Creación de Sub-50 Nm nanofluídico uniones en PDMS microfluidos de chips VIA proceso de autoensamblaje de partículas coloidales

Resumen

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

Resumen

Polidimetilsiloxano (PDMS) es el material de construcción predominante para hacer que los dispositivos de microfluidos debido a su facilidad de moldeo y unión, así como su transparencia. Debido a la suavidad del material PDMS, sin embargo, es difícil de utilizar para la construcción de PDMS nanocanales. Los canales tienden a colapsar fácilmente durante la unión plasma. En este trabajo, presentamos un método de auto-ensamblaje de evaporación impulsado de nanopartículas de sílice coloidal para crear uniones nanofluídicos con sub-50 nm poros entre dos microcanales. El tamaño de poro así como la carga superficial de la unión nanofluídico es sintonizable simplemente cambiando la perla de sílice coloidal tamaño y la superficie de funcionalización fuera del dispositivo de microfluidos montado en un vial antes de que el proceso de autoensamblaje. Usando el auto-ensamblaje de nanopartículas con un tamaño de gota de 300 nm, 500 nm, y 900 nm, fue posible fabricar una membrana porosa con un tamaño de poro de ~ 45 nm, ~ 75 nm y ~ 135 nm, respectivamente. bajo eléctricoal potencial, esta membrana iniciado polarización de la concentración de iones (ICP) que actúa nanoporoso como una membrana selectiva para los cationes de concentrar ADN por ~ 1.700 veces dentro de 15 min. Este proceso nanofabricación no litográfica se abre una nueva oportunidad para construir una unión nanofluídico sintonizable para el estudio de los procesos de transporte a escala nanométrica de los iones y moléculas dentro de un chip de microfluidos PDMS.

Introducción

Nanofluidos es un área emergente de investigación del mu TAS (Micro Total de Analysis Systems) para estudiar los procesos biológicos o fenómenos de transporte de iones y moléculas en la escala de longitud de 10 ¹ - 10 ² nm. Con el advenimiento de las herramientas nanofluídicos como nanocanales, los procesos de transporte de moléculas e iones pueden monitorizarse con precisión sin precedentes y manipulados, si es necesario, mediante la explotación de características que están disponibles sólo en esta escala de longitud para la separación y detección. ^1,2 Una de estas características a nanoescala característica es una alta relación de superficie a la carga a granel (o número Dukhin) en nanocanales que puede causar un desequilibrio de la carga e iniciar polarización de la concentración de iones (ICP) entre el nanochannel y microcanal. ³

Una plataforma de dispositivo común para el estudio de fenómenos nanofluídicos consiste en un sistema de dos microcanales conectados por una serie de nanocanales como un cruce. ^4-6 El material de elección para la construcción de un dispositivo de este tipo es la nanofluídico de silicio debido a su alta rigidez que impide que el canal se colapse durante procesos de unión. ⁷ Sin embargo, la fabricación de dispositivos de silicio requiere máscaras caras y cantidad sustancial de procesamiento en las instalaciones de sala limpia. ^{8- 10} Debido a la conveniencia de la fabricación del dispositivo a través de moldeo y unión de plasma, polidimetilsiloxano (PDMS) ha sido ampliamente aceptado como un material de construcción para la microfluídica y sería un material ideal para nanofluidos también. Sin embargo, el módulo de Young bajo su alrededor 360 a 870 kPa, hace que el canal de PDMS fácilmente plegable durante la unión de plasma. La relación de aspecto mínima de la nanochannel (anchura a profundidad) tiene que ser de menos de 10: 1 que significa que la fabricación de dispositivos de PDMS a través de fotolitografía estándar será extremadamente difícil si la profundidad nanochannel tiene que estar por debajo de 100 nm, lo que requiere un ancho de canal menor que el límite actual de fotolitografía en alrededor de 1 micra. Para superar esta limitación, ha habido intentos de crear nanocanales en PDMS utilizando métodos no litográficas como el estiramiento para iniciar grietas con una profundidad promedio de 78 nm ¹¹ o la formación de arrugas después del tratamiento de plasma. ¹² se derrumba un canal de PDMS con presión mecánica permitió una nanochannel altura de tan bajo como 60 nm. ¹³

A pesar de que estos métodos no litográficas altamente inventivos permiten nanocanales de construcción por debajo de 100 nm de profundidad, la capacidad de control dimensional de la fabricación nanochannel todavía representa un obstáculo para una amplia aceptación de PDMS como material de construcción para dispositivos nanofluídicos. Otro problema crítico de los nanocanales, ya sea en silicio o PDMS, es la funcionalización de la superficie en caso de que haya una necesidad de alterar la carga superficial sobre la pared del canal para la manipulación de los iones o moléculas. Después del montaje del dispositivo a través de la unión, los nanocanales son extremadamente difíciles dealcanzar para funcionalización superficial debido al transporte de difusión limitada. Para crear un canal nanoescala con alta fidelidad dimensional y funcionalización de la superficie fácil, el método de auto-ensamblaje de las partículas coloidales inducidas por evaporación ^14-16 en dispositivos de microfluidos puede ser uno de los enfoques prometedores. Además de la capacidad de control de tamaño de poro y de la propiedad de la superficie, hay incluso una posibilidad de ajustar el tamaño de los poros cuando se utiliza in situ partículas coloidales recubiertas con polielectrolitos mediante el control de la temperatura, pH ^{17, 18,19} y la fuerza iónica. ¹⁸ Debido a estos aplicaciones ventajas, el método de auto-ensamblaje de las partículas coloidales ya ha encontrado para electrocromatografía, ²⁰ biosensores, la concentración de proteína de ^{21 22} y la separación de las proteínas y el ADN en la microfluídica. ^14,23 en este estudio, se desplegaron este método de auto-ensamblaje para construir una dispositivo de preconcentración en electrocinéticaPDMS que requiere una unión nanofluídico entre dos microcanales. ²⁴ el mecanismo fundamental detrás de la concentración electrocinético se basa en polarización de la concentración de iones (ICP). ²⁵ Una descripción detallada de los pasos de fabricación y montaje se incluye en el siguiente protocolo.

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Protocolo

1. Preparación de las suspensiones de sílice coloidal del grano

1. Preparación de 300 nm y 500 suspensiones de perlas de sílice nm
   1. Vórtex con la suspensión de sílice de cuentas de valores (10% w / v en agua) durante 30 segundos. para obtener una suspensión homogénea. Pipeta de un total de 600 l de stock de suspensión en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2.600 g durante 1 min.
   2. Sustituir el sobrenadante con 400 l de tampón de fosfato de sodio 1 mM (PB, pH 7,0).
   3. Suspender las perlas de sílice en una concentración final de 15% en solución de fosfato de sodio 1 mM a pH 7,0 a través de agitación en vórtex.
2. Funcionalizar la superficie perlas de 500 nm carboxilo de sílice con poli (clorhidrato de alilamina, HAP), y con polielectrolitos poli (estireno sulfonato de sodio, PSS)
   1. Suspender 0,1 g de perlas de sílice 500 nm con grupo carboxilo con 10 ml de NaCl 1 M (pH 7,0) para 1% (w / v) de suspensión de perlas.
   2. Preparar un 0,4% HAP (MW 65K) en 1 M NaCll mediante la disolución de 300 l de la solución madre (20% w / v en agua) en 15 ml de 1 M NaCl. Preparar 0,9% PSS (MW 70K) en solución 1 M NaCl por disolución de 0,18 g PSS en 20 ml de solución 1 M de NaCl. Vortex tanto soluciones para 1 min. para disolver los polielectrolitos completamente.
   3. Añadir 200 l de solución de PAH a 9,8 ml de 1% de perlas carboxilo de sílice en un tubo de 15 ml para depositar una capa de polielectrolito cargado positivamente en perlas de sílice con grupo funcional carboxilo. Agite la suspensión de microesferas durante 1 min. y se incuba en un rotador de tubo para 60 min. a TA.
   4. Se centrifuga la suspensión de microesferas en el 1801 xg durante 1 min. y lavar los HAP no unidas cinco veces con agua DI 10 ml. Después de cada centrífuga y la eliminación del sobrenadante, las perlas se embalan densamente en la parte inferior del tubo. Interrumpir el grupo de talón mediante pipeteo vigoroso con 2 ml de agua DI antes de añadir 8 ml de agua DI para que las perlas se pueden resuspendieron y se lava antes de la siguiente etapa de centrifugación.
   5. Seguirlos pasos de 1.2.3 y 1.2.4 para el recubrimiento PSS para depositar una capa cargada negativamente sobre las perlas. Vuelva a suspender las perlas en 9,8 ml de 1 M de NaCl antes de la deposición PSS después de retirar el sobrenadante de agua DI a partir de la etapa de lavado 5 ^TH de 1.2.4.
      1. Utilice el mismo paso de pipeteado vigoroso usando 2 ml de 1 M NaCl para romper el grupo de perlas en la parte inferior del tubo 15 ml y luego añadir 8 ml de 1 M NaCl. Añadir 200 l de solución de PSS a 9,8 ml de las perlas de sílice depositadas con una sola capa de PAH. Después de agitación durante 1 min. y la incubación durante 60 min. en el rotador de tubo, repita 5 etapas de lavado con agua DI.
      2. Medir el potencial zeta de las perlas de antes y después de cada recubrimiento de polielectrolito usando un sistema de dispersión de luz dinámica de acuerdo con el protocolo del fabricante para verificar el procedimiento de deposición de polielectrolito se ha realizado correctamente (véase la Tabla 1).
   6. Repita cinco etapas de lavado con agua DI siguientes la capa única PSSdeposición y resuspender las perlas en 650 l de tampón de fosfato de sodio 1 mM con 0,05% de Tween 20 (15% w / v) antes de su uso en el dispositivo de microfluidos para mejorar su fluidez.
3. Siga el procedimiento descrito anteriormente a partir de 1.2.5 a 1.2.6 para 500 nm perlas de sílice con función amina para depositar una capa única de PSS.

2. La fabricación del chip de microfluidos PDMS

1. Microfabricación del maestro de silicio
   1. Fabricar el maestro de silicio para el moldeo por PDMS utilizando técnicas de microfabricación de la siguiente manera.
      1. abrigo de giro de un fotoprotector delgada 1 micras a 4.000 rpm en una oblea de silicio. Patrón de la capa de uso de la litografía de proyección (tiempo de exposición de 170 ms.) Y grabar 700 nanocanales planos de profundidad y 2 micras nm de ancho (que actúa como nanotraps para las perlas de sílice) con grabado iónico reactivo.
      2. Utilice los siguientes parámetros de grabado para conseguir una velocidad de grabado de 3,5 nm / s: ₃ CHF (45 sccm), CF ₄ (15 sccm), Ar (100 sccm), presión 100 mTorr, la energía de RF 200 W.
   2. escudo de la vuelta de la segunda capa de resina fotosensible grueso 1 m a 2.000 rpm y realizar una alineación de los nanotraps previamente estampadas. Patrón de los microcanales a través de la litografía de contacto y por ataque profundo de iones reactivos (DRIE) de silicio. Utilizar los parámetros de la DRIE ²⁶ en la Tabla 2.
2. La fabricación del molde de PDMS
   1. Silaniza el maestro de silicio con triclorosilano (50 l) en un frasco de vacío O / N.
      PRECAUCIÓN: Tricholorosilane es un material tóxico y corrosivo. Utilizar siempre que en una campana química con el equipo de protección personal adecuado.
   2. Mezclar la base para el agente de curado en relación 10: 1 y fundido PDMS en el maestro de silicio silanizada y curarlo a 70 ° C durante 2 horas en un horno de convección.
   3. Retire la placa de PDMS del maestro de silicio con un cuchillo y el plasma de bonos en una oblea en blanco utilizando un limpiador de plasma después de un pltratamiento asma en un limpiador de plasma para 1 min. Fije las cintas a lo largo del borde para marcar una línea de partición para los siguientes PDMS fundición paso.
   4. Silaniza el molde de PDMS en un frasco vacío con triclorosilano (50 l) S / N.
   5. PDMS fundido (base: agente de curado a 10: 1) en el molde de PDMS silanizada y curarla a 70 ° C durante 2 horas en un horno de convección.
3. La fabricación del dispositivo de PDMS
   1. Despegue la losa de PDMS curado del molde PDMS lo largo de la línea de partición marcada con la cinta.
   2. agujeros de depósito perforadas con 1,5 mm punzón de biopsia, limpio, con una cinta, enjuague con alcohol isopropílico (IPA) y se seca con nitrógeno.
   3. enlace de plasma del dispositivo de PDMS en un 25 mm x 75 mm portaobjetos de vidrio de microscopio después de un tratamiento de plasma en un limpiador de plasma para 1 min.
4. Ultrasonicate la suspensión de microesferas durante 60 min. en un baño ultrasónico antes del llenado. Pipetear una suspensión de perlas 10 l (300 nm sea sílice no funcionalizadoanuncios, o 500 perlas de carboxilo de sílice nm con capas PAH-PSS, o 500 perlas de amina de sílice nm con una capa PSS) en las entradas 4 y 6 cada uno (véase la Figura 1 A, B) inmediatamente después de la unión de plasma del chip PDMS a una sustrato de vidrio. Golpee suavemente en el chip de PDMS con una punta de pipeta para mejorar el embalaje del grano.
   1. Después de llenar los canales de suministro de bolitas, cubrir todas las entradas excepto 1 y 9 con cinta. El aire seco del dispositivo durante 3 horas y se almacena a 4 ° C antes de su uso. La figura 2 muestra un esquema paso a paso del proceso de autoensamblaje coloidal.

3. Experimento de Electrocinético La concentración de ADN

1. Llenar los depósitos 3, 7 con una solución tampón (10 l de PB 1 mM) y el depósito 5 con una muestra de ADN (10 l de 10 nM en PB 1 mM) y aplicar una presión negativa suave con una punta de pipeta invertida en depósitos 2 , 8 y 10 para llenar los canales con las soluciones sin burbujas (véase Figura 1B).
2. Añadir 10 l de PB 1 mM a los depósitos 2 y 8 y 10 l de ADN 10 nM al depósito 10 para equilibrar la presión y esperar 5 min. para alcanzar el equilibrio.
3. Inserte los cables de Pt en los depósitos 3, 5, 7, 10.
4. Aplicar tensión a través de la unión nanofluídico utilizando un divisor de tensión conectado a un medidor de la fuente y los cables de Pt. Primero aplique 30 V en los embalses 5, 10 y GND en depósitos 3, 7.
5. Disminuir la tensión de 25 V en el depósito 10 después de ~ 30 seg.
6. Use un obturador mecánico con una abertura periódica en cada 5 s para minimizar photobleaching de la muestra durante la grabación de las señales de fluorescencia desde el ADN.

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Resultados

Un chip concentrador electrocinética en PDMS que contiene una unión nanofluídico auto-ensamblado entre dos microcanales se muestra en la Figura 1A). El canal en el centro del dispositivo se llena con una solución de la muestra de ADN y flanqueado por dos canales de solución tampón en cada lado a través de un canal de ancho de suministro de bolitas 50 micras (Figura 1B). La suspensión coloidal de sílice se vuela en el canal de suministro de bolit...

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Discusión

Siguiendo el esquema de diseño del dispositivo común para estudiar nanofluidos, se han fabricado un cruce nanofluídico entre dos canales de microfluidos mediante el auto-ensamblaje de evaporación impulsado de nanopartículas coloidales en lugar de por litografía modelando una serie de nanocanales. Cuando fluye las partículas coloidales en el canal de suministro de bolitas, una matriz de nanotraps con una profundidad de 700 nm y una anchura de 2 m en ambos lados del canal de suministro de bolitas con una anchura to...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(Styrenesulfonic Acid) Sodium Salt	Polysciences	08772
Poly(allylamine) Solution	Sigma Aldrich	479144-5G
Silica Microsphere - 300 nm	Polysciences	24321
Silica Microsphere - 500 nm	Polysciences	24323
Silica Microsphere Carboxyl Functional - 500 nm	Polysciences	24753
Silica Microsphere Amine Functional - 500 nm	Polysciences	24756
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning
Trichlorosilane	Sigma Aldrich	175552
Ultrasonic Cleaner	Branson	3510
Tube Rotator	VWR	10136-084
Vortex Mixer	WiseMix	VM-10
Microcentrifuge	VWR	Micro 1207
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
PDMS Mixer	Thinky	ARE-250
Oven	Thermo Scientific	PR305220M
Epi-fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse Ti
CCD Camera	Andor	Clara
Platinum Electrodes	Alfa Aesar	43014
Source Meter	Keithley	2400
Digital Multimeter	Extech	410
Microscopy Glass Slides	Thermo Scientific	2951-001
Tween 20	Merck Millipore	822184
Sodium chloride	Fisher Scientific	7646-14-5
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	71505
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S3264
DNA	IDT		CAA CCG ATG CCA CAT CAT TAG CTA C
B-Phycoerythrin	Life Technologies	P-800
Dynamic light scattering system for Zeta Potential Measurement	Malvern	Zetasizer Nano S
Photoresist	Shipley	SPR700-1.0
Projection lithography	Nikon	NSR2005i9
Reactive Ion Etcher	Applied Materials	AME P5000
ICP deep reactive ion etcher	STS	STS-6"
Contact lithography	Electronic Visions	EV620
Photoresist Coater Developer	SSI	SSI 150
Non-contact surface profiler	Wyko	NT 9800