חיפושי אובייקט רומן בתור Assay פוטנציאל התנהגויות חוזרות מסדר גבוה של עכברים

Summary

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

Abstract

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

Introduction

הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) הנה הפרעה נוירו-התפתחותית מורכב משלושה סימפטומי ליבה: לקות חברתית, קשיי תקשורת באמצעות שפה, והתנהגויות בדוגמת חוזרות ^1. מאז שנת 2000, מספר אנשים שאובחנו עם ASD גדל מ 1 ל 150 ל -1 68 בפרק זמן של עשר שנים ^2. למרות השכיחות של ההפרעה ממשיכה לגדול, הגורם להפרעה אינו ידוע עדיין. חלה עלייה ובמאמצים לאיתור מודלים העכבר מתאים הליבה ותסמינים הנלווים של ASD, כמו המודלים האלה יכול להוביל להבנה מוגברת של תסמינים הגורמים הבסיסיים של ASD. ישנם זני עכבר מרובים טהורים שנראים להציג התנהגויות עם תוקף פנים למשך סימפטומי הליבה של ASD, כולל ³ התנהגויות חוזרות.

מוגבל, התנהגויות חוזרות (RRBs) הן סימפטום ליבה של כמה הפרעות פסיכיאטריות כמו ASD.RRBs יכול להגדיל את חומרת ההפרעה ^4, והוא יכול באופן דרסטי לשבש את אורח החיים של אנשים הסובלים. RRBs ממוקמות בדרך כלל לשתי קטגוריות, התנהגויות חוזרות נמוך מסדר, שאצל בני האדם מורכב של פעולות כגון נדנדה נפנוף בידיים; והתנהגויות חוזרות מסדר גבוה, אשר מורכבת של הקפדה על שגרה והתנגדות לשינוי ^5-8.

תחתון-מנת התנהגויות חוזרות נחקרו בהרחבה במכרסמים שם הם להתבטא stereotypies המנוע, אשר ניתן לצפות בקלות המעבדתית ^9. התנהגויות אלו נראה כי תוקפו פנים טוב RRBs בבני אדם, ותוקף מבנה חזק פוטנציאלי כמו גם ^10. בדיקה לנוכחות RRBs מסדר הנמוך ניתן להשלים באמצעות ניטור וידאו של פעילות בעכבר כדי ללמוד את ההתקפים ומשך stereotypies המנוע אלה ^11. התנהגויות חוזרות גבוה כדי להוות אתגר עבור מחדש ביו בסיסילחפש ניצול מכרסם, כמו RRBs אלה אינם כפי שזוהה בקלות דרך התבוננות פשוטה. בשל הקושי בזיהוי התנהגויות אלו, מבחנים הוקמו פחות עבור התנהגות שחוזרת על עצמו מסדר גבוה קיימים. באופן מסורתי, RRBs מסדר גבוה נמדד במכרסמים באמצעות פרדיגמה מבוך שבו חית הבדיקה מאומנת להגיע לכשירות להימלט. מיקום הבריחה אז מופעל ומספר הניסויים נדרשו ללמוד מחדש את מיקום הבריחה נרשם ^12. מבחנים אלו אינם אידיאליים כפי שהם דורשים תקופת הכשרה ארוכה, לעתים קרובות לגרום חרדה, והוא יכול לגרום לתוצאות משתנות מאוד. חקר חור פנסיון שימש גם לכמת-גבוה כדי ^13,14 RRBs. גישה זו אינה דורשת אימונים מורחבים, אבל אין להסתמך על מוטיבצית מזון ו / או אפלית חוש ריח. מבחנים עבור RRBs מסדר גבוה שאינם anxiogenic או דורשים הכשרה תהיה כהשלמה נחמדת הרפרטואר הקיים של exploratio לוח-החור n מבחני מבוססי מבוך כיום בשימוש.

C58 / J (C58) זן העכבר המולד מאוד מדגים רמות גבוהות של התנהגות סטריאוטיפית הקשורים ASD, כלומר חוזר על עצמו, stereotypies מנוע תכלית וכן רמות גבוהות של עצמי טיפוח ^3,11. בנוסף, העכברים C58 להציג RRBs באמצעות רמות גבוהות של גידול, חזרה מרפרף ומפשפש ^11,14,16. זן זה מתחיל להראות התנהגויות אלו מוקדם של התקופה בילוד וממשיך להציג אותם לאורך בגרות. זה יהיה אידיאלי כדי להיות מסוגל לבדוק את הימצאותם של RRBs מסדר גבוה המורם כדי להשלים את RRBs מהסדר הנמוך המתועדת היטב נוכח המתח הזה כמו גם זני עכבר אחרים. את assay חיפושי אובייקט הרומן המתואר כאן מספק ההזדמנות לחוקרים להתבונן מסדר נמוך RRBs מסדר הגבוה בו זמנית, כפי שהוא נותן את היכולת למדוד התנהגויות בדוגמת וכן stereotypies מנוע החוזר.

e_content "> שימוש חיפושי אובייקט רומן בתור assay עבור התנהגויות חוזרות מסדר גבוה פותח על ידי פירסון et al. ^17. הערכה חדשה זו היא רחבה של המבחן בשדה הפתוח והמבוסס ^18-21 בתוספת ארבעה חפצים חדשניים בזירת העכברים. הורשו לחקור אלה אובייקטים מוכרים בחופשיות והמספר וההסדר של חקירות אובייקט היה במעקב. חקירות האובייקט ולאחר מכן נותחו עבור הנוכחות של דפוסים, עם עכברי BTBR מוצגים מספרים גבוהים של חקירות בדוגמת בין האובייקטים. שימוש זה assay, עכברים יכולים להציג התנהגויות חוזרות בדוגמת מסדר גבוה תוך ביטול הצורך ללמוד התנהגויות כמו גם הסרת גירויים מיותרים. חיפושי אובייקט Novel גורם RRBs מסדר גבוה, שכן היא מאפשרת את העכברים כדי ליצור דפוסים טופס רצפים באמצעות כריית מחצבים שלהם . שימוש assay זה מאפשר לחוקר לכמת את הנוכחות של אלה RRBs מסדר גבוה.

פירסון et al. ופתח assay זה השתמש בו כדי לבדוק את הימצאותם של התנהגויות חוזרות כדי פוטנציאל גבוה ב זן העכבר המולד BTBR, עם תוצאות מסקרן ^17. פרסמנו לאחרונה מחקר מעקב מסתכל על ההתנהגויות של C58, C57BL / 6J (C57) ו FVB / NJ (FVB) זנים, כמו גם חקירה מפורטת יותר לתוך משתנים מבלבלים פוטנציאל נוכחית assay זה, ואפשרי גישות סטטיסטיות לניתוח הנתונים המופקים ^22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת רדלנדס. C58, C57, ועכברים FVB שימוש במחקרים אלה גידלו בבית ביבר אוניברסיטת רדלנדס ממלאי שהושג במקור ממעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME). זקיפים מן ביבר זה הוקרנו מדי שישה חודשים ונמצא כי הפתוגן ללא.

1. ציוד חדר הגדרה

הערה: השתמשנו בשתי זירות שונות לבדיקה אובייקט הרומן: כלוב מלבני פלסטיק שקוף (45 ס"מ x 24 ס"מ x 20 ס"מ) או כלוב עגול אטום עם קוטר הבסיס של 41 ס"מ; עם זאת, כל כלוב עשוי לשמש. פירסון et al. השתמשו כלוב מלבני קטן (20 ס"מ x 30 ס"מ x 20 ס"מ) ב assay שלהם. פרטים מעיצוב הניסוי הספציפי הזה כלולים להלן, אבל בהתחשב החידוש של assay זה, אין סטנדרטים מקובלים בתחום של phenotyping התנהגותיים לכל המשתנים שתוארו.

1. מילוי בזירת הבדיקות עם כ ½ ב מצעי תירס.
2. בחר ארבעה חפצים רומן שונים. בחר ארבעה חפץ כי הם בערך באותו הגודל, בנוי מפלסטיק בצפיפות גבוה כדי להקל על ניקוי ולהתנגד לעיסה שונה זה מזה בצורה ובצבע. חשוב לציין, להבטיח כי עכברי בדיקה אינם נחשפים לאובייקטים הללו עד מתנהלים ב assay.
   הערה: לדוגמה, לבנת צעצוע ורודה, קוף אדום, אריח לבנות בכתב כחול קובייה לבנה רגילה שמשו כאן.
3. בזירה המלבנית, למקם אובייקטים אלה כ 3 סנטימטרים מהזוויות. בזירה העגולה, מקום האובייקטים כזה שהם נמצאים במרחקים שווים זה מזה כ -10 סנטימטרים מן הצדדים. רשום את המיקום של כל אובייקט כמספר שונה, 1-4 (איור 1). ודא כי העצמים ממוקמים בסדר אקראי או מתאזן לאורך הבדיקה.
4. מקם מצלמה ישירות מעל הבדיקותבזירה להקליט בזירה כולה בתקופות ההסתגלות ולבדוק.
   הערה: לאחר החוקרים באותו חדר עם העכברים יכולים להשפיע באופן פוטנציאלי פעילות רמות וחקירה במהלך בדיקה.

2. אובייקט Novel מבחן לחקירה

1. מבחן בתחילת מחזור האור בחדר מואר עם תאורת פלורסנט בכ 100 לוקס. ודא כי התאורה היא אחידה על פני זירת הבדיקות לתקנן מראה בזמן הקלטת וידאו.
2. מניח notecard של ממדים ידועים בחלקו התחתון של זירת הבדיקות ולהתחיל הקלטת וידאו.
3. מעביר את עכבר המבחן לזירת בדיקות ריקה במשך 10 דקות כדי לשמש תקופת הסתגלות. שיא וידאו האיקלום.
4. לאחר תקופת ההסתגלות, לעזוב את העכבר בזירה, להוסיף במהירות ארבעת אובייקטי הרומן לזירת הבדיקה ולהקליט את התנהגות העכבר עבור 10 דקות נוספות.
5. לאחר 20 דקות ההסתגלות / בדיקות PE המלאל-ם שחלף, להחזיר את העכבר מבחן בכלוב בבית שלה ולנקות ביסודיות ולייבש את האובייקטים הרומן בזירה בדיקות עם סבון כלים unscented ומים.

3. ניקוד וידאו

1. השלם את כל ניקוד התנהגות משתמשים בוידאו כדי להקל ואמינות.
   הערה: תוכנת רישום התנהגותי Noldus אובזרוור בה שימוש כדי לבצע את הצעדים ²² כפי שמתואר כאן, אבל תוכנית מיוחדת אין צורך:
   1. לפני הבקיע את הווידאו הראשון, להגדיר את פרויקט קידוד ערכה בתוכנת הרישום התנהגותית על ידי יצירת פרויקט חדש או על ידי העריכה קיים, פרויקט דומה.
      1. בתוך תיבת הגדרת הפרויקט, להגדיר רכישת נתונים כדי "מנותק תצפית." בתוך התיבה Coding התנהגות, תוכנית "שבץ נא", "חופר", "נבעתים", "טיפוח" ו "אובייקט לרחרח 1, 2, 3 ו -4" כמו "אירועים המדינה. תוכנית "קפיצות" בתור 'אירוע פוינט'. הערה: הגדרהים להתנהגויות אלו מתוארים בפירוט במקום אחר ^11.
         הערה: יש אירועים המדינה התחלה לעצור את הזמן, ואילו נקודת אירועים פשוט לאסוף נתונים הספירה. ההקשות לכל התנהגות דיסקרטית מופקות על ידי התוכנה וקשה המקבילים אלה מתוכנתים למקלדת משנית (שלב 3.1.2).
      2. כדי לתכנת את המקלדת המשנית, פתח את תוכנת לוח מקשים, לחץ על הכפתור במקלדת משני המתאים מוצג על המסך, הקלד את השילוב הקשה המתאים, ולחץ על אישור. לאחר המקלדת משני כבר מתוכנת, לסגור את התוכנה כתכנית תפעל ברקע של המחשב.
   2. לאחר הפרויקט הוגדר, להשתמש בתוכנה רישום התנהגותי להבקיע מספר ומשך מתנשא (המוגדר שתי כפותיה הקדמיות שיוצבו על קיר של הזירה), חופר (מוגדרת כשני רגליו הקדמיות של העכבר התחפרות את המצעים של הזירה), חתנים עצמיים (מוגדר כשינוי מOuse מלקק בכל אזור של גוף עצמם ו / או העכבר לגעת בכל חלק של הפנים עם רגליו הקדמיות שלהם), וקופץ (מוגדר גידול עכבר ולאחר מכן קופץ, כך שכל ארבע הרגליים אינן נוגעות בקרקע בעת ובעונה אחת).
      1. כדי להבקיע וידאו, ללכת קובץ> פרויקט Open ואז צייה> תצפית> חדשה. התכנית תבקש שם קובץ. ברגע בשם, בחר את קובץ מדיה כרטיסי מסך המתאים.
      2. התחל את הניקוד על ידי לחיצה על הכפתור בגין התצפית.
         הערה: כאשר בקיע עכבר התנהגות שחוזרת על עצמו, כל אירועי המדינה דורשים שתי קשות, הראשון מתאים החניכה של ההתנהגות והשני מתאים סוף ההתנהגות. אירועים פוינט רק דורשים אחת קשה.
   3. ציון מספר הפעמים העכבר רחרח כל אובייקט. מרחרח מוגדר בכל עת עכבר נע האף שלה בתוך 0.5 סנטימטר של אובייקט. מדוד משך לרחרח באמצעות תוכנת רישום התנהגותי באותו אופן כי repetמשכי התנהגות itive נמדדו (שלב 3.1.2).
      1. בכל פעם עכבר מרחרח אובייקט, לרשום את המספר לדרגה המקביל, אשר יוביל מחרוזת של מספרים עד סוף תקופת הבדיקה 10 דקות (למשל 1,243,421 ...). ידני להקליט נתונים אלה.
         הערה: כדי להקל על יעילות ועקבית ואילו סרטונים בקיעים, המספרים תמיד מתאימים עבור מיקום נתון, לא להתנגד.
      2. אם עכבר מרחרח אובייקט, מסיטה את מבטה, ואז מרחרחת את האובייקט שוב, לספור את המספר הזה פעמיים.
      3. לאחר וידאו 10 דקות המלאות כבר בקיע, להמחיש את הנתונים על ידי לחיצה על לנתח> ניתוח התנהגות> חדש. לאחר הנתונים מופיעים על המסך, לייצא או להעתיק ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני נפרד.
   4. רשמו את המרחק הכולל העכבר נסע בתוך הזירה במהלך הבדיקה.
      הערה: תוכנת מעקב וידאו, מכויל כדי לעקוב אחר העכבר הבדיקה ולהקליט את המרחק הכולל עבר בסנטימטרים, שימשכדי לבצע שלב זה. כל הסרטונים בקיע על ידי תוכנת מעקב וידאו היה notecard של ממדים ידועים להציב בזירה בתחילת הסרטון.
      1. השתמש notecard לכייל כל וידאו בתוך התוכנה על ידי קביעת קו כיול לאורך כל סוף notecard המזינים באורך המתאים בתוך מסך הכיול של התוכנה. לאחר הקווים נמשכים, קלט את האורך והרוחב הידועים של notecard מתאים בכל שורה.
      2. בתוך הגדרות Arena, בחר בזירה כולה.
         הערה: אזורים נפרדים של הזירה יכול להיות מובחן בתוכנה אם, למשל, תנועת העכבר לאורך הקירות לעומת דרך מרכז עיניינה.
      3. בתוך הגדרות בקרת ניסיון, בחר משך עשר דקות. תחת הגדרות איתור, לבחור אובייקט כהה על רקע בהיר.
         הערה: זה היה צריך להיות שונה אם עכברים לבקנים היו בשימוש או אם הרקע היה גוון כהה יותר.
      4. לאחר ההגדרותכבר מתוכן, להבקיע את הסרטונים. לחץ רכישה> להרחיב רכישה. בתיבת הדו בקרת הרכישה, לחץ על חדש ניסיון ולאחר מכן התחיל לנסות. אחרי עשר דקות שחלף, התכנית מפסיקה ואת ניתן דמיינו הנתונים.
      5. לחץ לנתח> סטטיסטיקת חישוב. לאחר הנתונים מופיעים על המסך, לייצא או להעתיק ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני נפרד.

4. ניתוח סטטיסטי, סידור

1. בתוך המחרוזת של מספרים שקשורים להתנגד חקירות שנוצרו על ידי כל עכבר, לזהות את המספר הכולל של כל שילובי 3 ספרות האפשריות בלי מספרים חוזרים (למשל 121, 123, 124 אבל לא 112 או 122).
   הערה: התוכנית כתובה בשפת התכנות Python שימש לזיהוי מספר הפעמים כל רצף אפשרי מופיע במחרוזת של מספרים. אין צורך להשתמש בתכנית בחוץ, שלב זה יכול להסתיים בדרכים רבות ושונות (למשל באמצעות 'מצא פונקציה ב- Microsoft Word או Excel).
2. רשום את מספר פעמים כל רצף מתרחשת ולזהות שלושה רצפים חוזרים לרוב עבור כל עכבר.
   הערה: רצפי פרט ישתנו לפי עכבר ואת הרצף בפועל הוא עניין פחות מהמספר פעמי רצף חזר על עצמו (כלומר דבקות דפוס חשובות יותר את הדוגמא עוצמה).
3. בגלל המספר הכולל של רצפי חזרות עכבר יהיה לתאם חיובית לרמת פעילות, לתקן ערכים אלה על ידי חלוקת הכמות של דפוסי השכיח ביותר במספר הכולל של דפוסים עבור כל עכבר בודד. זו תניב אינדקס חוזרים רצף שאינו תלוי בפעילות הכוללת.
4. השווה את מספר פעמים כל עכבר חוזר רצפים הנפוצים ביותר שלה (לאחר תיקון רמת פעילות) בין קבוצות באמצעות ANOVA מתאים, הליך השוואה מרובה (מבחן של Dunnett, עבור למשל) ובדיקות פוסט-הוק.

> 5. ניתוחים סטטיסטיים, העדפות אובייקט

1. באמצעות שורה של אותם מספרים שנוצר לעיל (שלב 3.1.3.1), לזהות את העדפה אובייקט הרומן של כל עכבר על ידי ספירת מספר הפעמים הכולל כל אובייקט נחקר, או במילים אחרות, לספור את המספר הכולל של 1 שניות, 2 שניות שניות, 3, ו -4 שניות במחרוזת של נתונים. נכון עבור רמת הפעילות ולהשוות באמצעות ANOVA כמתואר לעיל (שלבים 4.3-4.4).
   הערה: אלו שיטות בהוצאה במעבדה שלנו ²² ו המתואר כאן מבוססות במידה רבה על פירסון et al ^17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מופע ²² הנתונים נציג כי נקבת C58 / עכברי J מוצגים מספר גבוה יותר של דפוסי רצף מאשר הזנים האחרים בזירה העגולה (איור 2, פנל), אבל לא בזירה המלבנית (איור 2, לוח ג). אף לא אחד משלושת זני זכר היו שונות זו מזו (איור 2, לוחות B ו- D). הנתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים assay שפותח לאחרונה כי עשוי להיות שימושיים לכימותי התנהגויות עכבר עם תוקף פנים למשך התנהגויות חוזרות מסדר גבוה בבני אדם. בניגוד מבחנים מבוססים יותר כמו בארנס או T-המבוך, assay חיפושי אובייקט הרומן הזה אינו דורש שום הכשרת עכבר וגם לא במיוחד חרדה להתגרות. בנו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI