente.
   2. Retire el contenido del pozo,lavar cada pocillo 3 veces con agua destilada, y bloquear la placa mediante la adición de 200 l de solución de bloqueo. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Retire el contenido y lavar cada pocillo 3 veces con agua destilada.
   3. Realizar ELISA indirecto (Protocolo de 5.1 a 5.7) para determinar el título de los sueros para la primera proyección. Elige el ratón con el título más alto (el más alto de la densidad óptica) para la recolección del bazo.
9. Tres días antes de la recolección del bazo, inocular 0,1 mg de inmunógeno 1 por vía subcutánea en el ratón presentar el título más alto.
10. Recoger las células del bazo de los ratones inmunizados seleccionados y se fusionan con células de mieloma murino F0 (SP2 / 0-Ag14) para obtener células de hibridoma para la generación de mAb ^18.
11. 14 días después de la fusión, seleccionar los clones positivos mediante el cribado de la reactividad de los sobrenadantes de hibridoma hacia péptido sintético sin el uso de ELISA indirecto (Protocolo de 05.01 a 05.07).
12. Diluir las células con un número apropiado por pocillo durante maximizing la proporción de los pozos que contienen sólo un clon único (clonación de dilución).
    1. Añadir 100 l de medio de cultivo celular a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos, excepto A1 así que se deja vacía.
    2. Añadir 200 l de la suspensión celular a bien A1. A continuación, traslado rápido 100 l de A1 a B1 y mezclar suavemente con la pipeta. Repita estos 1: 2 diluciones por toda la columna, y luego descarta 100 l de H1 de manera que termina con el mismo volumen que los pozos por encima de ella.
    3. Añadir un 100 l adicionales de medio a la columna 1 con una micropipeta de 8 canales. Entonces transferir rápidamente 100 l de cada uno de los pocillos de la columna 1 a los de la columna 2 utilizando la misma pipeta, y se mezcla pipeteando suavemente.
    4. Con las mismas puntas, repita estos 1: 2 diluciones en toda la placa. Desechar 100 l de cada uno de los pocillos en la última columna.
    5. Llevar el volumen final de todos los pozos a 200 l mediante la adición de 100 l de medio a cada pocillo. incubar plate reposo a 37 ° C en un incubador de _CO2 humidificado.
    6. Compruebe cada pocillo y marcar todos los pocillos que contienen sólo una sola colonia. Llevar a cabo dos o más clonaciones hasta> 90% de los pocillos que contienen clones individuales son positivos para la producción de anticuerpos.
13. Se tamizan los clones mediante western blot y dot blot (protocolo de 3.1 a 4.6). A continuación, las colonias de subcultivo de los pozos en los vasos más grandes para expandir las células para la obtención del MAB. Por lo general, cada clon se transfiere en un solo pocillo en una placa de 12 o 24 pocillos.
14. Medir la afinidad entre los anticuerpos monoclonales y los extractos de músculo de vaca, cabra, cerdo, perro, conejo, atún, pollo, sello, y cuatro especies de cetáceos representativos de western blot y dot blot (protocolo de 03.01 a 04.06).
15. Inocular células de hibridoma seleccionadas (hasta 3 x 10 ⁶⁾ por vía intraperitoneal en ratones para inducir la ascitis. hinchazón abdominal suele ser evidente dentro de los 7-10 días después de la inyección de hibridoma. Recoger líquido mediante una aguja hipodérmica(Menos de 20 gauge).
16. fluido de ascitis Se centrifuga (10.000 xg durante 10 min) para eliminar las células y los desechos. Filtrar a través de un filtro de 0,45 micras. Añadir 1 a 20 ml de la muestra de tampón de unión, 15 ml, y de 3 a 5 ml de tampón de elución en la columna G Sepharose la proteína. Recoger la fracción de elución que contiene el anticuerpo se purificó del fluido ascítico de ratones.
17. Determinar el isotipo de anticuerpos por kit Isotipificación de anticuerpos utilizando las instrucciones del fabricante.

3. Western Blot

1. Preparar tampón de carga 2x que contiene β-mercaptoetanol (BME) mediante la mezcla de 950 l de tampón de muestra 2x Laemmli con 50 l de BME. Diluir los sobrenadantes musculares (protocolo de 1/1 a 1/4) en tampón de carga con una relación adecuada para la obtención de buenas señales: 1:50 (cetáceos y sello) y 1: 5 (animales domésticos y de atún) utilizando anticuerpo Mb policlonal de conejo anti-humano, y 1: 1 (cerdo, conejo, pollo y atún), 1: 5 (vaca, cabra y el perro) y 1:25 (cetáceos y el sello) cuando unantibody es de sobrenadante de hibridoma.
2. muestra de calor a 95 ° C durante 5 min. Cargar las muestras en los pocillos de gel SDS-PAGE (4% de apilamiento de acrilamida y 12% de separación de acrilamida), junto con marcadores de peso molecular. Ejecutar el gel durante 5 min a 50 V a continuación, aumentar el voltaje a 150 V para terminar la carrera en aproximadamente 1 hr.
3. Colocar el gel en tampón de transferencia 1x durante 15 minutos. Transferir la proteína separada a nitrocelulosa (NC) membranas después de que se separaron mediante PAGE. Puede realizar la transferencia a 100 V durante 60 a 90 min.
4. Preparar la solución de bloqueo: 1x PBS que contiene 0,1% de Tween 20 con leche descremada en polvo 5%. Bloquear la membrana NC en 25 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Lavar tres veces durante 5 minutos cada uno con 15 ml de solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST).
5. Incubar la membrana y el anticuerpo primario (líquido ascítico o sobrenadante de hibridoma) en 10 ml de tampón de dilución de anticuerpo diluido con solución de bloqueo 5% a 4 ° C durante la noche.
6. Lavar el Membranase nuevo tres veces con PBST para limpiar anticuerpo excesiva.
7. Incubar la membrana con alcalina de cabra conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón a 1: 1250 en solución bloqueante con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Se lava la membrana de nuevo y se incuba en el cloruro de fosfato / p-nitroazul tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP / NBT) fosfatasa mezcla de sustrato para 10 a 20 min hasta que el desarrollo de color.
9. Detener la reacción por lavado de la membrana en varios cambios de agua destilada.

4. Dot Blot

1. Diluir los sobrenadantes musculares (protocolo de 1.1 a 1.4) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBST con relación apropiada para la obtención de buenas señales: 1: 5 para los animales domésticos y el atún, y 01:25 para los cetáceos y sello. Punto 5 l de las muestras sobre una membrana. Reducir al mínimo el área que la solución penetra (por lo general 3-4 mm de diámetro) mediante la aplicación lentamente.
2. Secar la membrana a temperatura ambiente (por ejemplo, </ Em> en un flujo laminar de 30 a 60 min), bloquearla con la solución en una placa de Petri de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lava con PBST.
3. Incubar la membrana con anticuerpo primario (mAb de sobrenadante de hibridoma en 1: 10.000 o fluido de ascitis en 1: 100 000 diluido en solución de bloqueo 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Uso PBST para lavar la membrana tres veces durante 5 minutos cada uno para eliminar el exceso de anticuerpo, y luego se incuba con el anticuerpo secundario (alcalina de cabra conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón a 1: 1250 en 5% de solución de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente .
5. Se lava la membrana de nuevo y se incuba en la mezcla de sustrato de fosfatasa BCIP / NBT dentro de 10 a 20 min hasta que el desarrollo de color.
6. Detener la reacción por lavado de la membrana en varios cambios de agua destilada.

5. ELISA indirecto

1. Preparar tampón de lavado (0,002 M imidazol solución salina tamponada con 0,02% de Tween 20). Lavar la placa 3 veces con el lavadoamortiguador entre cada paso siguiente (protocolo 5.2-5.5).
2. Preparar una dilución 1:25 de sobrenadantes musculares (protocolo 1.1-1.4) en tampón de recubrimiento. Escudo una placa de ELISA de 96 pocillos con 100 l sobrenadantes diluidos en 4 ° C durante la noche y bloquear con tampón de bloqueo (1% BSA en PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente.
3. Preparar una dilución 1: 2000 del mAb purificado con tampón diluido y añadir 100 l de mAb diluido a cada pocillo. Incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Agregar de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1: 200 en tampón diluido) para una incubación adicional.
5. Añadir sustrato de peroxidasa a cada pocillo (100 l / pocillo) y se incuba durante 10 a 15 min.
6. Detener la reacción enzimática por la solución de parada peroxidasa (100 l / pocillo), cuando se observa el desarrollo de color.
7. Leer la densidad óptica a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.

6. Preparación del anticuerpo monoclonal marcado con oro coloidal

Nota: El color de la solución de oro coloidal y la mezcla siempre debe ser de color rojo. Ajustar el pH, la concentración de mAb, la velocidad centrífuga cuando se observa precipitado negro. Los pasos 6.1 y 6.2 son pasos de optimización.

1. Añadir purificada detección de mAb (50 mg / ml, 3 l) a 100 l de solución de oro coloidal con valores de pH que varían de 5-9. El pH mínimo que mantiene el color rojo durante dos horas se considera como el pH óptimo. Nota: En este estudio, se utilizó 0,1 M de carbonato de potasio para ajustar el oro coloidal (40 nm) solución a pH 8,0 (pH óptimo).
2. Añadir diversas cantidades de purificados detección de mAb (500 g / ml, 1 a 20 l) a 100 l de solución de oro coloidal a un pH de 8,0. Nota: La concentración óptima en este estudio es de 6 g / ml (sin precipitado negro).
3. De acuerdo con los resultados anteriores, añadir 60 g de la detección de mAb purificado gota a gota a 10 ml de solución de oro coloidal. Emulsionar la mezcla suavemente a temperatura ambiente durante 10 min. Anunciod 2 ml de solución de 5% de BSA en PBS (pH 7,4) a la mezcla y emulsionar suavemente a temperatura ambiente durante 15 min para reducir la interferencia de fondo.
4. Se centrifuga la mezcla a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
5. Eliminar el sobrenadante con anticuerpo no conjugado con cuidado y suspender los sedimentos resultantes en 4 ml de PBST que contenía 1% de BSA y 0,1% de Tween 20, y repetir la centrifugación y la suspensión varias veces.
6. Suspender los precipitados finales en 1 ml de PBST y almacenarla a 4 ° C hasta su utilización.

7. Construcción de Inmune Strip

Nota: La Figura 1 muestra el diseño de la tira inmune. Preparar y montar las tiras en un laboratorio las condiciones ambientales de humedad baja (<20% de humedad relativa) durante el período de conservación prolongado (> 1 año). Las dimensiones de las almohadillas y membranas son: compresa de conjugado 300 mm x 10 mm, 300 mm almohadilla absorbente x 24 mm, 300 mm almohadilla de la muestra x 24 mm, Carolina del Norte membrana de 300 mm x 25 mm, mesa de trabajo 300mm x 80 mm.

1. Añadir la solución coloidal marcado con oro mAb desde el paso 6.6 con una micropipeta para saturar la almohadilla de conjugado y luego se seca a 37 ° C durante 1 hora antes de montar.
2. Distribuir el antígeno específico de captura de mAb (500 g / ml) en la zona de ensayo, y de conejo anti-IgG de ratón (500 mg / ml) en la zona de control para la detección de mAb sobre la membrana NC utilizando una impresora pipeta o immunostrip. Mantener una distancia (> 5 mm) entre las dos zonas para evitar interferencias.
3. Pegar la almohadilla conjugada, almohadilla absorbente y la membrana de Carolina del Norte en la mesa de trabajo con cinta de doble cara.
   Nota: La superposición de las pastillas en cada lado de la membrana de NC en alrededor de 2 mm. construcción tira inapropiado resultará en una prueba incompleta.
4. Coloque la almohadilla de la muestra sobre la almohadilla de conjugado (2 mm) y pegarlo en el área de trabajo.
5. Crear tiras de 6 mm de ancho con un cortador de papel. Empacar las tiras en la bolsa de papel de aluminio con desecante, y almacenar a 4 ° C hasta su utilización.

8. Prueba de reactividad cruzada

1. Homogeneizar 0,03 g de muestra de músculo crudo con 1 ml de PBS (que contiene 0,1% de BSA) en un tubo de centrífuga de 1.5 ml utilizando una vara de bambú o de molienda varilla.
2. Mantenga la tira por el extremo opuesto a las áreas de prueba y sumergir la parte de la almohadilla de la muestra en la muestra durante 5-10 minutos y observar el resultado directamente.
   1. Opcional: Recoger 500 l sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de centrífuga.
      Nota: Este paso se sugiere si la señal no es obvia cuando la tira se sumerge directamente en el sobrenadante.
3. Probar varias muestras de músculo por triplicado.
   Nota: Aquí hemos probado el atún, pollo, sello, 15 especies de cetáceos y 5 especies de mamíferos terrestres.
4. Tienen cinco inspectores independientes repiten 8,3 por cinco veces, es decir, utilizan tiras 575 en total.

Resultados

Características de anticuerpos monoclonales

Hemos desarrollado dos IgG ₁ mAb (CGF5H9 y CSF1H13) que reconocen dos péptidos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC y AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, de los cetáceos Mb, y éstos se utilizaron para construir una tira de prueba inmunocromatográfica de oro coloidal de tipo sándwich para la detección rápida de Mb de cetáceos. Figura 2 muestra que CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una sol...

Discusión

El uso de un péptido sintético conjugado con la proteína portadora es notablemente más eficaz en comparación con su proteína afín. Para una técnica basada en sándwich, debido a que el MAB se desarrolla utilizando epítopos con ubicaciones relativas conocidas, los dos anticuerpos monoclonales en este estudio no pueden interferir con la interacción de cada uno con el epítopo del antígeno diana. Además, la reactividad entre la proteína nativa y el anticuerpo de ratones inmunizados con el conjugado de péptido...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE Healthcare	28-9031-34	spin column containing Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit	Roche	11493027001	Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulose membrane	Whatman	Z613630
Antibody blocker solution	LTK BioLaboratories		To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples
BCIP/NBT phosphatase substrate	KPL	50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate	Thermo Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA reader	Thermo Electron Corporation	51118170
Colloid gold (40 nm) solution	REGA biotechnology Inc.		40-50 nm is appropriate for immunostrip
Bovine serum albumin	Gibco	15561-020
Rapid test immno-strip printer	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes
Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens
Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)	Protech		Gel preparation for SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250	Bio-Rad	1610436	Protein staining in SDS-PAGE gels
Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels