Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación

Resumen

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

Resumen

partículas similares a virus (VLP) y partículas subvirales (SVPs) son un enfoque alternativo para el diseño de vacunas viral que ofrece las ventajas de una mayor seguridad de la biotecnología y la estabilidad en el uso de patógenos vivos. No infecciosas y auto-ensamblaje, las VLP se utilizan para presentar proteínas estructurales como inmunógenos, evitando la necesidad de patógenos vivos o vectores virales recombinantes para la administración de antígenos. En este artículo, nos demuestran las distintas fases de diseño y desarrollo de VLP para futuras aplicaciones en las pruebas con animales preclínicos. El procedimiento incluye las siguientes etapas: selección de antígeno, la expresión de antígeno en la línea celular de elección, la purificación de VLP / SVPs, y cuantificación para la dosificación de antígeno. Demostramos uso de ambas líneas celulares de mamíferos e insectos para la expresión de nuestros antígenos y demostrar cómo las metodologías difieren en el rendimiento. La metodología presentada se puede aplicar a una variedad de patógenos y se puede lograr mediante la sustitución de los antígenos con str inmunogénicauctural proteínas de microorganismos de interés del usuario. VLP y SVP ayudan con la caracterización de antígenos y la selección de los mejores candidatos a vacuna.

Introducción

partículas similares a virus (VLP) son una tecnología aprobada para la vacunación humana. De hecho, algunas de las vacunas más contemporáneamente con licencia, incluyendo el virus del papiloma humano (VPH) y la hepatitis Β (HepΒ) vacunas emplean este enfoque. VLP se forman a partir de proteínas estructurales capaces de auto-ensamblaje. Las partículas ensambladas imitan morfologías virales, pero no pueden infectar o replicarse porque carecen de los genomas virales. VLPs pueden ser expresados ​​y purificados a partir de una serie de sistemas procariotas y eucariotas. Una revisión de la literatura reveló que los diferentes sistemas de expresión se emplean en los porcentajes siguientes: - 28% de bacterias, levaduras - 20%, planta - 9%, insectos - 28%, y de mamíferos - 15% ^1. De nota, vacunas contra el VPH a base de proteína de la cápside L1 se producen en levadura (Gardasil) o en un sistema de células de insecto (Cervarix) ^2. Vacunas HepΒ, Recombivax y Engerix-Β, también se producen en la levadura, y se componen de HepΒ antígeno de superficie de ³, 4.

Utilizamos sistemas de expresión de células de mamíferos y de insectos para producir VLPs que requieren co-expresión de múltiples proteínas estructurales para el montaje. Nuestro trabajo se centra en el diseño, producción, y las vacunas basadas en VLP de purificación contra los patógenos humanos: virus de la influenza, virus sincitial respiratorio (VSR), el virus del dengue (DENV), y el virus Chikungunya (CHIKV). Nuestros métodos son lo suficientemente flexibles para permitir la co-expresión de las múltiples proteínas estructurales de múltiples plásmidos de expresión, o un solo plásmido de expresión (Figura 1). Anteriormente, hemos producido y purificado H5N1 VLPs ensambla a partir de la co-expresión de plásmidos que codifican hemaglutinina de la gripe (HA), neuraminidasa (NA), y la matriz (M1) en las células 293T de riñón embrionario humano ^5,6. Los genes fueron optimizados codón para la expresión en células de mamífero y se clonaron en pTR600, un vector de expresión eucariota que contiene el promotor de citomegalovirus temprano inmediato promotor más INTRON A para iniciar transcRiption de insertos eucariotas y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino para la terminación de la transcripción ^7. Un enfoque similar utilizando los tres plásmido co-expresión de HA, NA (Figura 1A) y una proteína de matriz viral alternativa, el VIH Gag p55, se utilizó para la generación de subtipo gripe estacional humana H3N2 VLPs en este estudio y se ha demostrado para generar VLP de tamaño similar como partículas de influenza ^8. Aunque las vacunas de la gripe predominantemente provocar anticuerpos anti-HA, la adición de neuraminidasa de la gripe media la actividad de sialidasa para permitir VLP en ciernes a partir de células transfectadas ⁹ y también presentan objetivos inmunogénicos adicionales. Para producir RSV VLP, también seleccionamos el núcleo sin relación de Gag del VIH para diseñar vacunas prototípicas que presentan glicoproteínas de superficie exclusivamente RSV para demostrar aún más la flexibilidad de la formación de VLP utilizando Gag del VIH, como se ha descrito y caracterizado por microscopía electrónica de ^6,10 previamente. Otroshan demostrado previamente que las VLP de la presentación de glicoproteínas del RSV pueden ser ensamblados utilizando diversos componentes virales de virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) ^11, y la matriz de influenza ^12. secuencias glicoproteína de superficie de larga duración se utilizaron en este estudio para retener conformaciones nativas que pueden ser necesarios para la unión al receptor funcional y ensayo de reconocimiento de anticuerpos a través de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Nuestros ejemplos para el uso de sistemas de expresión de plásmidos individuales para generar partículas son DENV y CHIKV. En el caso de DENV, podemos producir partículas subvirales (SVPs) sin cápside en células 293T de un único plásmido que contiene un casete de expresión / E gen estructural prM ^13. El término SVP se utiliza para denotar la falta de una proteína de la cápside del núcleo o en el ensamblaje de las proteínas estructurales virales. CHIK VLPs también se puede producir utilizando un único plásmido que contiene un casete CHIKV gen estructural, la codificación de la cápsida y la envoltura proteínas, o en icélulas NSECT por infectar con un baculovirus recombinante que codifica el mismo casete del gen estructural optimizado para la expresión de células de insecto (Figura 1B - C).

El resultado final de la expresión enfoques analizados anteriormente es la liberación de VLPs en medio de cultivo celular que a continuación se puede purificar a través de ultracentrifugación a través de un cojín de glicerol 20%. En este informe, se presentan métodos para expresar y purificar estas VLP de sistemas de células de mamíferos e insectos.

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Protocolo

1. Sistema de expresión de mamífero para la Generación de la influenza H3N2 VLP

1. Subclón viral estructural glicoproteínas hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) p55 Gag en vectores de expresión eucariotas, tales como pTR600 anteriormente descrito. ⁷
2. Amplificar el ADN en Escherichia coli químicamente competente (por ejemplo, DH5a) y aislar el plásmido de transfección grado utilizando un kit de purificación de plásmido según las instrucciones del fabricante. Cantidad de ADN es dependiente sobre el rendimiento y las necesidades del usuario.
3. Mantener línea celular de mamífero, 293T, en medio de crecimiento que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 ° C con 5% de _CO2 en un incubador humidificado.
4. Se cultivan las células de tal manera que un matraz de cultivo tisular T-150 contiene 45-75 x 10 ⁶ células por matraz de tal manera que matraz obtiene adherencia de las células completa y 85-95% de confluencia celular por el día siguiente. Inspeccionar las células bajo el microscopio para Conflu deseadarencia.
   Nota: alta densidad celular se recomienda típicamente para producir la expresión de proteína óptima con citotoxicidad mínima cuando el uso de reactivos de transfección comerciales sin embargo un exceso de confluencia puede resultar en acumulación de desechos celulares subproductos y reducir la viabilidad celular.
5. En el día de la transfección, preparar liposomas y mezcla de ADN según las recomendaciones del fabricante y transfectar células de ADN con una composición de ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag con una cantidad de ADN total de 40 g por T-150 matraz. Las soluciones diluidas de ADN y liposomas en el medio de transfección libre de suero sin antibióticos de tal manera que cada matraz contiene un volumen total de 20-30 ml.
   Nota: Índice de construcciones de genes puede requerir la optimización de usuario. Aunque no se ha demostrado aquí, un procedimiento de transfección similar se ha realizado con el virus sincitial respiratorio (RSV) F y Gag del VIH en una relación 1: 1. Para DENV y CHIKV plásmidos de expresión única, con un total de 20 g de ADN por cada frasco T-150 se utilizan para una óptima correoXpression. ADN: transfección proporciones de reactivos están optimizados usuario. Uso recomendado medio de transfección basado en el método de transfección, es decir, las transfecciones de lípidos policatiónicos recomiendan reducción o ausencia de suero bovino fetal por lo tanto medios se puede suplementar con hormonas de crecimiento y oligoelementos para apoyar el crecimiento en ausencia de suero.
6. Volver a matraces de 37 ° C con 5% de _CO2. Para un volumen de 200 ml, utilice 9 T-150 frascos. Las células se mantienen en medio de cultivo de la transfección hasta el día de la cosecha VLP.
7. sobrenadante de cultivo de la cosecha de las células después de 72 a 96 horas después de la transfección en función de antígeno, o cuando la viabilidad celular se ha reducido a 70 a 80%, como se estimó por inspección microscópica. Transferir el sobrenadante a tubos de 50 ml cónicos y girar las células hacia abajo a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares.
   Nota: el reemplazo de 3 días con sobrenadante fresco precalentado, el medio de transfección libre de suero de células adherentes se yielda segundo lote de las VLP con un rendimiento similar o ligeramente reducida y debe ser optimizado por el usuario.
8. sobrenadante piscina y filtrar a través de una membrana de 0,22 micras de poro antes de la sedimentación mediante ultracentrifugación.
9. Prueba de la actividad de hemoaglutinación de las VLP HA-expresan por ensayo de hemaglutinación estándar ¹⁴ utilizando 0,8% de pavo o de glóbulos rojos de mamíferos o proceder con ELISA específico de antígeno. Vea la Figura 2 para resultados representativos.

2. CHIK VLP expresión usando sistema de baculovirus / células de insecto

1. Generar baculovirus recombinantes que expresan la cápside del virus Chikungunya y proteínas de la envoltura (C-E3-E2-6K-E1) a partir de la cepa S-27 usando un sistema de expresión de baculovirus comercial.
2. Células Sf9 Cultura Spodoptera frugiperda Sf9 en medio de crecimiento libre de suero con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina a 28 ° C. Utilice 3-5 x 10 ⁵ c / ml para iniciar cultivos en matraces spinner para suspensel crecimiento de células de iones. Pasaje de forma rutinaria cuando se alcanzan densidades de células de 2-4 x 10 ⁶ c / ml (cada 3-4 días).
3. células de cultivo Sf9 en suspensión en matraces de agitación con agitación a 130 rpm en un sistema de placa agitador multipunto. Para la correcta aireación, mantener volúmenes de cultivo en no más de la mitad del volumen del matraz de agitación.
4. Para la expresión de CHIK VLPs, infectar células Sf9 a una densidad de 2 x 10 ⁶ células / ml con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 1 y volver a 28 ° C incubadora. Por lo general, infectar a una o dos matraces de agitación, que contienen 250 ml de células Sf9.
   Nota: Mientras que no usamos este método, las células Sf9 pueden cultivarse en matraces de agitación a 28 ° C utilizando una plataforma de agitación.
5. cultivos de cosecha después de 72-96 horas después de la infección, o cuando la viabilidad celular se ha reducido a un 70-80%, determinada por exclusión de azul de tripano según el protocolo del fabricante.
   Nota: Las células continúan proliferando mientras infectado y no hayLa viabilidad de ~ 80% en cultivos de SF9 infectadas con baculovirus recombinantes CHIK VLP a los 3 días post-infección (dpi). Las células infectadas con baculovirus son más grandes en apariencia. Morfología también puede cambiar de redonda a oblonga. A finales de etapas de infecciones de baculovirus, las células comenzaron a lisar.
6. culturas de transferencia directamente del cultivo en suspensión en 50 ml tubos cónicos y spin las celdas hacia abajo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
7. Recoger los sobrenadantes y se filtra a través de una membrana de 0,22 micras de poro antes de la sedimentación mediante ultracentrifugación.

3. Sedimentación / Purificación de VLP / SVPs

1. Esterilizar con techo abierto tubos de ultracentrífuga de 25 mm x 89 mm con etanol al 70% en la campana de bioseguridad. Asegúrese de que el etanol se haya secado antes de su uso.
2. Cargar un máximo de 32 ml de sobrenadante en un tubo limpio. Se recomienda un volumen mínimo de 25 ml para evitar el colapso y el daño de los tubos de ultracentrífuga llenos inadecuadamente.
3. Con cuidado subyacer sobrenadantes ingenioh estéril de glicerol 3 ml 20% en PBS (v / v). Asegúrese de que los tubos están equilibrados.
4. Giran a 135.000 xg durante 4 horas a 4 ° C.
5. Aspirar el sobrenadante, lo que garantiza la pastilla no se desplace desde el tubo.
6. Volver a suspender las VLP sedimenta en la parte inferior de los tubos con PBS estéril pipeteando enérgicamente arriba y hacia abajo. La cantidad de PBS necesario para volver a suspender las VLP depende de la producción de proteína total de VLP y aplicaciones posteriores. Típicamente, resuspender cada pellet VLP en por lo menos 100 l.
7. Almacenar las muestras 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo y de almacenamiento -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

4. La determinación de los rendimientos de proteínas y rendimientos antígeno específico

1. Determinar el contenido de proteína total usando un método de cuantificación de proteínas comercial, como el ensayo de BCA según el protocolo del fabricante.
2. Para evaluar el contenido de antígeno específico, realice ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima directo (ELISA) mediante el recubrimiento de diluciones seriadas de antígeno estándar y 2-51; g de muestra de proteína total a una placa de 96 pocillos de fondo plano ELISA.
   1. Siga con anticuerpos específicos de antígeno para investigar la presencia de los antígenos en la placa y el uso de sustratos de desarrollo ELISA convencionales para producir absorbancia detectable para lector de microplacas. Vea la Figura 2 para los resultados representativos de ensayo de HA y ELISA para una muestra de HA-expresión de VLP; muchas combinaciones de HA y NA son, posiblemente, pero los rendimientos pueden diferir de la compatibilidad HA-NA ^15.
      Nota: anticuerpos antígeno-específicos tienen afinidades variables y se recomienda que la dilución de punto final-titulación de anticuerpos se determinará antes de realizar la cuantificación de VLP. anticuerpos comerciales tendrán de concentración o dilución rangos sugeridos para su uso en ELISA, así como los protocolos sugeridos.

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Resultados

los rendimientos de VLP fueron variables de diseño de construcción de antígeno viral. En este protocolo, hemos demostrado el uso de células de insecto y de mamífero para la producción de SVP o VLPs en el sobrenadante y la purificación por ultracentrifugación. Cuatro subtipos de DENV prM / E gen estructural casetes de expresión se utilizaron para construir las versiones de DENV SVPs (demarcadas como 1-4) en la Tabla 1 y demuestran un rango entre 1.1 a 2.6 mg de p...

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Discusión

Hemos utilizado las técnicas descritas anteriormente con éxito para expresar y purificar SVPs y VLP compuestas de múltiples proteínas estructurales de diversos patógenos. En general, se utilizan sistemas de expresión de mamífero para generar nuestros VLP. Sin embargo, en nuestras manos, las células derivadas de mamíferos rendimientos VLP CHIK eran bajos. rendimiento VLP CHIK era más robusto cuando se utiliza un sistema de células de insectos baculovirus recombinante. En general, baculovirus de insectos sistem...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096