Exploración de objetos novela como un ensayo de potencial de mayor orden repetitivo Comportamientos en ratones

Resumen

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

Resumen

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

Introducción

Trastorno del espectro autista (TEA) es un trastorno neurológico que consiste en tres síntomas principales: el deterioro social, dificultad para comunicarse a través del lenguaje, y comportamientos repetitivos estampadas ^1. Desde el año 2000, el número de individuos que han sido diagnosticados con TEA ha aumentado de 1 en 150 a 1 en 68 en el lapso de diez años ^2. Aunque la prevalencia de la enfermedad sigue aumentando, la causa de la enfermedad no se conoce todavía. Ha habido un aumento de los esfuerzos para identificar modelos apropiados de ratón para el núcleo y los síntomas asociados de TEA, ya que estos modelos podrían conducir a una mayor comprensión de los síntomas subyacentes y las causas de los TEA. Hay varias cepas puras de ratones que parecen mostrar comportamientos con validez aparente de los síntomas principales del ASD, incluyendo comportamientos repetitivos ^3.

Restringidos, conductas repetitivas (RRB) son un síntoma central de algunos trastornos psiquiátricos como la TEA.RRBs puede aumentar con la gravedad del trastorno ^4, y pueden perturbar drásticamente el estilo de vida de los individuos afectados. RRB se colocan habitualmente en dos categorías, las conductas repetitivas de orden inferior, que en los seres humanos se componen de acciones tales como mecerse y sacudir las manos; y comportamientos repetitivos de orden superior, que consisten en la estricta adhesión a la rutina y la resistencia al cambio ^5-8.

Comportamientos repetitivos de orden inferior se han estudiado ampliamente en los roedores en los que se manifiestan como estereotipias de motor, que se pueden observar fácilmente en el establecimiento de un laboratorio ^9. Estos comportamientos parecen tener buena cara validez de los RRB en los seres humanos, y potencialmente fuerte validez de constructo, así ^10. Las pruebas de la presencia de los RRB de orden inferior se puede completar a través de supervisión por vídeo de la actividad del ratón para estudiar los combates y la duración de estas estereotipias motoras ^11. conductas repetitivas orden superior representan un desafío para la re biomédica básicabuscar la utilización de roedores, ya que estos RRBs no se identifican como fácilmente a través de la simple observación. Debido a la dificultad en la identificación de estos comportamientos, existen menos ensayos establecidos para el comportamiento repetitivo de orden superior. Tradicionalmente, los RRB de orden superior se han medido en roedores utilizando un paradigma del laberinto en el que el animal de prueba está capacitado para alcanzar una buena competencia en escapar. La ubicación de escape se cambia entonces y el número de ensayos necesarios para volver a aprender la ubicación de escape se registró ^12. Estos ensayos no son ideales, ya que requieren un período largo entrenamiento, a menudo inducen la ansiedad, y puede dar lugar a resultados muy variables. La exploración del agujero de a bordo también se ha utilizado para cuantificar de orden superior RRB ^13,14. Este enfoque no requiere sesiones de entrenamiento prolongados, pero no se basan en la motivación de alimentos y / o la discriminación olfativa. Los ensayos para la RRB de orden superior que no son ansiogénico o requieren formación sería un buen complemento para el repertorio existente del agujero de a bordo exploratio n y ensayos basados ​​en laberinto actualmente en uso.

El C58 / J (C58) cepa endogámica de ratón ejemplifica muy altos niveles de comportamiento estereotípico asociado con TEA, a saber, estereotipias motoras repetitivas sin propósito y los niveles elevados de auto-aseo ^3,11. Además, los ratones C58 muestran RRB a través de altos niveles de cría, de nuevo mover de un tirón y escarbando ^11,14,16. Esta cepa comienza a mostrar estas conductas temprano en el período neonatal y continúa para mostrarlos durante la edad adulta. Sería ideal para ser capaz de detectar la presencia de elevados de orden superior RRB para complementar los RRBs de orden inferior bien documentados presentes en esta cepa, así como otras cepas de ratón. El nuevo ensayo de exploración objeto descrito aquí proporciona la oportunidad para que los investigadores observan de menor orden y de orden superior RRB al mismo tiempo, ya que da la posibilidad de medir los comportamientos modelados así como estereotipias motoras repetitivas.

e_content "> Uso de la novela exploración de objetos como un ensayo para las conductas repetitivas de orden superior fue desarrollado por Pearson et al. ^17. Esta nueva evaluación es una extensión de la prueba de campo abierto bien establecida ^18-21 con la adición de cuatro nuevos objetos a la arena. los ratones se les permitió investigar libremente estos objetos no familiares y el número y el orden de las investigaciones objeto fue rastreado. las investigaciones de objetos continuación, se analizó la presencia de patrones, con los ratones BTBR que muestra los números elevados de investigaciones estampadas entre los objetos. el uso de este ensayo, los ratones puede mostrar de orden superior comportamientos repetitivos y estampadas al tiempo que elimina la necesidad de aprender comportamientos, así como la eliminación de los estímulos innecesarios. exploración de objetos Novel induce RRBs de orden superior, ya que permite a los ratones para crear patrones y secuencias de formulario a través de su exploración física . Utilizando este ensayo permite al investigador para cuantificar la presencia de estos RRBs de orden superior.

Pearson et al. desarrollado este ensayo y lo utilizó para detectar la presencia de posibles comportamientos repetitivos de orden superior en la cepa de ratones endogámicos BTBR, con resultados interesantes ^17. Hemos publicado recientemente un estudio de seguimiento mirando a los comportamientos de la C58, C57BL / 6J (C57) y / NJ (FVB) cepas FVB, así como una investigación más detallada sobre las posibles variables de confusión presente en este ensayo, y la posible enfoques estadísticos para el análisis de los datos generados ^22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

El protocolo descrito aquí fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Redlands. Los ratones C58, C57, y FVB utilizadas en estos estudios fueron criados en la Universidad de Redlands vivero desde el almacén obtenido originalmente del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). Centinelas de este vivero fueron examinados cada seis meses y se encontró que están libres de patógenos.

1. Equipos y habitación tenía una distribución

Nota: Se han utilizado dos escenarios diferentes para las pruebas objeto novedoso: una jaula rectangular de plástico transparente (45 cm x 24 cm x 20 cm) o una jaula circular opaca con un diámetro de base de 41 cm; sin embargo, cualquier jaula puede ser utilizado. Pearson et al. Utilizan una jaula rectangular más pequeña (20 cm x 30 cm x 20 cm) en su ensayo. Detalles de este diseño experimental específico se incluyen a continuación, pero teniendo en cuenta la novedad de este ensayo, no hay normas aceptadas en el campo de fenotipado conductual para cualquiera de las variables descritas.

1. llenar el campo de prueba con aproximadamente ½ en las camas de mazorca de maíz.
2. Seleccionar cuatro diferentes objetos novedosos. Seleccionar cuatro objetos que son aproximadamente del mismo tamaño, construidos de plástico de alta densidad para facilitar la limpieza y resistir la masticación y diferentes entre sí en forma y color. Es importante destacar que asegurar que los ratones de prueba no están expuestos a estos objetos hasta que se ejecute en el ensayo.
   Nota: Por ejemplo, un ladrillo de color rosa de juguete, un mono rojo, un azulejo blanco con la escritura azul y una matriz de color blanco que se utilizaron aquí.
3. En el terreno rectangular, colocar estos objetos aproximadamente 3 cm de las esquinas. En la arena redonda, colocar los objetos, que son a la misma distancia entre sí y aproximadamente 10 cm de los lados. Registrar la colocación de cada objeto como un número diferente, 1-4 (Figura 1). Asegúrese de que los objetos se colocan en un orden aleatorio o contrapeso a lo largo de la prueba.
4. Posicionar una cámara directamente por encima de la pruebaArena para grabar todo el estadio durante los períodos de aclimatación y de ensayo.
   Nota: Tener investigadores en la misma habitación que los ratones pueden potencialmente influir en los niveles de actividad y de exploración durante la prueba.

2. Objeto Novel Prueba de Exploración

1. Prueba en el inicio del ciclo de luz en una habitación iluminada con luz fluorescente a aproximadamente 100 lux. Asegúrese de que la iluminación es uniforme en todo el campo de prueba para estandarizar la apariencia durante la grabación de vídeo.
2. Coloque un notecard de dimensiones conocidas en la parte inferior del campo de prueba y comenzar la grabación de vídeo.
3. Transferir el ratón de prueba en un campo de prueba vacío durante 10 min para servir como un período de aclimatación. El expediente del vídeo del período de aclimatación.
4. Después del período de aclimatación, deje el puntero del ratón en la arena, añadir rápidamente los cuatro objetos nuevos a la arena de prueba y registrar el comportamiento del ratón durante 10 minutos adicionales.
5. Una vez que los 20 minutos de aclimatación PE / completos de pruebasha transcurrido RIOD, devolver la prueba ratón a su jaula y limpiar a fondo y secar los nuevos objetos y campo de prueba con jabón para lavar platos sin perfume y agua.

3. Vídeo de puntuación

1. Completar todos los scoring de comportamiento utilizando el vídeo para facilitar la fiabilidad.
   Nota: Se utilizó el software de registro del comportamiento Noldus El observador para realizar los pasos ^22, como se describe aquí, pero un programa especializado no es necesario:
   1. Antes de meter el primer vídeo, configurar el esquema de proyecto en el software de registro del comportamiento de codificación mediante la creación de un nuevo proyecto o mediante la edición de un proyecto existente, de forma similar.
      1. Dentro del cuadro de configuración del proyecto, establezca la adquisición de datos a "Desconectado Observación. ' Dentro del cuadro de codificación del comportamiento, el programa de "Scrabble", "Digging", "cría", "Preparación" y "Objeto Sniff 1, 2, 3 y 4" como "Eventos de Estado '. Programa "Salto" como un "punto de sucesos '. Nota: Definicións para estos comportamientos se describen en detalle en otra parte ^11.
         Nota: Eventos de Estado tienen un inicio y de finalización, mientras Point Events simplemente recogen datos de recuento. Las pulsaciones de teclas para cada comportamiento discreto son generados por el software y estas pulsaciones de teclas correspondientes se programan en un teclado secundario (etapa 3.1.2).
      2. Para programar el teclado secundaria, abra el software del teclado, haga clic en el botón apropiado secundaria teclado que se muestra en la pantalla, escriba la combinación de teclas adecuada y haga clic en OK. Una vez que el teclado secundaria se ha programado, cierre el software ya que el programa se ejecute en segundo plano de la computadora.
   2. Una vez que el proyecto se ha creado, utilice el software de registro de comportamiento para anotar el número y duración de las partes posteriores (definidas como las dos patas delanteras de ser colocado en una pared de la arena), cava (definida como dos patas delanteras del ratón madrigueras en la ropa de cama de la arena), la auto-novios (definida como la mOuse lamiendo cualquier región de su propio cuerpo y / o el ratón de tocar cualquier parte de la cara con sus patas delanteras), y saltos (definida como una cría de ratón y luego saltar de manera que los cuatro pies no toquen el suelo al mismo tiempo).
      1. Para marcar un vídeo, vaya a Archivo> Abrir proyecto y, a continuación Observar> Observación> Nuevo. El programa solicita un nombre de archivo. Una vez nombrado, seleccione el archivo multimedia de vídeo apropiado.
      2. Comience el marcador haciendo clic en el botón Iniciar Observación.
         Nota: Al puntuar comportamiento repetitivo ratón, todos los Estado Eventos requieren dos pulsaciones de teclado, la primera corresponde a la iniciación de la conducta y el segundo correspondiente al extremo de la conducta. Point Events sólo requieren sólo presionar una tecla.
   3. Anotar el número de veces que el ratón olfateó cada objeto. Sniffs se definen como cada vez que un ratón se mueve la nariz a menos de 0,5 cm de un objeto. Medir la duración sniff usando software de registro de la conducta de la misma manera que RePetduraciones de comportamiento sitivos se midieron (etapa 3.1.2).
      1. Cada vez que un ratón olfatea un objeto, registrar el número de la posición correspondiente, que dará lugar a una serie de números para el final del período de prueba 10 min (por ejemplo, 1243421 ...). registrar manualmente estos datos.
         Nota: para facilitar la eficiencia y consistencia mientras que anotaba los vídeos, los números corresponden siempre a una posición dada, se opone.
      2. Si un ratón olfatea un objeto, mira hacia otro lado, y luego olfatea el objeto de nuevo, cuente a esa cantidad dos veces.
      3. Una vez que el video completo de 10 minutos ha sido anotado, visualizar los datos haciendo clic en Análisis> Análisis de Comportamiento> Nuevo. Una vez que los datos aparecen en la pantalla, exportar o copiar y pegar en una hoja de cálculo separada.
   4. Registrar la distancia total recorrida el ratón dentro de la arena durante la prueba.
      Nota: El software de seguimiento de vídeo, calibrado para realizar un seguimiento de la prueba ratón y registrar la distancia total movido en centímetros, se utilizópara llevar a cabo este paso. Todos los vídeos anotados por el software de seguimiento de vídeo tenían un notecard de dimensiones conocidas colocadas en la arena en el inicio del vídeo.
      1. Utilice el notecard para calibrar cada vídeo en el software mediante el establecimiento de una línea de calibración a lo largo de cada extremo del notecard e introducir la longitud apropiada dentro de la pantalla de calibración del software. Una vez que se dibujan las líneas, la entrada de la longitud conocida y la anchura del notecard que corresponden a cada línea.
      2. En Configuración de Arena, seleccionar toda la arena.
         Nota: Las áreas separadas de la arena se pueden diferenciar en el software si, por ejemplo, el movimiento del ratón a lo largo de las paredes frente a través del centro era de interés.
      3. Dentro de Configuración de control de prueba, seleccione una duración de diez minutos. En Configuración de detección, elegir un objeto oscuro sobre un fondo claro.
         Nota: Esta tendría que ser cambiado si se estaban utilizando ratones albinos o si el fondo era de un tono más oscuro.
      4. Una vez que los ajustesse han programado, la puntuación de los videos. Haga clic en Adquisición> Abrir Adquisición. En el cuadro Control de Adquisición, haga clic en Nueva prueba y luego Iniciar prueba. Una vez transcurrido diez minutos, el programa se detiene y los datos se puede visualizar.
      5. Haga clic en Analizar> Calcular estadísticas. Una vez que los datos aparecen en la pantalla, exportar o copiar y pegar en una hoja de cálculo separada.

4. Análisis estadísticos, secuenciación

1. Dentro de la serie de números correspondientes a oponerse investigaciones generados por cada ratón, identificar el número total de todas las posibles combinaciones de 3 dígitos, sin números de repetición (por ejemplo 121, 123, 124, pero no 112 o 122).
   Nota: Se utilizó un programa escrito en lenguaje de programación Python para identificar el número de veces que cada posible secuencia aparece en la cadena de números. No es necesario el uso de un programa de exterior, y este paso se pudo completar muchas formas diferentes (por ejemplo, usandouna función en Microsoft Word o Excel Find).
2. Registrar el número de veces que ocurre cada secuencia e identificar las tres secuencias más repetidos para cada ratón.
   Nota: Las secuencias individuales pueden variar por el ratón y la secuencia real es de menos interés que el número de veces que se repite una secuencia (es decir, la adherencia a un patrón es más importante que el patrón de sí mismo).
3. Debido a que el número total de secuencias se repite una ratón se correlacionan positivamente con el nivel de actividad, corregir estos valores dividiendo la cantidad de los patrones más frecuentes por el número total de patrones para cada ratón individual. Esto dará lugar a un índice de repetición de secuencia que es independiente de la actividad general.
4. Comparar el número de veces que cada ratón repite sus secuencias más comunes (corregida para el nivel de actividad) entre los grupos usando un ANOVA apropiado, procedimiento de comparación múltiple (test de Dunnett, por ejemplo) y las pruebas post-hoc.

5. Los análisis estadísticos, Preferencia de objetos

1. Utilizando la misma secuencia de números generados anteriormente (etapa 3.1.3.1), identificar la novela preferencia objeto de cada ratón mediante el recuento del número total de veces que se ha investigado cada objeto, o en otras palabras, contando el número total de 1 seg, 2 sec , 3 seg, y 4 seg en la cadena de datos. Correcta para el nivel de actividad y la compara con la prueba ANOVA como se describió anteriormente (pasos 4.3 a 4.4).
   Nota: Estos métodos publicados por nuestro laboratorio ²² y descritos aquí se basan en gran medida de Pearson et al ^17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Los datos muestran que ^{el 22} representativos C58 hembra / J ratones muestran un mayor número de patrones secuenciales que las otras cepas en la arena redonda (Figura 2, panel A), pero no en la caja rectangular (Figura 2, panel C). Ninguna de las tres cepas masculinos diferían el uno del otro (Figura 2, paneles B y D). Los datos representativos muestran que tanto en ratones C58 / J machos y hembras muestran una preferencia m?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

A continuación, presentamos un ensayo recientemente desarrollado que puede ser útil para la cuantificación de estados de ratón con la validez aparente de orden superior comportamientos repetitivos en los seres humanos. A diferencia de los ensayos más establecidos como el Barnes o T-laberinto, este nuevo ensayo exploración de objetos no requiere ningún tipo de formación del ratón ni es particularmente provocan ansiedad. Además, la novela exploración de objetos no requiere ningún alimento o estímulos sociales...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI