クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

要約

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

要約

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG₁). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

概要

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today¹. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat². Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population³. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage⁴. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.

Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat⁵ and decomposed samples⁶ but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs^7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork⁹, beef¹⁰ and catfish¹¹. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available¹², and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States¹. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats.

Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses¹³, but it is rarely used for identifying proteins in meat^14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

プロトコル

倫理に関する声明：本研究は、国立嘉義大学、承認IDの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって国際的なガイドラインに従って行われ、承認されました：鯨類のサンプル使用は、台湾の農業委員会（研究許可証によって許可された99022. 100M-02.1-C-99）。

1.筋肉サンプル調製し、SDS-PAGE

注：海洋哺乳類の16種、陸生哺乳類の5種を含む23種から筋肉サンプルは、マグロや鶏肉は、この試験（ 表1）で使用しました。鯨類の筋肉サンプルは二本鎖個人、漁業の混獲、および没収から入手しました。ウサギ、ラット、イヌ、およびニワトリ筋組織は、国立嘉義大学の動物疾病診断センターから入手しました。牛肉、豚肉、羊肉、マグロのサンプルは地元のスーパーマーケットから購入しました。港シール（ ゴマフアザラシ属のvitulinaの筋肉サンプル）Fargloryオーシャンパークによって提供されました。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、筋肉試料中の異なる分子量を有する可溶性タンパク質を分離するために使用しました。

1. 使用するまで-20℃ですべてのサンプルを保管してください。
2. -20℃でプレクールモルタル。そして、その中に凍結された筋肉サンプルの3グラムを入れました。
3. 組織ホモジナイザーを使用して冷たいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで試料を均質化。
4. 4℃で10分間万×gで均質化したサンプルを遠心。上清を収集し、使用するまで-20℃で保存。
5. 5％の5mlをゲル（蒸留水3.07 mlであり、pHが6.8の4倍上部ゲル緩衝液1.25mlの40％アクリルアミド、10％の過硫酸アンモニウム（APS）を50μl、およびテトラメチルエチレンジアミンを5μlの625μLを（積層調製TEMED））および15％分離ゲルの10ミリリットル（40％アクリルアミドの蒸留水3.65ミリリットル、pHが8.8の4倍より低いゲル緩衝液の2.5ミリリットル、3.75ミリリットル、10％APS100μlの、そして、TEMEDの4μL）。
   1. 後者が固化した後、電気泳動セルでは、分離ゲル（15％アクリルアミド）の上にゲル（5％アクリルアミド）を積層注ぎます。スタッキングゲル中のゲルコームを挿入します。
6. 以下の条件に応じてページを実行します。最初の実行条件：100ボルト、20分と最終条件：120ボルト、40分。
7. ゲルの色が均一に青になるまで30分間、室温でクマシーブリリアントブルーでゲルを染色します。
   注：ゲルはもはや色素溶液に表示されない場合に染色が完了しました。
8. 1時間室温で酢酸溶液（10％）として脱色。バンドが表示されるようになります。背景が透明になるまで4℃で一晩脱色続けます。

2.ペプチド合成およびモノクローナル抗体産生

1. マグロ、鶏、ダチョウ、家畜哺乳類、シールと18種を含むのGenBankからメガビットのアミノ酸配列を取得します鯨類（ 表2）。
2. 適切なソフトウェア^16を使用して配列を整列させます：
   1. 整列を選択することにより、アライメントExplorerを起動します 。 編集/起動バー上のアライメントを構築します 。 新しいアラインメントを作成 ] を選択し、[OK]をクリックします。ダイアログが尋ねる表示されます。「あなたは、DNAやタンパク質配列アラインメントを構築していますか？」
   2. 「 タンパク質 」というボタンをクリックします。 オープン：データを選択し、ファイルを選択し、シーケンスファイルからの配列を取得します 。 [編集]を選択します 。複数の配列アラインメントを作成するためのデータセット内のすべてのシーケンスのすべてのサイトを選択するために、 すべてのメニューコマンドを選択します 。
   3. 選択配向：のClustalWアルゴリズムを用いて選択された配列データを整列するために、メインメニューからのClustalWによって揃え 。ウェイトマトリックスプロテインとして「BLOSUM」を選択し、[OK]ボタンをクリックします。
3. 配列アラインメントを分析します。
   1. 5抗原反応性のsiに焦点を当てますTES ^17：サイト1（AKVEADVA、15-22）、サイト2（KASEDLK、56-62）、サイト3（ATKHKI、94-99）、サイト4（HVLHSRH、113-119）、サイト5（KYKELGY、145- 151）と鯨類間で保存断片を見つけます。 *（アスタリスク;アライメント（プロトコル2.2.3）でのコンセンサス記号）は、単一の、完全に保存された残基を持っている位置を示しています。鯨類の以下の保存された断片が発見された：（サイト2を含みます）シーケンスKASEDLKKHGとシーケンスHVLHSRHP（サイト4を含みます）。
4. 配列分析によると候補配列の断片を合成し、商業サービスを使用して、担体タンパク質として卵白アルブミンタンパク質（OVA）とコンジュゲート。
   1. 分解（ 例えば 、M-KASEDLKKHG）からペプチドを防止するための抗原反応性部位のN末端 ​​に疎水性アミノ酸（ 例えば 、メチオニン）を加えます。
   2. 免疫細胞にコア抗原部位を露出させるための抗原反応性部位のC末端側を長く。また、conjuゲートC末端にシステイン（Cysを、C）を添加することにより、OVAを有するペプチド（ 例えば 、M-KASEDLKKHG-NTVL-C）。
5. 免疫原1またはPBS中の各合成ペプチドの等量の（3ミリリットル、最終濃度30〜50μgの/100μl）を持つ免疫原2のための不完全フロイントアジュバントのために完全フロイントアジュバントを乳化。
6. 皮下に5匹の雌BALB / cマウスの各々に、免疫原1（0.1 mg）を接種します。
7. 2週間間隔で免疫原2を使用して皮下のブースター注射を5回実行し、すべての追加免疫前のマウスから尾クリップサンプリングによって試験血清を収集します。
8. 最初のスクリーニングのための血清力価を決定します。
   1. 96ウェルプレートの各ウェルに、反応バッファ、アリコート25mlの溶液50μl中の遊離ペプチドの100μgのを溶かします。各ウェルに10μlのカップリング試薬溶液を加え、プレートを混ぜます。室温で2時間静置します。
   2. ウェルの内容を削除し、蒸留水で各ウェルを3回洗浄し、ブロッキング溶液を200μlを添加することによりプレートをブロックします。室温で1時間インキュベートします。コンテンツを削除し、蒸留水で各ウェルを3回洗浄します。
   3. 最初のスクリーニングのための血清力価を決定するための間接ELISA（プロトコル5.1から5.7）を実行します。脾臓収集のための最高力価（最高光学密度）を有するマウスを選択してください。
9. 3日前脾臓コレクションに、皮下最高力価を提示するマウスに免疫原1の0.1 mgの接種。
10. モノクローナル抗体の生成¹⁸のためのハイブリドーマ細胞を得るために、マウス骨髄腫細胞F0（SP2 / 0-AG14）との選択免疫したマウスとヒューズからの脾臓細胞を収集します。
11. 14日融合後、間接ELISA（プロトコル5.1から5.7）を用いて遊離合成ペプチドに向かってハイブリドーマ上清の反応性をスクリーニングすることにより陽性クローンを選択します。
12. maximizウェル毎に適切な数に細胞を希釈ただ1つのクローン（希釈クローニング）を含有するウェルの割合をる。
    1. 空のままにされたウェルA1を除いて、96ウェルプレート内のすべてのウェルに細胞培養培地100μlを加えます。
    2. よくA1に200μlの細胞懸濁液を追加します。その後すぐにB1にA1から100μlのを転送し、穏やかにピペッティングして混ぜます。列全体ダウン2希釈液、およびそれはそれ以上の井戸と同じボリュームで終わるように、H1から100μLを捨てる：これらの1を繰り返します。
    3. 8チャンネルのマイクロピペットを用いてカラム1に培地の追加の100μlのを追加します。その後すぐに同じピペットを用いてカラム2のものに列1の各ウェルから100μlのを転送し、穏やかにピペッティングして混ぜます。
    4. プレート全体を横切る2希釈液：同じチップを使用して、これらの1を繰り返します。最後の列に各ウェルから100μlを廃棄してください。
    5. 各ウェルに100μlの培地を添加することによって200μlにすべてのウェルの最終容量をもたらします。ナンプラーをインキュベートteの加湿CO ₂インキュベーター中、37℃で邪魔されず。
    6. 各ウェルをチェックして、ちょうど単一コロニーを含むすべてのウェルをマーク。単一クローンを含むウェルの> 90％が抗体産生について陽性であるまで、二つ以上のクローニングを行います。
13. ウェスタンブロット、ドットブロット（プロトコル3.1から4.6）によりクローンをスクリーニングします。次に、モノクローナル抗体を得るために細胞を拡大するために、より大きな容器にウェルからコロニーを継代培養。通常、各クローンは、12または24ウェルプレート中で単一のウェルに移します。
14. ウェスタンブロット、ドットブロット（プロトコル3.1から4.6）によってmAbおよび牛、ヤギ、ブタ、イヌ、ウサギ、マグロ、鶏肉、シール、および4つの代表鯨類から筋肉抽出物との親和性を測定します。
15. 腹水を誘導するためにマウスの腹腔内に（3×10 ⁶まで）選択されたハイブリドーマ細胞を接種します。腹部の腫れは7-10日以内に一般的に明らかであるハイブリドーマ注射後。皮下注射針を使用して流体を収集（未満20ゲージ）。
16. 遠心分離機腹水（10分間万XG）は、細胞および破片を除去します。 0.45μmのフィルターを通して濾過。プロテインGセファロースカラムへのサンプルの1〜20ミリリットル、結合緩衝液15ミリリットル、および溶出バッファーの3〜5ミリリットルを追加します。マウス腹水から精製された抗体を含む溶出画分を収集します。
17. 製造元の指示を用いて抗体アイソタイピングキットによって抗体のアイソタイプを決定します。

3.ウエスタンブロット

1. BME50μlの2×Laemmliサンプルバッファーの950μLを混合することにより、βメルカプトエタノール（BME）を含む2×ローディングバッファーを準備します。良好な信号を得るための適切な比率でローディングバッファーで筋肉上清（プロトコル1.1から1.4）を希釈：1：50（鯨類とシール）と1：5（家畜やマグロ）ポリクローナルウサギ抗ヒトMbの抗体を使用した場合、および1：1（ブタ、ウサギ、ニワトリやマグロ）、1：5（牛、ヤギ、犬）、および1時25分（鯨類とシール）時ntibodyは、ハイブリドーマ上清からです。
2. 5分間95℃で加熱試料。分子量マーカーと一緒にSDS-PAGEゲル（4％アクリルアミドスタッキングおよび12％アクリルアミド分離）のウェルにロードしたサンプル。約1時間に実行を完了するために150 Vに電圧を増加させる、その後50 Vで5分間ゲルを実行します。
3. 15分間、1×転写バッファーでゲルを置きます。彼らはPAGEによって分離された後、ニトロセルロース（NC）膜に分離されたタンパク質を転送します。転送は、60〜90分間、100Vで行うことができます。
4. ブロッキング溶液を準備します：1×PBS、5％脱脂粉乳、0.1％Tween 20を含みます。室温で1時間ブロッキング溶液25mlにNC膜をブロックします。トゥイーン20（PBST）で15ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で5分間ずつ3回洗浄します。
5. 抗体希釈緩衝液を4℃で一晩5％ブロッキング溶液で希釈して10ml中膜と一次抗体（腹水またはハイブリドーマ上清）をインキュベートします。
6. membranを洗います過剰な抗体をきれいにするPBSTで再び電子三回。
7. 1でアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgGで膜をインキュベートする：ブロッカー溶液中1,250室温で1時間穏やかに撹拌しながら。
8. 再度、膜を洗浄し、発色する​​まで10〜20分間、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ P-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（BCIP / NBT）ホスファターゼ基質混合物中でインキュベートします。
9. 蒸留水のいくつかの変更で膜を洗浄することにより反応を停止します。

4.ドットブロット

1. 家畜およびマグロ5、及び鯨類及びシールのための1時25分：1：良好な信号を得るために適切な比率でPBST中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）で筋肉上清（プロトコル1.1〜1.4）で希釈します。スポット膜上のサンプル5μlの。溶液をゆっくりそれを適用することで（通常は3〜4ミリメートルの直径）を貫通すること面積を最小限に抑えます。
2. 室温（ 例えば、<で膜を乾燥させ30~60分間の層流中/ EM>）、室温で1時間、ペトリ皿中のブロッキング溶液でそれをブロックし、PBSTでそれを洗浄します。
3. （1：10,000または腹水：1でハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の5％ブロッキング溶液中に希釈10万）一次抗体で膜をインキュベートし、室温で1時間。
4. 使用PBST過剰な抗体を除去し、次いで二次抗体と一緒にインキュベートし、膜を5分間、3回ずつ洗浄する（1におけるアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG：5％のブロッキング溶液中で1,250）を室温で1時間。
5. 再び膜を洗浄し、発色する​​まで10〜20分以内にBCIP / NBTホスファターゼ基質混合物でそれをインキュベートします。
6. 蒸留水のいくつかの変更で膜を洗浄することにより反応を停止します。

5.間接ELISA

1. 洗浄バッファー（0.02％Tween 20で0.002 Mイミダゾール緩衝生理食塩水）を準備します。洗濯でプレートを3回洗浄各次のステップ（プロトコル5.2から5.5）の間にバッファ。
2. コー​​ティング緩衝液中の筋肉上清（プロトコル1.1から1.4）の午前1時25希釈を準備します。一晩4℃で上清を希釈し、室温で1時間、緩衝液（PBS中1％BSA）でブロッキングを阻止する100μlのコート96ウェルELISAプレート。
3. 希釈した緩衝液を用いて精製されたmAbの2000希釈し、各ウェルに希釈されたmAbの100μlを添加する：1を準備します。室温で1時間静置します。
4. さらなるインキュベーションのため：（希釈緩衝液中に200倍希釈）、ヤギ抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート追加します。
5. 各ウェルにペルオキシダーゼ基質を加える（100μl/ウェル）、10〜15分間インキュベートします。
6. 発色が観察されたときに（100μl/ウェル）ペルオキシダーゼ停止溶液により、酵素反応を停止させます。
7. マイクロプレート分光光度計を用いて450nmでの光学密度を読みます。

金コロイド標識mAbの6準備

注：金コロイド溶液と混合物の色は常に赤でなければなりません。黒色の沈殿物が注目されているときのpH、mAbの濃度、遠心分離速度を調整します。 6.1と6.2は、最適化のステップであるステップ。

1. 5-9からの様々なpH値を有する金コロイド溶液100μlにモノクローナル抗体（50μg/ mlの、3μl）を検出、精製を追加します。 2時間赤色を維持最小pHは至適pHとみなされます。注：この研究では、0.1 Mの炭酸カリウムをpH 8.0（至適pH）にコロイド金（40 nm）の溶液を調整するために使用しました。
2. pH8.0で金コロイド溶液100μlにモノクローナル抗体を検出精製の様々な量（500 / mlの、1から20μl）を追加します。注意：本研究における最適濃度は、6 / mlの（なし黒色の沈殿物）です。
3. 以上の結果によれば、精製された検出のmAb滴下コロイド金溶液を10mlの60μgのを加えます。 10分間、室温で穏やかに混合物を乳化します。広告D混合物にPBS中の5％BSA液（pH7.4）2mlのバックグラウンド干渉を減少させるために室温で15分間穏やかに乳化します。
4. 4℃で30分間万×gで混合物を遠心分離します。
5. 慎重に非結合抗体で上清を除去し、1％BSAおよび0.1％Tween 20を含む4ミリリットルPBSTで得られたペレットを懸濁し、遠心分離とサスペンションを数回繰り返します。
6. 1ミリリットルPBST中で、最終的な沈殿物を一時停止し、使用するまで4℃で保管してください。

免疫ストリップの7建設

注： 図1は、免疫ストリップ設計を示 ​​しています。 <（1年）、長期貯蔵寿命のために（20％相対湿度、低湿度の実験室環境条件でストリップを）>準備し、組み立てます。パッドと膜の寸法は、コンジュゲートパッド300ミリメートル×10ミリメートル、吸収パッド300ミリメートル×24ミリメートル、サンプルパッド300ミリメートル×24ミリメートル、NC膜のx 25ミリメートル300ミリメートル、300をペーストボードミリメートルは、80ミリメートルのxは。

1. コンジュゲートパッドを飽和させ、その後、組み立てる前に、37℃で1時間、それを乾燥させるためにマイクロピペットでステップ6.6から金コロイド標識MAb溶液を追加します。
2. ピペットまたはイムノプリンタを使用してNC膜上のmAbを検出するための制御ゾーンに特異的な抗原捕捉試験ゾーンでのmAb（500μgの/ ml）を、ウサギ抗マウスIgG（500μgの/ ml）を分配します。干渉を回避するために、2つのゾーン間の距離（> 5 mm）を維持します。
3. 両面テープでのペーストボード上の共役パッド、吸収パッドとNC膜を貼り付けます。
   注：約2mmによってNC膜の両側のパッドを重ねます。不適切なストリップ構造が不完全なテストになります。
4. コンジュゲートパッド（2ミリメートル）の上にサンプルパッドを配置し、ペーストボードに貼り付けます。
5. ペーパーカッター付き6ミリメートル幅のストリップを作成します。乾燥剤とアルミ箔袋にストリップをパックし、使用するまで4℃で保管してください。

8.交差反応性試験

1. 竹の棒を使用して、又はロッド研削1.5 mlの遠心チューブに1mlのPBS（0.1％BSAを含む）で生の筋肉試料0.03 gで均質化します。
2. テスト領域と反対側の端部によってストリップを持ち、5〜10分間、試験片にサンプルパッド部分を浸漬し、結果を直接観察します。
   1. オプション：500μlの上清を収集し、新しい遠心チューブに移します。
      注：ストリップが直接上清に浸漬されたときに信号が明らかでない場合は、このステップが示唆されました。
3. 三重で様々な筋肉のサンプルをテストします。
   注：ここでは、マグロ、鶏肉、シール、鯨類の15種と陸生哺乳類の5種をテストしました。
4. 5つの独立した検査官は、合計で575ストリップを使用し、 すなわち 、5回8.3を繰り返しています。

結果

モノクローナル抗体の特性

私たちは、鯨類のMBの、それぞれ2合成ペプチド（MKASEDLKKHGNTVLCとAIIHVLHSRHPAEFGC）を、認識2のIgG ₁モノクローナル抗体（CGF5H9とCSF1H13）を開発し、これらはクジラMbのを迅速に検出するためのサンドイッチ型金コロイドイムノクロマト法テストストリップを構築するために使用しました。 図2は CGF5H9はおおよそ17キロ...

ディスカッション

担体タンパク質にコンジュゲートした合成ペプチドを使用することにより、その同族タンパク質と比較して著しくより効果的です。 mAbは既知の相対位置を有するエピトープを使用して開発されているので、サンドイッチに基づく技術については、本研究では2 mAbは、標的抗原エピトープとの互いの相互作用を妨害する可能性はありません。また、天然のタンパク質との反応性及び合成ペプチ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE Healthcare	28-9031-34	spin column containing Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit	Roche	11493027001	Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulose membrane	Whatman	Z613630
Antibody blocker solution	LTK BioLaboratories		To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples
BCIP/NBT phosphatase substrate	KPL	50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate	Thermo Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA reader	Thermo Electron Corporation	51118170
Colloid gold (40 nm) solution	REGA biotechnology Inc.		40-50 nm is appropriate for immunostrip
Bovine serum albumin	Gibco	15561-020
Rapid test immno-strip printer	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes
Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens
Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)	Protech		Gel preparation for SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250	Bio-Rad	1610436	Protein staining in SDS-PAGE gels
Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels