Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

Resumo

partículas semelhantes a vírus (VLPs) e partículas sub-virais (SVPS) são uma abordagem alternativa para concepção de uma vacina viral que oferece as vantagens de aumento da bio-segurança e estabilidade ao longo do uso de agentes patogênicos vivos. Não infeccioso e a auto-montagem, as VLP são utilizados para apresentar a proteínas estruturais como imunogénios, evitando a necessidade de agentes patogénicos vivos ou vectores virais recombinantes para a entrega de antigénio. Neste artigo, demonstramos as diferentes fases de concepção VLP e desenvolvimento para futuras aplicações em testes em animais pré-clínicos. O procedimento inclui as seguintes fases: selecção do antigénio, a expressão do antigénio na linha de células de escolha, purificação de VLP / SVPS, quantificação e para a dosagem de antigénio. Nós demonstramos a utilização de ambas as linhas celulares de mamífero e de insecto para a expressão de antigénios e os nossos demonstrar como metodologias diferem no rendimento. A metodologia apresentada podem ser aplicadas a uma variedade de agentes patogénicos e pode ser conseguido por substituição dos antigénios imunogénicos com Strproteínas uctural de microorganismo do usuário de interesse. VLP e SVPS auxiliar na caracterização de antigénios e selecção dos melhores candidatos a vacinas.

Introdução

partículas semelhantes a vírus (VLPs) são uma tecnologia aprovado para vacinação humana. Na verdade, algumas das vacinas mais contemporaneamente licenciados, incluindo os vírus do papiloma humano (HPV) e Β hepatite (HepΒ) vacinas empregam esta abordagem. As VLPs são formadas a partir de proteínas estruturais capazes de auto-montagem. As partículas montados imitar morfologias virais, mas não pode infectar ou replicar porque lhes falta genomas virais. VLP pode ser expressa e purificada a partir de um número de sistemas procariotas e eucariotas. Uma revisão da literatura revelou que os diferentes sistemas de expressão são empregadas com as seguintes taxas: bactérias - 28%, a levedura - 20%, planta - 9%, inseto - 28%, e de mamíferos - 15% ^1. Digno de nota, as vacinas de HPV com base em proteína da cápside L1 são produzidos em levedura (a vacina) ou num sistema de células de insecto (CERVARIX) ^2. Vacinas HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, também são produzidos em levedura, e são compostos de antigénio de superfície ³ HepΒ, 4.

Usamos os sistemas de expressão de células de mamífero e de insecto para produzir VLPs que requerem a co-expressão de várias proteínas estruturais para montagem. O nosso trabalho centra-se na concepção, produção e vacinas baseadas em VLP depurar contra patógenos humanos: vírus influenza, vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da dengue (DENV), e do vírus chikungunya (CHIKV). Os nossos métodos são flexíveis o suficiente para permitir a co-expressão das proteínas estruturais múltiplos a partir de vários plasmídeos de expressão, ou de um único plasmídeo de expressão (Figura 1). Anteriormente, produzida e purificada H5N1 VLP montado a partir da co-expressão de plasmídeos que codificam a hemaglutinina de influenza (HA), neuraminidase (NA), e da matriz (M1) em células 293T de rim embrionário humano ^5,6. Os genes foram codões optimizados para a expressão em células de mamífero e clonado em pTR600, um vector de expressão eucariota que contém os citomegalovírus precoce imediato de promotor mais intrão A para iniciar transcription de inserções eucarióticas e o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento bovino para a terminação da transcrição ^7. Uma abordagem semelhante utilizando a co-expressão de três plasmídeo de HA, NA (Figura 1A) e uma proteína de matriz viral alternativa, o HIV Gag p55, foi usada para a geração de humano gripe sazonal subtipo H3N2 VLP neste estudo e foi mostrado para gerar VLP de tamanho similar como partículas de influenza ^8. Embora as vacinas da gripe predominantemente eliciar anticorpos anti-HA, a adição da neuraminidase da gripe medeia a actividade de sialidase para permitir brotamento VLP a partir de células transfectadas e ⁹ também são alvos imunogénicos adicionais. Para produzir VLPs de RSV, que também seleccionado o núcleo não relacionados de HIV Gag para conceber vacinas prototípicos que apresentam glicoproteínas de superfície exclusivamente RSV para demonstrar ainda mais a flexibilidade de formação de VLP utilizando HIV Gag, como previamente descrito e caracterizado por microscopia electrónica de ^6,10. Outrastêm mostrado previamente que as VLPs apresentando glicoproteínas de RSV pode ser montado utilizando vários componentes virais do vírus da Doença de Newcastle (NDV) ^11, e a matriz de influenza ^12. sequências de glicoproteína de superfície de comprimento completo foram utilizados neste estudo para reter conformações nativas, que possam ser necessárias para a ligação do receptor funcional e ensaio de reconhecimento do anticorpo por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

Os nossos exemplos para a utilização de sistemas de expressão de plasmídeo isolados para gerar partículas são DENV e CHIKV. No caso de DENV, que podem produzir partículas sub-virais (SVPS) sem cápside em células 293T a partir de um único plasmídeo que contém uma cassete de expressão de prM / PT ¹³ gene estrutural. O termo SVP é utilizada para designar a ausência de uma proteína da cápside do núcleo ou na montagem de proteínas estruturais virais. CHIK VLP também pode ser produzida utilizando um único plasmídeo que contém uma proteína de cassete de genes estruturais, da cápside e de codificação do envelope CHIKV, ou em insect células, infectando com um baculovírus recombinante que codifica a mesma cassete de gene estrutural optimizados para a expressão de células de insecto (Figura 1B - C).

O resultado final da expressão abordagens acima discutidas é a libertação de VLP em meio de cultura celular que pode então ser purificado através de ultracentrifugação através de uma almofada de glicerol 20%. Neste relatório, apresentamos métodos para expressar e purificar estas VLP a partir de sistemas de células de mamíferos e insetos.

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Protocolo

1. Sistema de expressão de mamífero para a geração de gripe H3N2 VLP

1. Subclone viral estrutural glicoproteínas hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), e vírus da imunodeficiência humana (HIV) Gag p55 em vectores de expressão eucarióticos, tais como pTR600 descrito anteriormente ^7.
2. Amplificar o ADN em Escherichia coli quimicamente competentes (por exemplo, DH5a) e isolar o plasmídeo de transfecção de grau utilizando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Quantidade de DNA é dependente de rendimento e as necessidades do usuário.
3. Manter a linha celular de mamífero, 293T, em meio de crescimento contendo 10% de soro fetal de-bovino (FBS) a 37 ° C com 5% de _CO2 num incubador humidificado.
4. Cultivar células de tal modo que um frasco de cultura de tecidos T-150 contém 45-75 x 10 ⁶ culas por frasco de modo a que balão obtém adesão célula completa e uma confluência celular de 85-95% no dia seguinte. Inspecionar as células ao microscópio para conflu desejadorência.
   Nota: de elevada densidade celular é normalmente recomendado para se obter a expressão da proteína óptima, com a citotoxicidade mínima quando utilizando os reagentes de transfecção comerciais no entanto o excesso de confluência pode resultar na acumulação de resíduos celulares subprodutos e reduzir a viabilidade celular.
5. No dia da transfecção, preparar lipossomas e mistura de ADN de acordo com as recomendações do fabricante e transfectar células de ADN com uma composição de ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag com uma quantidade total de ADN de 40 ug por T-150 frasco. Dilui-se soluções de ADN e de lipossomas em meio de transfecção isento de soro sem antibióticos de modo a que cada frasco contenha um volume total de 20-30 ml.
   Nota: Rácio de construções de genes pode requerer optimização do usuário. Embora não demonstrado aqui, um procedimento semelhante transfecção foi realizada com o vírus sincicial respiratório (RSV) F e Gag de HIV a uma razão de 1: 1. Para DENV e CHIKV plasmídeos de expressão única, um total de 20 ug de DNA por 150 T-balão são utilizados para a óptima expression. ADN: transfecção proporções de reagentes são otimizados usuário. Uso recomendado meio de transfecção baseados no método de transfecção, ou seja, lípidos transfecções policatiónicos recomendam a redução ou ausência de soro fetal bovino, assim, meios pode ser suplementado com hormonas de crescimento e oligoelementos para suportar o crescimento na ausência de soro.
6. Retorno frascos a 37 ° C com 5% de _CO2. Para um volume de 200 ml, 9 utilizar balões T-150. As células são mantidas em meio de cultura de transfecção até ao dia da colheita de VLP.
7. Colheita do sobrenadante da cultura a partir de células após 72-96 h pós-transfecção, dependendo do antigénio, ou quando a viabilidade celular diminuiu para 70-80%, tal como estimada por inspecção microscópica. Transferir o sobrenadante para tubos de 50 mL cónicos e girar para baixo as células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares.
   Nota: A substituição de três dias com o sobrenadante pré-aquecido, meios de transfecção isento de soro fresco para as células aderentes vai yielda segunda série de VLP com rendimento semelhante ou ligeiramente reduzida e deve ser otimizado pelo usuário.
8. sobrenadante piscina e filtro através de uma membrana de 0,22 mM poros antes de sedimentação através de ultracentrifugação.
9. Testar a atividade hemaglutinante das VLP expressando HA por ensaio de hemaglutinação padrão ¹⁴ usando 0,8% peru ou células vermelhas do sangue de mamíferos ou de prosseguir com ELISA específico de antigénio. Veja a Figura 2 para resultados representativos.

2. Expressão de VLP CHIK Usando baculovírus / insectos do sistema celular

1. Gerar baculovírus recombinantes expressando capsídeo do vírus chikungunya e proteínas do envelope (C-E3-E2-6K-E1) a partir de S-27 estirpe utilizando um sistema de expressão de baculovírus comercial.
2. Cultura de células Sf9 Spodoptera frugiperda Sf9 em meio de crescimento isento de soro com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 28 ° C. Use 3-5 x 10 ⁵ C / ml para iniciar culturas balão rotativo para suspenso crescimento de células de iões. Passagem rotineiramente quando atingirem densidades de células de 2-4 x 10 ⁶ / mL (a cada 3-4 dias).
3. Cultura de células Sf9 em suspensão em frascos rotativos, com agitação a 130 rpm num agitador de placa sistema multiponto. Para permitir o arejamento adequado, manter volumes de cultura em não mais do que metade do volume do frasco com agitação.
4. Para a expressão de VLPs CHIK, infectar células Sf9, a uma densidade de 2 X 10 ⁶ células / ml, com baculovírus recombinante a uma multiplicidade de infecção de 1 e regresso a 28 ° C incubadora. Tipicamente, infectar um ou dois frascos rotativos de 250 ml, contendo células Sf9.
   Nota: Apesar de não utilizar este método, as células Sf9 podem ser cultivadas em frascos de agitação a 28 ° C, utilizando uma plataforma shaker.
5. culturas colheita após 72-96 h pós-infecção, ou quando a viabilidade celular diminuiu para 70-80%, tal como determinado por exclusão com Azul de Tripano de acordo com o protocolo do fabricante.
   Nota: As células continuam a proliferar, enquanto infectado e não háa ~ 80% de viabilidade em culturas de Sf9 infectadas com baculovírus recombinantes CHIK VLP aos 3 dias pós-infecção (dpi). células infectadas por baculovírus são maiores na aparência. Morfologia também pode mudar de volta a oblongo. No final dos estágios de infecções de baculovirus, as células começaram a lisar.
6. culturas de transferência directamente a partir de cultura em suspensão em 50 ml tubos cónicos e girar as células para baixo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
7. Recolha sobrenadantes e filtrar através de uma membrana de 0,22 mM poros antes de sedimentação através de ultracentrifugação.

3. Sedimentação / Purificação de VLP / SVPS

1. Esterilizar 25 mm x 89 mm open-top tubos de ultracentrífuga com 70% de etanol na capa de biossegurança. Verifique se o etanol tenha secado antes de usar.
2. Coloque até 32 ml de sobrenadante para um tubo limpo. Um volume mínimo de 25 ml é recomendado para evitar o colapso e danos dos tubos de ultracentrífuga insuficientemente cheios.
3. subjacente cuidadosamente sobrenadantes with glicerol estéril de 3 ml de 20% em PBS (v / v). Certifique-se de tubos são equilibradas.
4. Centrifugação a 135.000 xg durante 4 h a 4 ° C.
5. Aspirar o sobrenadante, assegurando o sedimento não desalojar do tubo.
6. Ressuspender sedimentado VLP na parte inferior dos tubos com PBS estéril por vigorosamente pipetando para cima e para baixo. A quantidade de PBS necessário para voltar a suspender VLP depende rendimento de proteína total VLP e aplicações a jusante. Tipicamente, ressuspender cada pellet de VLP em, pelo menos, 100 uL.
7. Armazenar as amostras a 4 ° C para armazenagem de curta duração de armazenamento e -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

4. determinação dos rendimentos de proteínas e Rendimentos antígeno específico

1. Determinar o teor de proteína total utilizando um método de quantificação de proteínas comercial, tais como ensaio BCA de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Para avaliar o conteúdo de antigénio específico, efectuar ensaio imunossorvente ligado a enzimas directo (ELISA) revestindo diluições em série do antigénio padrão e 2-51; g de amostra de proteína total para uma placa de 96 poços de fundo plano de ELISA.
   1. Siga com anticorpos específicos para o antigénio para sondar a presença dos antigénios sobre a placa e utilizar substratos de desenvolvimento de ELISA convencionais para produzir absorvância detectável para leitor de microplacas. Veja a Figura 2 para obter resultados representativos do ensaio de HA e ELISA para uma amostra de HA-expressando VLP; muitas combinações de HA e NA são, possivelmente, mas os rendimentos podem diferir sobre a compatibilidade HA-NA ^15.
      Nota: Os anticorpos específicos para antigénio têm afinidades variáveis ​​e recomenda-se que a titulação ponto final de diluição de anticorpos ser determinados antes de realizar a quantificação de VLP. anticorpos comerciais terá de concentração ou de diluição intervalos sugeridos para utilização em ELISA, bem como os protocolos sugeridos.

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Resultados

rendimentos VLP foram variáveis ​​por design construção de antigénio viral. Neste protocolo, demonstramos a utilização de células de insecto e de mamífero para a produção de SVP ou VLP em sobrenadante e purificação por ultracentrifugação. Quatro subtipos de gene estrutural cassetes de expressão DENV prM / E foram usadas para construir as versões do DENV SVPS demarcadas (1-4) como na Tabela 1 e demonstram uma gama entre 1,1-2,6 mg de proteína total em...

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Discussão

Usámos as técnicas descritas acima para expressar e purificar com êxito SVPS e as VLP compostas por várias proteínas estruturais para vários patogénios. De um modo geral, que utilizam sistemas de expressão de mamífero para gerar nossos VLP. No entanto, em nossas mãos, de células derivadas de mamíferos CHIK rendimentos VLP foram baixos. CHIK rendimento VLP foi mais robusta quando se utiliza um sistema de células de baculovírus de insectos recombinante. Em geral, baculovírus de insecto sistemas de células ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096