Desenvolvimento de uma tira de teste imunocromatográfico baseada em ouro coloidal para a detecção de Cetáceos Myoglobin

Resumo

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Resumo

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG₁). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

Introdução

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today¹. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat². Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population³. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage⁴. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.

Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat⁵ and decomposed samples⁶ but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs^7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork⁹, beef¹⁰ and catfish¹¹. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available¹², and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States¹. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats.

Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses¹³, but it is rarely used for identifying proteins in meat^14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

Protocolo

Declaração de Ética: O estudo foi realizado de acordo com as directrizes internacionais e aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Chiayi, aprovação ID: 99022. O uso da amostra de cetáceos foi permitido pelo Conselho da Agricultura de Taiwan (Research Permissão 100M-02.1-C-99).

1. Preparação de amostras do músculo e de SDS-PAGE

Nota: As amostras de músculo de 23 espécies, incluindo 16 espécies de mamíferos marinhos, 5 espécies de mamíferos terrestres, atum e frango foram utilizados neste estudo (Tabela 1). As amostras de músculo de cetáceos foram obtidas de indivíduos presos, as capturas acessórias da pesca e confisco. Coelho, rato, cão, e tecidos musculares de frango foram obtidos a partir do Centro de Diagnóstico de Doenças dos Animais da Universidade Nacional de Chiayi. As amostras de carne de vaca, porco, cordeiro e atum foram comprados de um supermercado local. A amostra do músculo do selo de porto (Phoca vitulina ) foi fornecido por Farglory Ocean Park. electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi utilizada para separar proteínas solúveis com diferentes pesos moleculares em amostras do músculo.

1. Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à sua utilização.
2. Pré-cool argamassa a -20 ° C. Em seguida, coloque 3 g de amostra muscular congelado nele.
3. Homogeneizar a amostra com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS), utilizando um homogeneizador de tecidos.
4. Centrifugar a amostra homogeneizada a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recolhe-se os sobrenadantes e armazená-lo a -20 ° C até à sua utilização.
5. Prepare 5 ml de 5% de gel de empilhamento (3,07 ml de água destilada, 1,25 ml de gel tampão superior 4x de pH 6,8, 625 ul de 40% de acrilamida, 50 ul de 10% de persulfato de amónio (APS), e 5 ul de tetrametiletilenodiamina ( TEMED)) e 10 ml de 15% de gel de separação (3,65 ml de água destilada, 2,5 ml de tampão de gel de 4x mais baixo de pH 8,8, 3,75 ml de 40% de acrilamida, a 100 ul de APS a 10%,e 4 ul de TEMED).
   1. Na célula de electroforese, derramar empilhamento gel (5% de acrilamida) no topo do gel de separação (acrilamida a 15%) depois de este ter solidificado. Insira um pente de gel no gel de empilhamento.
6. Execute página de acordo com as seguintes condições: condição inicial de execução: 100 volts, 20 min e condição final: 120 volts, 40 min.
7. Corar o gel com azul brilhante de Coomassie à temperatura ambiente durante 30 min, até que o gel é uniformemente azul em cor.
   Nota: A coloração é completa quando o gel não é mais visível na solução corante.
8. Destain-o com solução de ácido acético (10%) à temperatura ambiente durante 1 h. Bandas vão começar a aparecer. Continuar descoloração a 4 ° C durante a noite até que o fundo é clara.

2. Peptide Synthesis e Produção de Anticorpo Monoclonal

1. Recuperar as sequências de aminoácidos de MB a partir do GenBank incluindo atum, frango, avestruz, mamíferos domésticos, vedação e 18 espéciesde cetáceos (Tabela 2).
2. Alinhar as sequências utilizando software adequado ^16:
   1. Inicie o Alignment Explorer selecionando Alinhar: Editar / Criar Alinhamento na barra de inicialização; selecione Criar Nova Alinhamento e clique em OK. Uma caixa de diálogo aparecerá perguntando "Você está construindo um alinhamento de sequências de DNA ou proteína?"
   2. Clique no botão "Protein"; selecione Dados: Open: recuperar seqüências de arquivo e selecione o arquivo de sequência; selecione Editar: Selecionar tudo comando de menu para selecionar todos os sites para cada sequência no conjunto de dados para a criação de um alinhamento múltiplo de sequências.
   3. Seleccione Alinhamento: Alinhar por ClustalW a partir do menu principal para alinhar os dados sequências selecionadas usando o algoritmo ClustalW; selecione "BLOSUM" como a proteína da matriz de peso, em seguida, clique no botão OK.
3. Analisar o alinhamento da sequência:
   1. Concentre-se em 5 de si reativa antigênicates ^17: Local 1 (AKVEADVA, 15-22), local 2 (KASEDLK, 56-62), local 3 (ATKHKI, 94-99), local 4 (HVLHSRH, 113-119) e sítio 5 (KYKELGY, 145- 151) e encontrar o fragmento conservado entre os cetáceos. Uma * (asterisco; símbolo consenso no alinhamento (protocolo 2.2.3)) indica as posições que têm um único resíduo, totalmente conservada. Os seguintes fragmentos conservados em cetáceos foram encontrados: sequência KASEDLKKHG (que inclui local 2) e sequência HVLHSRHP (que inclui local 4).
4. Sintetizar fragmentos de sequência candidata de acordo com a análise de sequência, e conjugado com uma proteína de ovalbumina (OVA) como proteína veículo usando serviços comerciais.
   1. Adicionar aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, metionina) ao N-terminal do local reactivo antigénico para prevenir o péptido a partir da decomposição (por exemplo, M-KASEDLKKHG).
   2. Alongar a C-terminal do local reactivo antigénico para expor o local antigénico do núcleo para o imunócito. Além disso, conjuporta o péptido com OVA através da adição de uma cisteína (Cys, C) para o C-terminal (por exemplo, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. Emulsionar o adjuvante completo de Freund para um imunogénio ou adjuvante incompleto de Freund para o imunogénio 2 com um volume igual de cada péptido sintético em PBS (3 mL, concentração final de 30-50 ug / 100 uL).
6. Inocular imunogénio 1 (0,1 mg) subcutaneamente em cada um de cinco fêmeas BALB / c.
7. Execute injecções de reforço subcutâneos cinco vezes usando imunógeno 2 em intervalos de duas semanas e recolher soros de teste por amostragem cauda clipe dos camundongos antes de cada reforço.
8. Determinar título soros pela primeira triagem.
   1. Dissolve-se 100 ug de péptido livre em 25 ml de tampão de reacção e alíquota de 50 ul da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicionar solução de reagente de acoplamento de 10 ul a cada poço e a placa misturar. Incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente.
   2. Remover os conteúdos do poço,lavar cada poço 3 vezes com água destilada, e bloquear a placa adicionando 200 ul de solução de bloqueio. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Remover o conteúdo e lavar cada cavidade 3 vezes com água destilada.
   3. Execute ELISA indireto (Protocolo 5,1-5,7) para determinar soros título pela primeira triagem. Escolha o mouse com o título mais elevado (maior densidade óptica) para a coleta de baço.
9. Três dias antes da colheita do baço, inocular 0,1 mg de imunógeno 1 por via subcutânea no rato apresentando o maior título.
10. Recolher as células do baço dos ratinhos imunizados seleccionados e fundir com células de mieloma de murino F0 (SP2 / 0-Ag14) para se obter células de hibridoma para produção de mAb ^18.
11. 14 dias após a fusão, selecione os clones positivos por rastreio a reactividade dos sobrenadantes de hibridoma em direção péptido sintético livre usando ELISA indireto (Protocolo de 5,1-5,7).
12. Dilui-se as células para um número apropriado por poço para maximizing a proporção de poços que contêm apenas um clone único (diluição clonagem).
    1. Adicionar 100 ul de meio de cultura celular para todos os poços da placa de 96 poços excepto A1 bem que é deixado vazio.
    2. Adicionar 200 ul da suspensão de células para o poço A1. Em seguida, transferir rapidamente 100 mL de A1 a B1 e misture com cuidado pipetando. Repita essas 1: 2 diluições para baixo toda a coluna, e depois descartá 100 ul de H1 de modo que termina com o mesmo volume que os poços acima dela.
    3. Adicionar mais 100 ul de meio para a coluna 1 com uma micropipeta de 8 canais. Em seguida, transferir rapidamente 100 pi de cada um dos poços na coluna 1 para aqueles na coluna 2, utilizando a mesma pipeta, e misturar por pipetagem suave.
    4. Utilizando as mesmas pontas, repetir estes 1: 2 diluições em toda a placa. Rejeitar 100 ul de cada um dos poços na última coluna.
    5. Levar o volume final de todas as cavidades a 200 ul pela adição de 100 ul de meio para cada poço. incubar plate não perturbadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO ₂ incubadora.
    6. Verifique cada poço e marcar todos os poços que contêm apenas uma única colônia. Efectuam-se duas ou mais clonagens até> 90% dos poços contendo clones individuais são positivas para a produção de anticorpos.
13. Peneirar os clones por western blot e dot blot (protocolo 3,1-4,6). Então colônias subcultura dos poços em navios de maior porte para expandir as células para a obtenção de mAb. Normalmente, cada clone é transferida para um único poço de uma placa de 12 ou 24 poços.
14. Medir a afinidade entre os mAbs e os extratos de músculo de vaca, cabra, porco, cão, coelho, atum, frango, selo, e quatro espécies de cetáceos representativos por western blot e dot blot (protocolo 3,1-4,6).
15. Inocular células de hibridoma seleccionadas (até 3 x 10 ⁶⁾ intraperitoneal em ratinhos para induzir ascite. inchaço abdominal é tipicamente evidente dentro de 7-10 dias após a injecção de hibridoma. Recolha de fluido utilizando uma agulha hipodérmica(Menos do que um calibre 20).
16. fluido de ascites de centrifugação (10.000 xg durante 10 min) para remover as células e detritos. Filtrar através de um filtro de 0,45 um. Adicionar 1 a 20 ml da amostra, 15 ml de tampão de ligação, e de 3 a 5 ml de tampão de eluição à coluna de proteína G-Sepharose. Recolher a fracção de eluição contendo o anticorpo purificado a partir do fluido de ascites ratos.
17. Determinar o isotipo de anticorpos pelo kit de isotipagem de anticorpos utilizando as instruções do fabricante.

3. Western Blot

1. Preparar tampão de carga 2x contendo β-mercaptoetanol (BME) por mistura de 950 ul de tampão de amostra Laemmli 2x com 50 ul de BME. Diluir o sobrenadante musculares (protocolo 1,1-1,4) em tampão de carregamento com proporção adequada para a obtenção de bons sinais: 1:50 (cetáceos e focas) e 1: 5 (animais domésticos e atum) quando se utiliza anticorpo Mb policlonal de coelho anti-humano e 1: 1 (porco, coelho, frango e atum), 1: 5 (vaca, cabra e cão) e 1:25 (cetáceos e selo) quando umntibody é a partir do sobrenadante de hibridoma.
2. amostra de calor a 95 ° C durante 5 min. Carregar as amostras nas cavidades do gel de SDS-PAGE (acrilamida a 4% de empilhamento e 12% de separação de acrilamida), juntamente com marcadores de peso molecular. Submeter o gel durante 5 min a 50 V, então, aumentar a tensão para 150 V para terminar o prazo em cerca de 1 h.
3. Colocar o gel em tampão de transferência 1x durante 15 min. Transferir a proteína separadas para nitrocelulose (NC) membranas depois de serem separados por PAGE. A transferência pode ser realizada a 100 V durante 60-90 min.
4. Preparar solução de bloqueio: 1x PBS contendo 0,1% de Tween 20 com 5% de leite em pó magro. Bloquear a membrana de NC em 25 ml de solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. Lavar três vezes durante 5 min cada com 15 ml de solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 (PBST).
5. Incubar a membrana e o anticorpo primário (fluido de ascites ou sobrenadante de hibridoma) em 10 ml de tampão de diluição do anticorpo diluído com solução de bloqueio 5% a 4 ° C durante a noite.
6. Lava-se a Membrane três vezes novamente com PBST para limpar anticorpo excessiva.
7. Incubar a membrana com IgG conjugado com fosfatase alcalina de cabra anti-rato a 1: 1250 em solução de bloqueador com agitação suave durante 1 hora à temperatura ambiente.
8. Lava-se a membrana de novo e incubar-lo no cloreto de fosfato de / p-nitroazul de tetrazólio 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP / NBT) mistura de substrato de fosfatase de 10 a 20 min, até o desenvolvimento da cor.
9. Parar a reacção por lavagem da membrana em várias mudas de água destilada.

4. Dot Blot

1. Diluir o sobrenadante musculares (protocolo 1,1-1,4) em albumina de soro bovino a 5% (BSA) em PBST com proporção adequada para a obtenção de bons sinais: 1: 5 para animais domésticos e atum, e 01:25 para os cetáceos e focas. Ponto 5 ul de amostras para uma membrana. Minimizar a área que a solução penetra (normalmente 3-4 mm de diâmetro), aplicando-o lentamente.
2. Seca-se a membrana à temperatura ambiente (por exemplo, </ Em> em fluxo laminar durante 30-60 min), bloqueá-lo com a solução em uma placa de Petri de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente, e lavá-lo com PBST.
3. Incubar a membrana com anticorpo primário (mAb a partir do sobrenadante de hibridoma em 1: 10.000 ou fluido de ascites a 1: 100000 diluído em solução de bloqueio 5%) durante 1 h à temperatura ambiente.
4. Uso PBST para se lavar a membrana três vezes durante 5 minutos cada para remover o excesso de anticorpo, e depois incubar com o anticorpo secundário (anti-IgG de rato alcalina de cabra conjugado com fosfatase a 1: 1250 em 5% de solução de bloqueio) durante 1 hora à temperatura ambiente .
5. Lava-se a membrana de novo e incubar-lo na mistura de substrato da fosfatase BCIP / NBT dentro de 10 a 20 min, até o desenvolvimento da cor.
6. Parar a reacção por lavagem da membrana em várias mudas de água destilada.

5. ELISA indireta

1. Preparar o tampão de lavagem (0,002 M imidazol solução salina tamponada com 0,02% de Tween 20). Lavar a placa 3 vezes com lavagenstampão entre cada passo seguinte (protocolo 5,2-5,5).
2. Prepare diluição 1:25 de sobrenadantes musculares (protocolo de 1,1-1,4) em tampão de revestimento. Bata de uma placa de 96 poços de ELISA com 100 ul sobrenadantes diluídos a 4 ° C durante a noite e bloqueá-lo com tampão (1% de BSA em PBS) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente.
3. Prepare uma diluição do Acm purificada com tampão diluído 2000 e adicionar 100 uL de mAb diluído a cada poço. Incubar a placa durante 1 hora à temperatura ambiente.
4. Adicionar IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1: 200 em tampão de diluição diluída) para posterior incubação.
5. Adicionar substrato de peroxidase a cada poço (100 ul / cavidade) e incuba-se durante 10-15 min.
6. Parar a reacção enzimática pela solução de peroxidase de paragem (100 ul / poço), quando o desenvolvimento da cor é observada.
7. Leia a densidade óptica a 450 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas.

6. Preparação de mAb marcado com ouro coloidal

Nota: A solução cor de ouro coloidal e a mistura deve ser sempre vermelho. Ajustar o pH, a concentração de mAb, a velocidade de centrifugação quando precipitado preto é notado. Passos 6.1 e 6.2 são passos de otimização.

1. Adicionar purificada detectar mAb (50 ug / ml, 3 ul) a 100 ul de solução de ouro coloidal, com valores de pH variando entre 5-9. O pH mínima que mantém a cor vermelha durante duas horas é considerado como o valor óptimo do pH. Nota: Neste estudo, carbonato de potássio 0,1 M foi utilizada para ajustar o ouro coloidal (40 nm) de solução a pH 8,0 (pH óptimo).
2. Adicionar várias quantidades de detectar purificados mAb (a 500 ng / ml, 1-20 ul) com 100 ul de uma solução de ouro coloidal a um pH de 8,0. Nota: A concentração óptima neste estudo é de 6 ug / ml (nenhum precipitado negro).
3. De acordo com os resultados acima, adicionar 60? G de mAb purificado detectar gota a gota a 10 ml de uma solução de ouro coloidal. Emulsionar-se a mistura suavemente à temperatura ambiente durante 10 min. de Anúnciosd 2 ml de solução a 5% de BSA em PBS (pH 7,4) à mistura e emulsionar suavemente à temperatura ambiente durante 15 min para reduzir a interferência de fundo.
4. Centrifugar a mistura a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
5. Remover o sobrenadante com o anticorpo não conjugado e cuidadosamente suspender as pelotas resultantes em 4 ml de PBST contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20, e repetir centrifugação e suspensão várias vezes.
6. Suspender os precipitados finais em 1 ml de PBST e armazená-lo a 4 ° C até ser utilizado.

7. Construção de Immune Faixa

Nota: A Figura 1 mostra o desenho tira imune. Preparar e montar as tiras em uma condição ambiental laboratório de baixa umidade (<20% de umidade relativa) para a vida de armazenamento prolongado (> 1 ano). As dimensões de almofadas de membrana e são: conjugado de almofada 300 mm x 10 mm, almofada absorvente 300 mm x 24 mm, amostra almofada 300 mm x 24 mm, NC membrana 300 mm x 25 mm, 300 pasteboardmm x 80 mm.

1. Adicionar solução de mAb marcado com ouro coloidal a partir do passo 6.6 com uma micropipeta para saturar a almofada de conjugado e, em seguida, secar a 37 ° C durante 1 h antes da montagem.
2. Distribuir o mAb (500 ug / ml) sobre a zona de teste de captura de antigénio, e de coelho anti-IgG de ratinho específico (500 ug / ml) na zona de controlo para detectar o mAb sobre a membrana de NC utilizando uma impressora pipeta ou imunotira. Manter uma distância (> 5 mm) entre as duas zonas a fim de evitar a interferência.
3. Cole o pad conjugado, almofada absorvente e da membrana NC na área de trabalho com fita dupla face.
   Nota: Sobreposição as almofadas de cada lado da membrana de NC por cerca de 2 mm. construção tira inapropriado resultará em um teste incompleto.
4. Coloque a almofada da amostra sobre a almofada de conjugado (2 mm) e colá-lo na área de trabalho.
5. Criar 6 mm de tiras largas com um cortador de papel. Embalar as tiras no saco de folha de alumínio com exsicante, e armazená-las a 4 ° C até ser utilizado.

Teste 8. A reactividade cruzada

1. Homogeneizar 0,03 g de amostra de músculo em bruto com 1 mL de PBS (contendo 0,1% de BSA) num tubo de centrífuga de 1,5 ml, utilizando uma vara de bambu ou de moagem haste.
2. Segure a tira pela extremidade oposta às áreas de teste e mergulhe a parte da amostra pad para a amostra de 5-10 min e observar o resultado diretamente.
   1. Opcional: Colete 500 mL sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrífuga.
      Nota: Este passo é sugerido se o sinal não é evidente quando a tira está directamente embebido para o sobrenadante.
3. Testar várias amostras de músculo em triplicado.
   Nota: Aqui nós testamos atum, frango, selo, 15 espécies de cetáceos e 5 espécies de mamíferos terrestres.
4. Tem cinco inspetores independentes repetir 8,3 por cinco vezes, ou seja, usar 575 faixas no total.

Resultados

Características de anticorpos monoclonais

Nós desenvolvemos dois IgG ₁ mAbs (CGF5H9 e CSF1H13) reconhecendo dois peptídeos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC e AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, do Mb de cetáceos, e estes foram utilizados para construir uma tira de teste imunocromatográfico do tipo sanduíche ouro coloidal para a rápida detecção de Mb de cetáceos. a Figura 2 mostra que detecta CGF5H9 cetáceos e outros mamíferos como uma ún...

Discussão

Usando um péptido sintético conjugado com a proteína transportadora é notavelmente mais eficaz em comparação com a sua proteína cognata. Para uma técnica baseada em sanduíche, porque o mAb é desenvolvida usando epitopos com posições relativas conhecidas, os dois mAb neste estudo não são susceptíveis de interferir com a interacção do outro com o epítopo de antigénio alvo. Além disso, a reactividade entre a proteína nativa e o anticorpo de murganhos imunizados com o péptido sintético conjugado pode ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE Healthcare	28-9031-34	spin column containing Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit	Roche	11493027001	Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulose membrane	Whatman	Z613630
Antibody blocker solution	LTK BioLaboratories		To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples
BCIP/NBT phosphatase substrate	KPL	50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate	Thermo Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA reader	Thermo Electron Corporation	51118170
Colloid gold (40 nm) solution	REGA biotechnology Inc.		40-50 nm is appropriate for immunostrip
Bovine serum albumin	Gibco	15561-020
Rapid test immno-strip printer	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes
Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens
Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)	Protech		Gel preparation for SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250	Bio-Rad	1610436	Protein staining in SDS-PAGE gels
Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels