Développement d'un système d'insertion Co-culture de deux types cellulaires en l'absence de Cell-Cell Contactez

Résumé

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Résumé

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introduction

L'étude des tissus, des organes ou des systèmes in vitro est un essai de simplifier les relations complexes qui existent entre les sous - types cellulaires différents qui comprennent des organismes multicellulaires. En effet, des études in vitro permettent d'acquérir une compréhension détaillée des populations de cellules isolées. Il y a deux principaux avantages de la conduite des expériences in vitro: 1) réduit les interactions cellulaires, et 2) la capacité de manipuler facilement l'environnement cellulaire. Par conséquent, ces deux avantages ont permis aux scientifiques de prédire le comportement des types cellulaires spécifiques in vivo, conduisant à la capacité de réguler les résultats des influences extrinsèques dans des organismes entiers. En ce sens, la culture in vitro de cellules dans fonctionne souvent comme un pont reliant les sciences fondamentales et appliquées vie. Néanmoins, il y a aussi plusieurs inconvénients du travail in vitro, le plus important étant qu'une certaine réserve peut demeurer dans le physiologiqueal pertinence des phénotypes observés. En effet, quand un seul type de cellule est cultivée dans un récipient, la culture perd, à des degrés divers, ses connexions cellule-cellule avec d'autres types de cellules, sa contribution à l'environnement humorale du tissu et de l'organisme d'origine, et les ancres au sein le tissu qui lui a permis de faire respecter une structure tridimensionnelle particulière, parfois crucial pour la fonction cellulaire.

La question des relations cellule-cellule a été adressée par le développement des techniques de culture mixtes. Dans ce procédé, deux ou plusieurs populations de cellules sont cultivées dans le même récipient de culture. Cependant, ces cultures mixtes portent des inconvénients importants. D'une part, certains sous-types de cellules n'interagissent pas physiquement avec l'autre dans le tissu d'origine et reposent uniquement sur les communications paracrines soutenues par des facteurs solubles sécrétés et récepteurs à proximité. Tel est le cas pour plusieurs processus inflammatoires qui dépendent de la signalisation des cytokines proximale. Dans mixte cULTURES, les interactions physiques sont inévitables et il est impossible d'étudier les communications paracrines en l'absence de contacts cellule-cellule qui peut donner des résultats modifiés. D'autre part, la réalisation des interprétations spécifiques de cellules à partir d'une population mixte devient impossible sans l'utilisation de techniques de séparation difficiles qui pourraient affecter de manière significative les résultats.

Pour résoudre ces questions importantes, l'utilisation des médias conditionnés a été développé comme une technique permettant des cultures compartimentées et l'étude de la signalisation paracrine. Cette méthode nécessite le transfert du surnageant d'un type de cellule, le milieu conditionné ainsi nommé, aux puits contenant une autre population de cellules. Mais un inconvénient important est que les molécules de courte durée ne survivent pas assez longtemps dans le milieu conditionné à être transféré dans les puits de la seconde population de cellules. Même les molécules longue durée de vie sera grandement dilué au fil du temps en raison de la diffusion. En outre, les deux cellulespopulations ne participent à la communication paracrine unidirectionnel plutôt que dans une communication bidirectionnelle active. Cela conduit à l'absence de signaux de rétroaction qui est essentielle pour recréer les relations exactes pluricellulaires tels qu'ils existent in vivo.

En conséquence , et entraînée par la nécessité de mieux simuler l'original dans des conditions in vivo dans l'environnement cellulaire in vitro, de nombreux progrès dans les techniques de culture cellulaire ont été réalisées au cours des années. L' un des progrès les plus significatifs a été l'utilisation de supports perméables avec des membranes microporeuses pour compartimenter des cultures de cellules, utilisées pour la première fois par Grobstein en 1953 ^1. De tels supports perméables ont été adaptés au fil des ans pour accueillir de nombreux types de cellules et à utiliser dans plusieurs applications différentes. Aujourd'hui, ces supports existent comme des inserts creux qui sont conçus pour reposer dans les puits d'une plaque de culture tissulaire multipuits ou circuplats lar. Dans un système de co-culture, l'insert contient un type de cellule tandis que le puits ou l'autre plat contient population cellulaire, ce qui permet d'étudier la contribution de deux populations différentes de cellules de leur environnement humorale (figure 1). En conséquence, la polarité cellulaire (basolatérale ou apicale contre la sécrétion réception du signal) est conservé, ce qui confère ainsi des systèmes de co-culture insérer un avantage important par rapport aux cultures mixtes et des techniques milieu conditionné. Plusieurs types de matériaux de membrane sont disponibles, les plus courantes étant du polyester (PET), le polycarbonate (PC) ou du collagène revêtu de polytétrafluoroéthylène (PTFE), et ils existent en différentes tailles de pores allant de 0,4 um à 12,0 um. Ces variétés de matériaux et de tailles des pores offrent un spectre d'inserts exerçant des caractéristiques variables pertinentes aux propriétés optiques, l'épaisseur de la membrane et l'adhérence des cellules qui les rendent pratiques à différents niveaux pour les utilisations suivantes sans s'y limiter:
-étudierla différenciation cellulaire, le développement embryonnaire, la métastase tumorale et la réparation des plaies par des dosages chimiotactiques à travers des membranes perméables;
-evaluating la pénétration du médicament en évaluant leur transport à travers des monocouches épithéliales ou endothéliales cultivées sur des supports perméables, et;
cellules co-cultures -Exécution pour analyser les modulations du comportement cellulaire induite par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule.

Le but de cet article est de décrire les lignes directrices méthodologiques générales pour remplir la troisième fonction indiquée ci-dessus, qui est d'évaluer les changements cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en l'absence de contact cellule-cellule en utilisant un système de co-culture insert. Plusieurs domaines de recherche différents utilisent des systèmes insert de co-culture, afin de répondre à des questions pertinentes à l'effet de facteurs solubles sécrétés sur les populations de cellules. En effet, la signalisation paracrine qui module le comportement cellulaire à différents niveaux est pertinent dans tous les tissuset les systèmes, ce qui rend les systèmes de co-culture insertion indispensable pour assurer des progrès dans ces domaines. A l'inverse, l'utilisation d'inserts peut confirmer que la transduction du signal se fait par le contact direct de cellule à cellule, et non par des facteurs sécrétés. L' une des utilisations les plus importantes des inserts est dans les études de l' inflammation ^2-14 où l'effet de cytokines sécrétées est évaluée à différents acteurs cellulaires de l' immunité. En particulier, l'étude de l' inflammation dans le système nerveux central (SNC) a grandement profité des études insert de co-culture, qui ont permis de mieux définir les rôles paracrines distincts de neurones et les microglies dans neuroinflammation ^15-21 conduite. Ces systèmes ont été conçus aussi pour étudier le potentiel anti-inflammatoire des molécules repose sur leur capacité à réduire ou à inhiber la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires ^22-26. La recherche portant sur ​​le cancer ^27-31, en ​​particulier les mécanismes sous - jacents de l' angiogenèse ^32-34 et inflammatisur ^35-42 dans la tumorigenèse, bénéficie également de systèmes insert de co-culture. En outre, des facteurs solubles sont de première importance dans les processus qui conduisent la différenciation et plusieurs études ont utilisé des inserts pour répondre aux questions dans ce domaine particulier ^43-50. Dans le SNC, car le tissu neural possède un potentiel de renouvellement très limité, l'étude de la neuroprotection et neurotrophism est fondamental et a été largement assurée par l'utilisation de cellules souches dans des systèmes de co-culture ^51-56. En outre, les inserts sont également utilisés dans les domaines aussi variés que la néphrologie ^57,58, les interactions endothéliales et l' angiogénèse ^{59-62, 63-65} signalisation de l' apoptose, l' inflammation dans l' obésité et le syndrome métabolique ^22,23,66-67, l' oreille interne de protection des cellules ciliées ^68,69, et même dans la virulence des champignons ^70,71 et parasitologie ^72,73.

Cet article propose des lignes directrices méthodologiques générales afin de mettre en place un expériment en vue d'évaluer les modifications cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en utilisant un système de co-culture insert. En particulier, nous allons nous concentrer notre attention sur cellules nerveuses co-cultures et leurs utilisations dans l'étude de processus de neuroinflammatoire. Compte tenu de la très vaste éventail d'expériences qui insère permettre au pilote, il est insupportable pour couvrir tous les aspects de cette technique de culture cellulaire. A titre d'exemple, un protocole spécifique pour mesurer les effets des cytokines sécrétées par le lipopolysaccharide (LPS) -activated microglie N9 sur les cellules PC12 neuronales seront détaillées, offrant une compréhension concrète de la méthodologie insert co-culture.

Protocole

NB: Chacune des étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire tel que requis pour la culture cellulaire de mammifère. En outre, les lignes directrices générales pour la culture optimale des cellules stériles appliquent, par exemple., En écartant des conseils chaque fois qu'ils peuvent conduire à la contamination croisée, ce qui réduit la quantité de cellules de temps sont exposés à l'air lors de l' exécution des changements de médias entiers, correctement , mais en remuant doucement tout suspensions cellulaires pour assurer leur pipetage homogène, etc. de plus, les inserts sont une sorte de plasticware qui nécessitent un traitement spécial. Tout d'abord, chaque fois que les inserts sont manipulés, évitez de toucher la membrane fragile, qui se déchire facilement et pourrait donc compromettre l'expérience. En outre, il ne convient pas pour effectuer l'aspiration du milieu de culture cellulaire, car il existe un risque de perforation de la membrane ou dissociant les cellules adhérentes. Ensuite, inserts pendre dans la plaque de culture tissulaire multipuits et, par conséquent, la prudence doit être employée lorsque moVing l'plasticware ou lors du pipetage pour éviter dissociant des cellules adhérentes. En outre, quand on utilise des inserts avec de grandes tailles de pores, il est possible que le milieu de culture cellulaire suinte à travers la membrane et, par conséquent, il est important de contrôler fréquemment le niveau de liquide. Enfin, notez que le protocole suivant est conçu pour les cellules adhérentes et nécessite des modifications mineures afin d'être adapté pour des cellules en suspension.

1. Lignes directrices générales pour la conduite insertion des expériences de co-culture

1. Semis type de cellule n ° 1 à inserts
   1. Déballer les inserts de leur emballage.
   2. Placer les inserts dans un multipuits plaque de culture de tissu vide de la bonne dimension. Pour ce faire, saisir le bord supérieur de l'insert en utilisant des pinces.
   3. Pour améliorer la fixation et la propagation des cellules adhérentes, conditionner les plaquettes avec un milieu de culture cellulaire avant l'ensemencement. Pour ce faire, couvrir toute la surface de la membrane avec culture cellulaire medium à l'aide d'une micropipette.
      NOTE: Pour ce faire, pour autant inserts au besoin.
   4. Replacer le couvercle sur la plaque et incuber pendant au moins 1 heure ou O / N dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO _2).
   5. Lorsque les inserts sont conditionnés, retirer la totalité du milieu de culture cellulaire en utilisant une micropipette. Jeter le moyen utilisé.
   6. Graine type cellulaire # 1 dans du milieu frais de culture cellulaire de la même manière que dans une plaque multipuits. Pour ce faire, tirer un volume approprié de la suspension cellulaire avec une micropipette et distribuer le liquide dans l'insert.
      NOTE: Préparer autant inserts au besoin.
   7. Après l'ensemencement tous les inserts, secouez légèrement la plaque à gauche et à droite, puis en arrière afin de répartir les cellules uniformément. Évitez de faire des mouvements circulaires, car cela provoquerait des cellules d'accumuler dans le centre des inserts.
   8. Placer le couvercle sur la plaque et incuber comme indiqué par conformément aux exigences cellulaires (habituellement 37 ° C, 5-10% de CO _2).
2. Semis type de cellule n ° 2 dans des plaques de culture tissulaire multipuits
   1. Seed type de cellule # 2 dans un milieu de culture cellulaire frais conformément à la section 1.
   2. Préparer autant de puits selon les besoins pour le nombre d'insertions. Balancer la plaque comme dans l'étape 1.1.7) pour faire en sorte que les cellules sont réparties de façon uniforme dans les puits.
   3. Placer le couvercle sur la plaque et incuber dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO _2).
3. moyen Rafraîchissant dans des inserts
   1. À l'aide d'une micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire, dans les inserts contenant du type de cellule n ° 1. Jeter le moyen utilisé.
   2. Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. reposer doucement la pointe sur la paroi interne de l'insert et passer lentement le milieu de culture cellulaire.
   3. Placez le couvercle sur la plaque et incuber comme à l'étape 1.1.4.
4. moyen Rafraîchissant dans des plaques de culture tissulaire multipuits
   1. En utilisant un Micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire dans les puits contenant des cellules de type N ° 2. Jeter le moyen utilisé.
   2. Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. Reste la pointe sur la paroi intérieure du puits et distribuer lentement le milieu de culture cellulaire.
   3. Placer le couvercle sur la plaque et incuber selon les protocoles de culture de cellules préalablement établies.
5. Transférer des inserts contenant le type de la cellule n ° 1 sur des plaques de culture tissulaire multipuits contenant du type de cellule # 2.
   REMARQUE: Effectuez cette étape lorsque les deux types de cellules ont atteint le stade de croissance approprié.
   1. Avant de transférer les inserts dans les puits, apporter des modifications moyennes nécessaires, comme décrit précédemment dans les étapes 1.3) et 1.4).
      NOTE: A ce stade, il est important de distribuer les volumes appropriés de médias dans les deux compartiments tel que spécifié par les instructions du fabricant d'insertion.
   2. En utilisant des pinces, saisir le bord supérieur d'un insert contenant des cellules Type # 1 et placez-le doucement dans le puits approprié contenant un type de cellule 2 #.
   3. Après le transfert de tous les inserts, vérifier la présence de bulles d'air sous la membrane des inserts.
      NOTE: Les bulles d'air empêchent tout échange à travers la membrane de l'insert et peuvent mettre en péril l'ensemble de l'expérience.
   4. Si des bulles d'air sont présentes, soulever très doucement l'insert des puits à l'aide de pinces et de replonger dans le milieu de culture cellulaire. Les bulles vont disparaître. Si elles sont encore présentes, essayez doucement plongeant inserts retour dans le milieu de culture cellulaire à un angle.
      NOTE: Ne pas frapper ou remuer des inserts pour éviter dissociant des cellules adhérentes.
   5. Après avoir retiré toutes les bulles d'air et de vérifier que les volumes des médias dans les deux compartiments, placez le couvercle sur la plaque et incuber.
6. médias rafraîchissantes dans un système de co-culture
   NOTE: Bien que la membrane permet facilement les échanges de médias entre l'insert et le bien, rafraîchissant le moyen se fait enles deux compartiments puisque le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre dans les compartiments supérieur et inférieur par diffusion seul peut être assez long.
   1. moyen Rafraîchissant dans des inserts contenant type de cellule # 1 se fait de la même manière que dans l'étape 1.3).
   2. Pour rafraîchir dans les puits contenant type de cellule # 2 moyen, faites glisser doucement l'insert sur le côté pour créer un espace suffisamment large pour accueillir une pointe de pipette. Actualiser le moyen comme à l'étape 1.4).
   3. Vérifier la présence de bulles d'air et vérifier les volumes que par étapes 1.5.3) par 1.5.5).

Exemple 2: mesurer les effets des cytokines sécrétées par les cellules microgliales activées par le LPS N9 sur les cellules PC12 neuronales

REMARQUE: Les étapes suivantes sont conçues pour flacon spécifique, bien et tailles plat. Toutefois, le protocole peut être personnalisé pour toutes les dimensions de plasticware. Pour les médias et la composition voir tableau Matériaux.

1. Ensemencement et la différenciation des cellules PC12 en multides plaques de culture tissulaire
   1. Milieu de culture cellulaire PC12 routine chaud, PC12 milieu de différenciation et de la trypsine-EDTA dans un bain d'eau à 37 ° C.
   2. Utiliser les cellules PC12 à 60-80% de confluence d'un ² flacon de 75 cm.
   3. 15 mm avec une pipette Pasteur, effectuer l'aspiration de la totalité du milieu de culture cellulaire dans le flacon.
   4. Rincer délicatement la monocouche cellulaire avec 5 ml de tampon phosphate salin stérile et éliminer le liquide avec une pipette Pasteur. Veillez à ne pas dissocier les cellules à cette étape.
   5. Recouvrir la monocouche de cellules avec 3 ml de trypsine-EDTA et laisser incuber pendant 2-3 minutes à 37 ° C.
   6. Veiller à ce que toutes les cellules sont décollées sous un microscope. Si très peu de cellules sont flottantes, incuber pendant une période plus longue pour un maximum de 5 min.
   7. Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 de routine afin d'inactiver la trypsine-EDTA.
   8. Avec une pipette de 10 ml, triturer doucement tout en veillant à ce que la plupart des cellules sont dissociées du fond of flacon. Évitez de créer des bulles d'air dans la suspension cellulaire.
   9. Avec la même pipette de 10 ml, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 50 ml.
   10. Centrifuger pendant 1 min à 3.200 xg
   11. Jeter le surnageant avec une pipette Pasteur tout en prenant soin de ne pas perturber le culot.
   12. Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 routine avec une pipette de 10 ml.
       NOTE: Ce volume peut être ajusté si le culot est anormalement petite ou grande.
   13. Triturer avec la même pipette de 10 ml pour homogénéiser la pastille. Les cellules PC12 agglutiner souvent ensemble pour au moins 20 pipetage et downare nécessaire.
       NOTE: Bien que trituration vigoureuse est nécessaire, éviter de créer des bulles d'air dans la suspension cellulaire.
   14. Dans un tube de 1,5 ml, préparer une dilution appropriée de la suspension cellulaire en bleu trypan. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre selon des protocoles établis précédemment ^74.
   15. Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaireavec un milieu de différenciation PC12 pour obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l' ensemencement des puits d'une plaque à 24 puits (30 000 ¢ / ^cm2, 0,6 ml par puits selon le protocole du fabricant).
       NOTE: La plaque de 24 puits doit être préalablement revêtu avec du collagène tel que spécifié par des protocoles déjà établis ^75.
   16. Distribuer 0,6 ml de la suspension cellulaire par puits à l'aide d'une micropipette.
   17. Lorsque tous les puits sont ensemencées, la roche la plaque comme à l'étape 1.1.7).
   18. Pour permettre une bonne différenciation des cellules PC12, incuber les plaques à 24 puits pendant 7-9 jours à 37 ° C en atmosphère humide 5% de _CO2 dans un milieu de différenciation CP12 ^15,16 avant d' effectuer des expériences de co-culture.
   19. Effectuer des changements de milieu tous les deux jours en enlevant la moitié du liquide et en le remplaçant par un volume égal de milieu de différenciation PC12 frais.
2. Ensemencement microglie N9 dans les inserts et le traitement avec le LPS
   1. Un jour avant d'effectuer les expériences de co-culture, pré-traiter PTFE 0,4 inserts um-pores avec un milieu de culture cellulaire de routine N9 pour optimiser l'adhérence des cellules, en suivant les étapes 1.1.1) par le biais de 1.1.4)
   2. N9 milieu chaud routine de culture cellulaire et de la trypsine-EDTA dans un bain d'eau à 37 ° C.
   3. Pendant ce temps, peser environ 10 mg de LPS dans un tube de 1,5 ml pour une utilisation ultérieure.
      NOTE: Depuis LPS est une endotoxine pro-inflammatoire puissant et exige des précautions particulières de sécurité, des lunettes, des gants et un respirateur de particules sont fortement recommandés.
   4. Utiliser des cellules N9 à 80-90% de confluence d'un ² flacon de 75 cm.
   5. Suivez les étapes 2.1.3) à 2.1.14). Toujours utiliser la routine du milieu de culture cellulaire N9 à la place du milieu de culture des cellules PC12 de routine. A noter également que la microglie N9 n'agglutinent pas ensemble autant que les cellules PC12 font, donc moins pipetage de haut en bas peut être nécessaire à l'étape 2.1.13).
   6. Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaire avec un milieu de culture cellulaire à N9 obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l' ensemencement des inserts destinés à contenir dans des plaques à 24 puits (60.000 ¢ / cm ^2, 0,05 ml par insert selon le protocole du fabricant, pour la membrane de surface voir les informations du fabricant).
      NOTE: Ces inserts sont déjà revêtus de collagène par le fabricant et sont optimisés pour l'adhésion cellulaire.
   7. Distribuer 0,05 ml de la suspension cellulaire par insertion à l'aide d'une micropipette.
   8. Lorsque tous les inserts sont ensemencées, basculez la plaque comme à l'étape 1.1.7).
   9. Effectuer des dilutions en série de LPS en utilisant un milieu de traitement N9 pour obtenir 4 pg / ml, 2 pg / ml et / ml de solutions de travail 1 ug.
   10. Pipette 0,05 ml de la / ml solution de travail 4 pg dans l'un de l'ensemble des inserts afin de produire une dilution finale de 2 pg / ml.
   11. Répétez l'étape 2.2.10) pour les deux autres solutions de travail dans différents inserts ensembles, ce qui donne des dilutions finales de 1 pg / ml et 0,5 pg / ml, respectivement.
   12. Danscubate les plaques contenant les inserts de 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère de _CO2 à 5% d' humidité pour permettre l' activation des microglies N9 avec du LPS avant d' effectuer les expériences de co-culture.
3. Co-culture de cellules PC12 neuronales avec microglie N9
   1. 7-9 jours de différenciation des cellules PC12, activer les microglies N9 après 24 heures d'incubation avec du LPS par un milieu de traitement chaud et N9 milieu de traitement PC12 dans un bain d'eau à 37 ° C.
   2. Effectuer un changement de milieu total des microglies N9 comme dans l'étape 1.3), le remplacement de la totalité du support utilisé par 0,1 ml de milieu de traitement N9. Pour ce faire, pour chaque insert.This est nécessaire pour éliminer toute trace de LPS, laissant microglie N9 seulement activés dans les inserts.
   3. Effectuer un changement de milieu total des cellules PC12 neuronales comme dans l'étape 1.4). Transférer les inserts dans les plaques à 24 puits comme dans l' étape 1.5) .Incubate la N9-PC12 co-cultures pendant 24 heures ou 48 heures à 37 ° C dans une atmosphère de _CO2 à 5% humide.
   4. après 24h ou 48 h, récolte le surnageant et / ou les cellules pour la cytotoxicité, dosage immuno-enzymatique (ELISA), Western blot, ou d'autres essais.

Résultats

L'utilisation de systèmes de co-culture insert est particulièrement pertinente dans l'étude des processus neuro-inflammatoires qui mettent en valeur les relations paracrines entre les différents acteurs cellulaires du système nerveux central. Immunité dans le SNC est réalisée principalement par les cellules résidentes appelées microglies qui surveillent leur environnement dans leur état ​​de repos ramifiées (Figure 2A) et sont capables de perturba...

Discussion

L'étape la plus critique de toute expérience du système insert co-culture réside effectivement dans le choix de l'insert approprié à utiliser. La taille des pores et le matériau de la membrane doivent être prises en compte en profondeur, sans oublier de considérer le type de cellules qui seront ensemencées et le but de l'expérience. Par exemple, des dosages chimiotactiques peuvent utiliser le même type de membrane que les co-cultures cellulaires pour analyser les modulations du comportement cellu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum