Expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la synthèse de particules de type viral en utilisant soit baculovirus ou systèmes d'expression de mammifères, et la purification de l'ultracentrifugation. Cette approche hautement personnalisable est utilisée pour identifier des antigènes viraux comme cibles de vaccins d'une manière sûre et flexible.

Résumé

Les particules virales (VLP) et des particules sous-virales (de SSVP) sont une approche alternative à la conception de vaccins viraux qui offre les avantages de l'augmentation de la biosécurité et de la stabilité sur l'utilisation d'agents pathogènes vivants. Non-infectieuses et auto-assemblage, les VLP sont utilisés pour présenter les protéines structurales comme immunogènes, en contournant la nécessité d'agents pathogènes vivants ou des vecteurs viraux recombinants pour la livraison de l'antigène. Dans cet article, nous démontrons les différentes étapes de la conception et le développement VLP pour des applications futures dans l'expérimentation animale préclinique. La procédure comprend les étapes suivantes: la sélection de l'antigène, l'expression de l'antigène dans la lignée cellulaire de choix, la purification des VLP / des SVP, et la quantification de l'antigène dosage. Nous démontrons l'utilisation des deux lignées cellulaires de mammifères et d'insectes pour l'expression de nos antigènes et de démontrer comment les méthodologies diffèrent du rendement. La méthodologie présentée peut demander à une variété d'agents pathogènes et peut être obtenue en substituant les antigènes avec str immunogèneuctural protéines de la micro-organisme de l'utilisateur d'intérêt. VLP et aider avec l'antigène des SVP caractérisation et sélection des meilleurs candidats vaccins.

Introduction

Les particules virales (VLP) sont une technologie approuvée pour la vaccination humaine. En fait, certains des vaccins plus contemporarily sous licence, y compris le virus du papillome humain (VPH) et l'hépatite Β (HepΒ) vaccins utilisent cette approche. Les VLP sont formées à partir des protéines structurales capables d'auto-assemblage. Les particules assemblées imitent morphologies virales, mais ne peuvent pas infecter ou de reproduire parce qu'ils manquent de génomes viraux. Les VLP peuvent être exprimés et purifiés à partir d'un certain nombre de systèmes procaryotes et eucaryotes. Une revue de la littérature a révélé que différents systèmes d'expression sont employés aux taux suivants: bactéries - 28%, de la levure - 20%, plante - 9%, insecte - 28%, et de mammifères - 15% ^1. Il faut noter que les vaccins HPV à base de protéine de capside L1 sont produites dans la levure (Gardasil) ou dans un système de cellules d'insecte (Cervarix) ^2. Vaccins HepΒ, Recombivax et Engerix-Β, sont également produites dans la levure, et sont composés de HepΒ antigène de surface ³, 4.

Nous utilisons des systèmes d'expression de cellules d'insectes et de mammifères pour produire des VLP nécessitant une co-expression de plusieurs protéines structurales pour l'assemblage. Notre travail se concentre sur la conception, la production et les vaccins à base de VLP-purifiantes contre les agents pathogènes humains: virus de la grippe, le virus respiratoire syncytial (RSV), le virus de la dengue (DENV), et le virus du chikungunya (CHIKV). Nos méthodes sont suffisamment souples pour permettre la co-expression des protéines structurales multiples à partir de plusieurs plasmides d'expression ou un plasmide d'expression (figure 1). Auparavant, nous avons produit et purifié H5N1 VLP assemblé à partir de la co-expression de plasmides codant pour la grippe hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), et de la matrice (M1) dans des cellules de rein embryonnaire humain 293T ^5,6. Les gènes ont été codons optimisés pour l'expression dans des cellules de mammifères et clones dans pTR600, un vecteur d'expression eucaryote contenant le cytomégalovirus promoteur immédiat-précoce, plus Intron A pour initier transcription d'inserts eucaryotes et le signal de polyadénylation de l' hormone de croissance bovine pour la terminaison de la transcription ^7. Une approche similaire en utilisant la co-expression de trois plasmides de HA, NA (figure 1A) et une protéine de matrice du virus de remplacement, le VIH Gag p55, a été utilisé pour la production du sous - type de grippe humaine saisonnière H3N2 VLP dans cette étude et a été montré pour générer VLP de taille similaire à celle des particules de la grippe ^8. Bien que les vaccins contre la grippe provoquent principalement des anticorps anti-HA, l'addition de neuraminidase de la grippe médie l' activité de la sialidase pour permettre le bourgeonnement des VLP à partir des cellules transfectées et ⁹ présentent également des cibles immunogènes supplémentaires. RSV pour produire des VLP, nous avons choisi le noyau non lié du VIH Gag pour concevoir des vaccins prototypes qui présentent des glycoprotéines de surface RSV exclusivement pour démontrer davantage la flexibilité de la formation de VLP en utilisant Gag du VIH, comme décrit précédemment et caractérisé par microscopie électronique à ^6,10. Autresont précédemment montré que les VLP présentant glycoprotéines de RSV peuvent être assemblés en utilisant différents composants viraux du virus de la maladie de Newcastle (NDV) ¹¹ et la matrice ¹² de la grippe. Pleine longueur surface des séquences de glycoprotéine ont été utilisées dans cette étude pour conserver des conformations natives qui peuvent être nécessaires pour le récepteur fonctionnel de liaison et le dosage de reconnaissance d'anticorps par dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Nos exemples d'utilisation de systèmes d'expression de plasmides individuels pour générer des particules sont MENV et CHIKV. Dans le cas de DENV, nous pouvons produire des particules sous - virales (de SSVP) sans capside dans des cellules 293T à partir d' un seul plasmide contenant un prM / E gène de structure cassette d' expression ^13. Le terme SVP est utilisé pour désigner l'absence d'une protéine de noyau ou capside dans l'assemblage des protéines structurales virales. CHIK VLP peut également être produite en utilisant un seul plasmide contenant une cassette CHIKV gène de structure codant pour les protéines de capside et d'enveloppe, ou insect cellules par infection avec un baculovirus recombinant codant pour la même cassette de gène structural optimisé pour l' expression de cellules d' insecte (figure 1B - C).

Le résultat de l'expression approches discutées ci-dessus final est la libération de VLP dans le milieu de culture cellulaire qui peut ensuite être purifié par une ultracentrifugation à travers un coussin de glycerol à 20%. Dans ce rapport, nous présentons les méthodes pour exprimer et purifier ces VLP à partir de systèmes cellulaires de mammifères et d'insectes.

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Protocole

1. Système d'expression mammalien pour la génération de la grippe H3N2 VLP

1. Le sous - clone viral structurel glycoprotéines hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA) et le virus de l' immunodéficience humaine (VIH) , Gag p55 dans des vecteurs d'expression eucaryotes, tels que décrits précédemment pTR600. ⁷
2. Amplifier l' ADN dans Escherichia coli chimiquement compétentes (par exemple, DH5a) et isoler le plasmide transfection de qualité en utilisant un kit de purification plasmidique selon les instructions du fabricant. Montant de l'ADN dépend sur le rendement et les besoins des utilisateurs.
3. Maintenir une lignée cellulaire de mammifère, 293T, dans des milieux de croissance contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 ° C avec 5% de _CO2 dans un incubateur humidifié.
4. Cultiver des cellules telles que T-150 culture de tissus flacon contient 45-75 x 10 ⁶ cellules par flacon de telle sorte que ballon obtient l' adhérence des cellules complètes et 85-95% de confluence des cellules par le lendemain. Inspecter les cellules sous le microscope pour Conflu désiréence.
   Remarque: haute densité cellulaire est généralement recommandé pour obtenir une expression optimale de protéine avec une cytotoxicité minimale lors de l'utilisation des réactifs de transfection commerciaux mais sur-confluence peut entraîner l'accumulation de déchets cellulaires sous-produits et de réduire la viabilité cellulaire.
5. Le jour de la transfection, on prépare des liposomes et le mélange d'ADN selon les recommandations du fabricant et transfecter des cellules d'ADN avec une composition d'ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag avec une quantité d'ADN total de 40 pg par T-150 flacon. Des solutions diluées d'ADN et de liposomes dans le milieu de transfection sans sérum, sans antibiotiques, de telle sorte que chaque flacon contient un volume total de 20-30 ml.
   Remarque: Ratio des constructions de gènes peut nécessiter l'optimisation de l'utilisateur. Bien que non montré ici, une procédure de transfection similaire a été réalisée avec le virus respiratoire syncytial (VRS) F et Gag du VIH dans un rapport de 1: 1. Pour DENV et CHIKV plasmides d'expression unique, un total de 20 pg d'ADN par T-150 flacon sont utilisés pour optimiser eXpression. ADN: transfection des rapports de réactif sont optimisés utilisateur. Utilisation recommandée milieu de transfection selon la méthode de transfection, à savoir, transfections lipidiques polycationiques recommandent la réduction ou l' absence de sérum fœtal bovin ainsi les médias peuvent être complétées avec des hormones de croissance et d' oligo - éléments pour soutenir la croissance en l'absence de sérum.
6. Flacons revenir à 37 ° C avec 5% de CO ₂ incubateur. Pour un volume de 200 ml, utiliser 9 T-150 flacons. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture de transfection jusqu'au jour de la récolte de la VLP.
7. Récolte surnageant de culture de cellules après 72-96 heures après la transfection en fonction de l'antigène, ou lorsque la viabilité cellulaire a diminué à 70-80%, selon les estimations de l'inspection microscopique. Transférer le surnageant dans des tubes coniques de 50 ml et de faire tourner les cellules vers le bas à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires.
   Remarque: Le remplacement de 3 jour surnageant avec préchauffée, transfection du milieu frais sans sérum pour les cellules adhérentes se yielda second lot de VLP avec un rendement et similaire ou légèrement réduite doit être optimisée par l'utilisateur.
8. Piscine surnageant et filtre à travers une membrane de 0,22 um des pores avant la sédimentation par ultracentrifugation.
9. Testez l'activité d'hémagglutination des VLP HA exprimant par hémagglutination norme ¹⁴ en utilisant 0,8% de dinde ou de globules rouges de mammifères ou de procéder à spécifique de l' antigène ELISA. Voir Figure 2 pour des résultats représentatifs.

2. CHIK VLP Expression Utilisation du système cellulaire baculovirus / Insecte

1. Générer baculovirus recombinants exprimant capside du virus du chikungunya et de protéines d'enveloppe (C-E3-E2-6K-E1) de S-27 souche en utilisant un système d'expression baculovirus commerciale.
2. Culture Spodoptera frugiperda cellules Sf9 dans du milieu de croissance Sf9 sans sérum avec 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 28 ° C. Utilisez 3-5 x 10 ⁵ c / ml pour initier des cultures spinner flacon pour suspensla croissance cellulaire ionique. Passage régulièrement quand ils atteignent des densités de cellules de 2-4 x 10 ⁶ c / ml (tous les 3-4 jours).
3. cellules Culture Sf9 en suspension dans des flacons spinner avec agitation à 130 rpm sur un système multipoint de plaque d'agitateur. Pour une bonne aération, de maintenir des volumes de culture à pas plus de la moitié du volume de la fiole centrifuge.
4. Pour l' expression de VLP CHIK, infecter des cellules Sf9 à une densité de 2 x 10 ⁶ cellules / ml avec un baculovirus recombinant à une multiplicité d'infection de 1 et retour à 28 ° C incubateur. Typiquement, infecter un ou deux flacons rotatifs, contenant 250 ml de cellules Sf9.
   Note: Bien que nous ne pas utiliser cette méthode, les cellules Sf9 peuvent être cultivées dans des flacons secoueurs à 28 ° C en utilisant une plate-forme de shaker.
5. Récolte des cultures après 72-96 heures après l'infection, ou lorsque la viabilité des cellules a diminué de 70 à 80% tel que déterminé par exclusion au bleu Trypan selon le protocole du fabricant.
   Remarque: Les cellules continuent de proliférer tout en étant infecté et il y aa ~ 80% de viabilité dans les cultures Sf9 infectées par le baculovirus CHIK VLP recombinantes à 3 jours post-infection (dpi). les cellules infectées par un baculovirus sont plus grandes en apparence. Morphologie peut aussi changer de rond à oblong. Dans la fin des étapes de baculovirus infections, les cellules ont commencé à lyser.
6. cultures de transfert directement à partir de la culture en suspension dans 50 ml tubes coniques et tourner les cellules vers le bas à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
7. Recueillir surnageants et filtrer à travers une membrane de 0,22 um des pores avant la sédimentation par ultracentrifugation.

3. Sédimentation / Purification de VLP / des SVP

1. Stériliser 25 mm x 89 mm à toit ouvert tubes d'ultracentrifugation avec de l'éthanol à 70% dans la biosécurité capot. Vérifiez que l'éthanol a séché avant de l'utilisation.
2. Chargez jusqu'à 32 ml de surnageant dans un tube propre. Un volume minimal de 25 ml est recommandée pour éviter l'effondrement et l'endommagement des tubes d'ultracentrifugation insuffisamment remplis.
3. underlay soigneusement surnageants with stérile de 3 ml de glycerol à 20% dans du PBS (v / v). Assurez-vous que les tubes sont équilibrés.
4. Spin à 135.000 xg pendant 4 heures à 4 ° C.
5. Aspirer le surnageant, assurant la pastille ne se déloge pas de tube.
6. Remettre en suspension les VLP sédimenté au fond des tubes avec du PBS stérile par pipetage vigoureusement vers le haut et vers le bas. La quantité de PBS nécessaire pour remettre en suspension les VLP dépend de VLP rendement de protéines totales et des applications en aval. Typiquement, resuspendre chaque culot de VLP dans au moins 100 pi.
7. Conserver les échantillons à 4 ° C pour le stockage à court terme et -80 ° C de stockage pour le stockage à long terme.

4. Déterminer les rendements de protéines et rendements d'antigènes spécifiques

1. Déterminer la teneur en protéines totales en utilisant une méthode de quantification de protéine du commerce, tel que le dosage BCA selon le protocole du fabricant.
2. Pour évaluer le contenu spécifique de l'antigène, effectuer de dosage immuno-enzymatique directe (ELISA) par enrobage des dilutions en série d'antigène standard et 2-51; g de l'échantillon de protéine totale à une plaque à 96 puits à fond plat ELISA.
   1. Suivez avec des anticorps spécifiques de l'antigène pour sonder la présence des antigènes sur la plaque et utiliser des substrats de développement ELISA classiques pour produire absorbance détectable pour lecteur de microplaques. Voir la figure 2 pour obtenir des résultats représentatifs de HA et ELISA pour un échantillon VLP HA exprimant; de nombreuses combinaisons de HA et NA sont peut - être , mais les rendements peuvent différer de la compatibilité HA-NA ^15.
      Note: les anticorps spécifiques de l'antigène ont des affinités variables et il est recommandé que endpoint-titrage de dilution d'anticorps déterminée avant d'effectuer la quantification VLP. anticorps commerciaux auront concentration ou de dilution gammes suggérés pour une utilisation dans ELISA, ainsi que les protocoles proposés.

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Résultats

les rendements des VLP étaient variables par virale conception antigène construction. Dans ce protocole, nous avons démontré l'utilisation de cellules insectes et de mammifères pour la production de VLP UDC ou dans le surnageant et la purification par ultracentrifugation. Quatre sous - types de DENV prM / E gène structurel des cassettes d'expression ont été utilisés pour construire les versions de DENV (délimitées comme des SVP 1-4) dans le tableau 1 e...

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Discussion

Nous avons utilisé les techniques décrites ci-dessus pour exprimer et purifier avec succès et les VLP composées des SVP de protéines structurales multiples pour différents agents pathogènes. En général, nous utilisons des systèmes d'expression de mammifères pour générer nos VLP. Cependant, dans nos mains, de cellules de mammifères dérivé CHIK rendements VLP étaient faibles. rendement VLP CHIK était plus robuste lors de l'utilisation Un système de cellules baculovirus-insecte recombinant. En g?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096