Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

Resumen

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Resumen

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introducción

El estudio de los tejidos, órganos o sistemas in vitro es un intento de simplificar las muy complejas relaciones existentes entre los varios subtipos celulares que comprenden organismos multicelulares. De hecho, los estudios in vitro hacen posible adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Hay dos ventajas principales de la realización de los experimentos in vitro: 1) la reducción de las interacciones celulares, y 2) la capacidad de manipular fácilmente el entorno celular. Científicos Por lo tanto, estas dos ventajas han permitido a predecir el comportamiento de determinados tipos de células in vivo, dando lugar a la capacidad de regular los resultados de las influencias extrínsecas en organismos completos. En ese sentido, el cultivo in vitro de células de frecuencia funciona como un puente que conecta las ciencias básicas y aplicadas de vida. No obstante, hay también varias desventajas de trabajar in vitro, el más importante siendo que una determinada reserva habite en el fisiológicaal pertinencia de fenotipos observados. De hecho, cuando un solo tipo de células se cultiva en un recipiente, la cultura pierde, en diversa medida, sus conexiones célula-célula con otros tipos de células, su contribución al medio ambiente humoral del tejido y el organismo de origen, y las anclas dentro el tejido que le permitió mantener una estructura tridimensional determinada veces crucial para la función celular.

La cuestión de relaciones célula-célula ha sido abordado por el desarrollo de técnicas de cultivo mixto. En este método, dos o más poblaciones de células se cultivan conjuntamente en el mismo recipiente de cultivo. Sin embargo, estos cultivos mixtos tienen inconvenientes importantes. Por un lado, algunos subtipos de células no interactúan físicamente con otros en el tejido de origen y se basan únicamente en las comunicaciones paracrinos sufridas por factores solubles secretadas y los receptores cercanos. Este es el caso para varios procesos inflamatorios que dependen de la señalización de citoquinas proximal. En c mixtaultures, interacciones físicas son inevitables y hacen imposible el estudio de las comunicaciones paracrinos en la ausencia de contactos célula-célula que puede producir resultados alterados. Por otra parte, la consecución de las interpretaciones de células específicas dentro de una población mixta se vuelve inviable sin el uso de técnicas de separación duras que podrían afectar significativamente los resultados.

Para resolver estos problemas importantes, el uso de medios acondicionados se ha desarrollado como una técnica que permite a las culturas compartimentados y el estudio de señalización paracrina. Este método requiere la transferencia del sobrenadante de un tipo de célula, media llamada así acondicionado, a los pocillos que contienen otra población de células. Sin embargo, una desventaja importante es que las moléculas de vida corta no sobreviven el tiempo suficiente en el medio condicionado para ser transferidos a los pocillos de la segunda población de células. Incluso moléculas de larga vida se diluirán en gran medida con el tiempo debido a la difusión. Además, tanto celularpoblaciones sólo participan en la comunicación paracrina unidireccional en lugar de en la comunicación bidireccional activo. Esto conduce a la ausencia de señalización de realimentación que es de vital importancia en la recreación de las relaciones multicelulares precisos tal como existen en vivo.

Como consecuencia de ello y conducido por la necesidad de simular mejor el original en condiciones in vivo en el entorno celular in vitro, varios avances en técnicas de cultivo celular se han alcanzado en los últimos años. Uno de los avances más importantes ha sido el uso de soportes permeables con membranas microporosas para compartimentar cultivos de células, que se utilizan por primera vez por Grobstein en 1953 ^1. Tales soportes permeables se han adaptado durante los años para dar cabida a numerosos tipos de células y para ser utilizado en varias aplicaciones diferentes. Hoy en día, estos soportes existen insertos como huecos que están diseñados para descansar en los pozos de una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos o en circuplatos lar. En un sistema de co-cultivo, el inserto contiene un tipo de célula, mientras que el pozo o plato contiene la otra población celular, lo que permite el estudio de la contribución de las dos poblaciones diferentes de células en su entorno humoral (Figura 1). Como resultado, la polaridad celular (basolateral vs secreción apical o recepción de la señal) se conserva, lo que confiere sistemas de inserción de co-cultivo una ventaja importante sobre cultivos mixtos y técnicas de medio acondicionado. Existen varios tipos de materiales de membrana están disponibles, los más comunes son de poliéster (PET), policarbonato (PC) o colágeno recubierto de politetrafluoroetileno (PTFE), y existen en diferentes tamaños de poro que van de 0,4 micras a 12,0 micras. Estas variedades de materiales y tamaños de poro ofrecen un espectro de insertos que ejercen funciones variables relevantes a las propiedades ópticas, espesor de la membrana celular y la adhesión que los hacen práctica a diferentes niveles para los siguientes usos no se limitan a:
-estudiandola diferenciación celular, el desarrollo embrionario, la metástasis tumoral y la reparación de heridas mediante ensayos quimiotácticas a través de membranas permeables;
-Evaluar la penetración del fármaco mediante la evaluación de su transporte a través de monocapas epiteliales o endoteliales cultivadas en soportes permeables, y;
-Realizar de células co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula.

El propósito de este artículo es describir las pautas metodológicas generales para cumplir con la tercera función se ha indicado anteriormente, que consiste en evaluar los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. Varios campos diferentes de investigación hacen uso de los sistemas de inserción de co-cultivo con el fin de responder a las preguntas relacionadas con el efecto de factores solubles secretadas en las poblaciones de células. De hecho, la señalización paracrina que modula el comportamiento celular en varios niveles es pertinente en todos los tejidosy sistemas, lo que hace que los sistemas de co-cultivo de inserción indispensable para garantizar los avances en estos campos. Por el contrario, el uso de insertos puede confirmar que la transducción de señales es por contacto directo célula-célula y no por factores secretados. Uno de los usos más importantes de inserciones en los estudios es la inflamación ^2-14, donde se evalúa el efecto de las citoquinas secretadas en varios jugadores celulares de la inmunidad. En particular, el estudio de la inflamación en el sistema nervioso central (SNC) se ha beneficiado enormemente de los estudios de inserción de co-cultivo, que han permitido a definir mejor las funciones paracrinas distintos de neuronas y la microglia en la conducción de la neuroinflamación ^15-21. Estos sistemas también se diseñaron para estudiar el potencial anti-inflamatorio de moléculas que se basa en su capacidad para reducir o inhibir la secreción de factores pro-inflamatorias ^22-26. Investigaciones relacionadas con el cáncer de ^{27 a 31,} en ​​particular, los mecanismos de la angiogénesis ^32-34 y inflammati subyacenteen ^35-42 en la tumorigénesis, también se beneficia de los sistemas de inserción de co-cultivo. Por otra parte, los factores solubles son de gran importancia en los procesos que conducen a la diferenciación y varios estudios han utilizado inserciones para responder preguntas en ese campo en particular ^43-50. En el SNC, ya que el tejido neural tiene un potencial de renovación muy limitado, el estudio de neurotrophism y neuroprotección es fundamental y ha sido ampliamente asegurada por el uso de células madre en los sistemas de co-cultivo de ^51-56. Además, las inserciones también se utilizan en campos tan diversos como la nefrología ^57,58, interacciones endoteliales y la angiogénesis ^{59-62, 63-65} apoptosis de señalización, la inflamación en la obesidad y el síndrome metabólico ^22,23,66-67, oído interno de protección de las células ciliadas ^68,69, e incluso en la virulencia de hongos ^70,71 y ^72,73 parasitología.

En este artículo se ofrece pautas metodológicas generales con el fin de establecer un experiment a la vista de la evaluación de los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. En particular, nos centraremos nuestra atención en las células nerviosas co-cultivos y sus usos en el estudio de procesos neuroinflammatory. Dado el amplio espectro de los experimentos que se inserta hacer posible proyectos piloto, es insoportable para cubrir todos los aspectos de esta técnica de cultivo celular. A modo de ejemplo, un protocolo específico para medir los efectos de las citoquinas secretadas por lipopolisacárido (LPS), activado microglia N9 en las células PC12 neuronales se detallará, que ofrece una comprensión concreta de la metodología de inserción de co-cultivo.

Protocolo

Nota: Cada uno de los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar como se requiere para el cultivo de células de mamíferos. Además, las directrices generales para el cultivo celular estéril óptima se aplican, por ejemplo., Descartando consejos en cualquier momento que pueden dar lugar a la contaminación cruzada, lo que reduce la cantidad de células momento en que se expone al aire cuando se realizan cambios en los medios enteros, adecuadamente, pero con cuidado sin dejar de remover Las suspensiones de células para asegurar su pipeteo homogénea, etc. Por otra parte, las inserciones son un tipo de material de plástico que requieren un manejo especial. En primer lugar, cada vez que se manipulan inserciones, evite tocar la membrana frágil, que desgarra con facilidad y por lo tanto podría poner en peligro el experimento. Además, no es adecuado para llevar a cabo la aspiración por vacío del medio de cultivo celular, ya que hay un riesgo de perforar la membrana o disociar células adherentes. A continuación, los insertos cuelgan libremente en la placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos y, así, se debe tener precaución cuando moving el material de plástico o al pipetear para evitar disociar células adherentes. Además, al usar insertos con grandes tamaños de poro, hay una posibilidad de que el medio de cultivo celular se filtra a través de la membrana y, por lo tanto, es importante controlar frecuentemente el nivel de líquido. Por último, tenga en cuenta que el siguiente protocolo está diseñado para las células adherentes y no requiere modificaciones menores con el fin de ser adecuado para las células en suspensión.

1. Las pautas generales para la realización de inserción experimentos de co-cultivo

1. Siembra tipo de célula # 1 en insertos
   1. Desenvolver los insertos de sus envases.
   2. Coloque los insertos en una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos vacíos de la dimensión adecuada. Para ello, agarre el borde superior de la pieza de inserción con unas pinzas.
   3. Para mejorar la unión y propagación de las células adherentes, acondicionar los insertos con medio de cultivo celular antes de la siembra. Para ello, cubrir toda la superficie de la membrana con mediu cultivo celularM utilizando una micropipeta.
      NOTA: Haga esto por el mayor número de inserciones según sea necesario.
   4. Vuelva a colocar la tapa sobre la placa y se incuba durante al menos 1 hora u O / N en las mismas condiciones (por lo general 37 ° C, 5-10% de _CO2).
   5. Cuando están condicionados los insertos, eliminar todo el medio de cultivo celular utilizando una micropipeta. Descartar el medio utilizado.
   6. tipo de células semilla # 1 en fresco medio de cultivo celular de la misma manera como en una placa de múltiples pocillos. Para ello, extraer un volumen apropiado de la suspensión celular con una micropipeta y dispensar el líquido en el inserto.
      NOTA: Preparar el mayor número de inserciones según sea necesario.
   7. Después de sembrar todas las inserciones, mueva suavemente la placa de la izquierda y la derecha, luego hacia atrás y adelante con el fin de distribuir uniformemente las células. Evitar hacer movimientos circulares, ya que esto hará que las células se acumulan en el centro de los insertos.
   8. Coloque la tapa en la placa e incubar según lo especificado por según los requisitos celulares (por lo general 37 ° C, 5 a 10% de CO _2).
2. Siembra tipo de célula # 2 en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos
   1. tipo de célula semilla # 2 en el medio de cultivo de células frescas de acuerdo con la Sección 1.
   2. Preparar como muchos pozos como se requiere para el número de inserciones. Roca la placa como en el paso 1.1.7) para asegurar que las células se distribuyen uniformemente en los pocillos.
   3. Coloque la tapa en la placa e incubar en las mismas condiciones (por lo general 37 ° C, 5 a 10% de CO _2).
3. refrescante en medio de inserciones
   1. Usando una micropipeta, retirar parte o todo el medio de cultivo celular, en los insertos que contienen el tipo de célula # 1. Descartar el medio utilizado.
   2. Dibuje un volumen apropiado de medio de cultivo celular fresco. descansar suavemente la punta en la pared interior del inserto y lentamente dispensar el medio de cultivo celular.
   3. Coloque la tapa en la placa y se incuba como en la etapa 1.1.4.
4. medio refrescante en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos
   1. El uso de un MICROPIpette, extraer parte o todo el medio de cultivo celular en los pocillos que contienen el tipo de célula # 2. Descartar el medio utilizado.
   2. Dibuje un volumen apropiado de medio de cultivo celular fresco. Resto de la punta en la pared interior del pozo y lentamente dispensar el medio de cultivo celular.
   3. Coloque la tapa en la placa e incubar según los protocolos de cultivo de células previamente establecidos.
5. La transferencia de insertos que contienen tipo de célula # 1 a las placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos que contienen el tipo de célula # 2.
   NOTA: Realice este paso cuando ambos tipos de células han alcanzado la etapa de crecimiento apropiado.
   1. Antes de transferir los insertos en los pozos, hacer los cambios necesarios medianas, como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.3) y 1.4).
      NOTA: En este punto, es importante para dispensar los volúmenes apropiados de medios de comunicación en ambos compartimentos como se especifica en las instrucciones del fabricante de inserción.
   2. Con unas pinzas, agarre el borde superior de un inserto que contiene células Type # 1 y suavemente lo coloca en el pocillo apropiado que contiene el tipo de célula # 2.
   3. Después de transferir todas las inserciones, comprobar la presencia de burbujas de aire debajo de la membrana de las inserciones.
      NOTA: Las burbujas de aire previenen cualquier intercambio a través de la membrana de la inserción y pueden poner en peligro todo el experimento.
   4. Si hay burbujas de aire, levante suavemente el inserto del pozo utilizando pinzas y sumergirse de nuevo en el medio de cultivo celular. Las burbujas desaparecerán. Si todavía están presentes, trate con suavidad sumergir insertos de nuevo en el medio de cultivo celular en un ángulo.
      NOTA: No golpee o revolver insertos no disociar las células adherentes.
   5. Después de la eliminación de todas las burbujas de aire y comprobar que los volúmenes de los medios de comunicación en ambos compartimentos, coloque la tapa en la placa e incubar.
6. medios refrescantes en un sistema de co-cultivo
   NOTA: A pesar de que la membrana permite fácilmente el intercambio de medios entre el inserto y bien y es descanso del medio se realiza enambos compartimentos desde el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio en los compartimentos superior e inferior por difusión por sí solo puede ser bastante largo.
   1. medio refrescante en insertos que contienen el tipo de célula # 1 se realiza de la misma manera que en el paso 1.3).
   2. Para refrescar en los pozos que contienen el tipo de célula # 2 medianas, deslice suavemente el inserto hacia un lado para crear un espacio lo suficientemente amplia como para dar cabida a una punta de pipeta. Refrescar el medio como en el paso 1.4).
   3. Verificar la presencia de burbujas de aire y verificar los volúmenes como por pasos 1.5.3) a través 1.5.5).

2. Ejemplo: la medición de los efectos de las citoquinas secretadas por microglia N9 activados por LPS en las células PC12 neuronales

NOTA: Los siguientes pasos están diseñados para matraz específica, bien y platos de distintos tamaños. Sin embargo, el protocolo se puede personalizar para cualquier dimensión plasticware. Para los medios de comunicación y la composición ver Tabla de Materiales.

1. Siembra y diferenciación de las células PC12 en múltiplesy placas de cultivo de tejidos
   1. medio de cultivo celular PC12 rutina de calentamiento, PC12 medio de diferenciación y tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C.
   2. Usar las células PC12 a 60-80% de confluencia de un 75 cm ² matraz.
   3. Con un 15 mm pipeta Pasteur, lleve a cabo la aspiración por vacío de la totalidad del medio de cultivo celular en el matraz.
   4. Enjuague suavemente la monocapa de células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril y eliminar el líquido con una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de no disociar las células en este paso.
   5. Cubrir la monocapa de células con 3 ml de tripsina-EDTA y se incuba durante 2 a 3 min a 37 ° C.
   6. Asegúrese de que todas las células se separan con un microscopio. Si muy pocas células están flotando, se incuba durante un período más largo para un máximo de 5 minutos.
   7. Añadir 10 ml de medio de cultivo celular PC12 de rutina con el fin de inactivar la tripsina-EDTA.
   8. Con una pipeta de 10 ml, se tritura suavemente mientras se asegura de que la mayoría de las células se disocian de la parte inferior of matraz. Evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión celular.
   9. Con la misma pipeta de 10 ml, la transferencia de la suspensión celular en un tubo de centrifugación de 50 ml.
   10. Centrifugar durante 1 min a 3.200 xg
   11. Descartar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
   12. Añadir 10 ml de medio de cultivo celular PC12 rutina con una pipeta de 10 ml.
       NOTA: Este volumen se puede ajustar si la pastilla es inusualmente grande o pequeña.
   13. Se tritura con la misma pipeta de 10 ml para homogeneizar el sedimento. Las células PC12 a menudo se agrupan por lo que al menos el 20 pipeteando arriba y downare necesario.
       NOTA: Mientras trituración vigorosa es necesario, evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión celular.
   14. En un tubo de 1,5 ml, preparar una dilución apropiada de la suspensión de células en azul de tripano. Contar las células utilizando un hemocitómetro de acuerdo a protocolos previamente establecidos ^74.
   15. En un tubo separado 50 ml, dividir la suspensión celularcon medio de diferenciación PC12 para obtener una adecuada suspensión celular diluida para la siembra de los pozos de una placa de 24 pocillos (30.000 ¢ / cm ^2, 0,6 ml por pocillo de acuerdo con el protocolo del fabricante).
       NOTA: La placa de 24 pocillos debe ser recubierto previamente con colágeno tal como se especifica por los protocolos previamente establecidos ^75.
   16. Distribuir 0,6 ml de la suspensión celular por pocillo usando una micropipeta.
   17. Cuando todos los pozos son cabeza de serie, el rock de la placa como en el paso 1.1.7).
   18. Para permitir la adecuada diferenciación de las células PC12, incubar las placas de 24 pocillos durante 7-9 días a 37 ° C en una atmósfera húmeda al 5% de CO ₂ en la PC12 medio de diferenciación ^15,16 antes de realizar experimentos de co-cultivo.
   19. Realizar cambios de medio cada dos días mediante la eliminación de la mitad del líquido y su sustitución por un volumen igual de medio de diferenciación PC12 fresco.
2. Siembra microglia N9 en los insertos y el tratamiento con LPS
   1. Un día antes de realizar los experimentos de co-cultivo, pre-tratamiento de PTFE de 0,4 micras de poro insertos con medio de cultivo celular N9 rutina para optimizar la adherencia de las células, siguiendo los pasos 1.1.1) a través de 1.1.4)
   2. medio caliente rutina N9 cultivo celular y la tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C.
   3. Mientras tanto, un peso aproximado de 10 mg de LPS en un tubo de 1.5 ml para su uso posterior.
      NOTA: Dado que la endotoxina LPS es un pro-inflamatoria potente y exigen especiales precauciones de seguridad, gafas, guantes y un respirador de partículas se recomienda encarecidamente.
   4. Utilice células N9 a 80-90% de confluencia de un 75 cm ² matraz.
   5. Siga los pasos 2.1.3) a 2.1.14). Siempre use medio de cultivo celular N9 rutina en lugar de medio de cultivo celular PC12 de rutina. También tenga en cuenta que la microglia N9 no se aglutinan tanto como lo hacen las células PC12, por lo menos la pipeta hacia arriba y hacia abajo pueden ser necesarios en el paso 2.1.13).
   6. En un tubo separado 50 ml, dividir la suspensión de células con medio de cultivo celular N9 a obtain una suspensión celular diluida adecuada para la siembra de insertos diseñados para sostener en placas de 24 pocillos (60.000 ¢ / cm ^2, 0,05 ml por inserción de acuerdo con el protocolo del fabricante, para el área de superficie de la membrana ver información del fabricante).
      NOTA: Estos insertos ya están recubiertas con colágeno por el fabricante y están optimizados para la adhesión celular.
   7. Distribuir 0,05 ml de la suspensión celular por inserción utilizando una micropipeta.
   8. Cuando todas las inserciones son cabeza de serie, el rock de la placa como en el paso 1.1.7).
   9. Realizar diluciones en serie de LPS utilizando medio de tratamiento N9 para obtener 4 g / ml, 2 mg / ml y las soluciones de trabajo 1 g / ml.
   10. Pipetear 0,05 ml de la solución de 4 mg / ml de trabajo en un conjunto de insertos a fin de producir una dilución final de 2 mg / ml.
   11. Repita el paso 2.2.10) para las otras dos soluciones de trabajo en diferentes conjuntos de inserciones, produciendo una dilución final de 1 mg / ml y 0,5 mg / ml, respectivamente.
   12. EnCubate las placas que contienen los insertos de 24 horas a 37 ° C en una atmósfera húmeda de CO ₂ al 5% para permitir la activación de microglia N9 con LPS antes de realizar los experimentos de co-cultivo.
3. Co-cultivo de células PC12 neuronales con microglia N9
   1. En 7-9 días de diferenciación de las células PC12, activar la microglia N9 después de 24 horas de incubación con LPS por medio de tratamiento caliente N9 y medio de tratamiento PC12 en un baño de agua a 37 ° C.
   2. Realizar un cambio de medio total de la microglia N9 como en el paso 1.3), la sustitución de todo el medio utilizado por 0,1 ml de medio de tratamiento N9. Haga esto para cada insert.This es necesario eliminar todos los rastros de LPS, dejando solamente la microglia N9 activados en los insertos.
   3. Realizar un cambio de medio total de células PC12 neuronales como en el paso 1.4). La transferencia de las inserciones en las placas de 24 pocillos como en el paso 1.5) .Incubate los N9-PC12 co-cultivos durante 24 horas o de 48 horas a 37 ° C en una atmósfera de _CO2 al 5% húmedo.
   4. después de 24hr o 48 hr, recoger el sobrenadante y / o las células de la citotoxicidad, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western blot, u otros ensayos.

Resultados

El uso de sistemas de co-cultivo de inserción es particularmente pertinente en el estudio de los procesos neuroinflammatory que muestran las relaciones entre los diferentes actores paracrinos celulares del sistema nervioso central. Inmunidad en el SNC se logra principalmente por células residentes microgliales, que supervisan su entorno en su estado de reposo ramificada (Figura 2A) y son capaces de alteraciones de percepción que pudiera molestar al homeostasis muy val...

Discusión

El paso más crítico de cualquier sistema de inserción experimento de co-cultivo realidad habita en la elección de la inserción correcta de usar. El tamaño de poro y material de la membrana se deben tener en cuenta a fondo, sin olvidar a considerar el tipo de células que se sembraron y el propósito del experimento. Por ejemplo, los ensayos de quimiotácticas pueden utilizar el mismo tipo de membrana de células que co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum