細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

要約

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

要約

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

概要

in vitroでの組織、器官またはシステムの研究では、多細胞生物を構成するいくつかの細胞のサブタイプの間に存在する非常に複雑な関係を簡略化しようとする試みです。実際、in vitro研究により、単一の細胞集団の詳細な理解を獲得することを可能にします。 1）細胞間相互作用を低減し、かつ容易に細胞環境を操作する2）能力：二つの主要なインビトロ実験で行う利点があります。したがって、これらの2つの利点が、科学者は、生物全体に外因性の影響の結果を調節する能力をもたらす、 インビボで特定の細胞型の挙動を予測することができています。その意味で、in vitroでの細胞培養は、多くの場合、基礎および応用生命科学を結ぶブリッジとして動作します。それにもかかわらず、in vitroでの作業のいくつかの欠点もありますが、最も重要なのは、特定の予約は、生理的に住むことがされていること観察された表現型のアルの関連性。実際には、単一の細胞型は、容器内で成長させた場合、培養物は、様々な程度に、失う、他の細胞型、組織および起源の生物、およびアンカー内から体液環境への貢献との細胞間接続細胞機能のために、時には重要な特定の三次元構造を維持することを可能にし、組織。

細胞間の関係の問題は、混合培養技術の開発によって対処されてきました。この方法では、2つ以上の細胞集団は、同一の培養容器中で一緒に増殖させます。しかし、これらの混合培養物は、重要な不具合を負うものとします。一方で、いくつかの細胞サブタイプは、物理的起源の組織で互いに相互作用しないと分泌可溶性因子と近くの受容体によって持続的なパラクリン通信のみに依存しています。これは、近位のサイトカインシグナル伝達に依存するいくつかの炎症過程の場合です。混合Cでultures、物理的な相互作用は不可避であり、それが不可能変更された結果を得ることができ、細胞 - 細胞接触の不在下でパラクリン通信を研究することを可能にします。一方、混合集団内の細胞特異的な解釈を達成することはかなりの結果に影響を与える可能性があり、過酷な分離技術を使用せずに実現不可能となります。

これらの重要な問題を解決するために、馴化培地の使用は、区画の文化とパラクリンシグナル伝達の研究を可能にする技術として開発されてきました。この方法は、細胞の他の集団を含むウェルに、従って培地馴化名前、一つの細胞型の上清の転送を必要とします。しかし、重要な欠点は短命分子が​​細胞の第二集団のウェルに転送する馴化培地中で十分に長く生存しないということです。でも寿命の長い分子が大きく拡散による時間をかけて希釈されます。さらに、両方のセル集団は一方向のみパラクリン通信ではなく、アクティブな双方向通信に参加しています。これは、 生体内に存在したように正確な多の関係を再作成に不可欠であるフィードバックシグナル伝達の欠如につながります。

結果として、より良いインビトロ細胞環境におけるインビボ条件で原稿をシミュレートする必要性によって駆動される、細胞培養技術におけるいくつかの進歩が長年にわたって達成されました。最も重要な進歩の一つは、1953年にGrobsteinによって初めて使用される細胞培養物を区画化するための微多孔膜と通気性支持体の使用であった^1。このような透過性の支持体は、多数の細胞型に対応するために、使用することが長年にわたって調整されています複数の異なるアプリケーションインチ今日では、これらの支持体は、マルチウェル組織培養プレートまたはcircuのウェルに載るように設計されているように、中空のインサートを存在しますLAR料理。ウェルまたはディッシュが自分の体液性の環境（ 図1）上の細胞の二つの異なる集団の寄与を研究することができ、他の細胞集団が含まれているのに対し、共培養系では、インサートは、1セルタイプが含まれています。その結果、（頂端分泌または信号受信対側底）の細胞極性は、このように、インサート共培養システムを混合培養し、馴化培地技術より重要な利点を付与する、保存されています。膜材料のいくつかの種類は、ポリエステル（PET）、ポリカーボネート（PC）またはコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が最も一般的なもので入手可能であり、それらは0.4ミクロンから12.0ミクロンの範囲の異なる細孔サイズで存在します。材料および細孔サイズのこれらの種類は、これらに限定されない使用し、以下のためのさまざまなレベルで、それらを実用的に光学特性、膜の厚さと細胞接着に関連する変数の機能を発揮するインサートのスペクトルを提供します。
-studying透過膜を介して、走化性アッセイによる細胞分化、胚発生、腫瘍転移および創傷修復。
透過性の支持体上で培養上皮細胞または内皮単層を通ってそれらの輸送​​を評価することによって、薬剤の浸透を-evaluating、と。
-performing細胞の共培養は、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析します。

この論文の目的は、インサート共培養系を用いて、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価することで、上述した第三の機能を果たすために、一般的な方法論のガイドラインを記述することです。研究のいくつかの異なるフィールドは、細胞の集団に分泌された可溶性因子の影響に関連した質問に答えるために、インサート共培養システムを利用します。実際、さまざまなレベルで細胞の挙動を調節パラクリンシグナル伝達は、全ての組織において適切ですインサート共培養システムを持つシステムでは、これらの分野の進歩を確保するために欠かせません。逆に、そのシグナル伝達を確認することができるインサートの使用は、直接細胞 - 細胞接触によってではなく、分泌された因子によるものです。インサートの最も重要な用途の一つは、炎症の研究分泌されるサイトカインの効果は、免疫の種々の細胞の選手で評価され^2-14です。特に、中枢神経系（CNS）の炎症の研究は大きく、より良い神経炎症^15-21を駆動におけるニューロンとミクログリアの明確なパラクリン役割を定義することができましたインサート共培養研究から利益を得ています。これらのシステムはまた、炎症誘発因子^22〜26の分泌を低減または阻害する能力に依存している分子の抗炎症の可能性を研究するために考案されました。血管新生^32-34のメカニズムとinflammati特に癌^27-31に関連する研究、腫瘍形成における^35-42に、また挿入共培養システムから利益を得ます。また、可溶性因子は、分化を駆動プロセスで最も重要であり、いくつかの研究は、その特定のフィールド^43-50で質問に答えるためにインサートを使用しています。 CNSにおいて、神経組織は、非常に限られた再生能力を有しているように見て、neurotrophism及び神経保護の研究は基本的であり、広く共培養システム^51-56における幹細胞の使用によって保証されています。また、インサートはまた、腎臓^57,58、内皮相互作用及び血管新生^{59-62、63-65シグナル}伝達、アポトーシス、肥満やメタボリックシンドローム^22,23,66-67の炎症、内耳有毛細胞の保護といったさまざまな分野で利用されています^68,69、さらには菌の病原性^70,71と寄生虫^72,73インチ

この記事では、experimを設定するために一般的な方法論的なガイドラインを提供していますインサート共培養系を用いて、分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価した図で​​ENT。特に、我々は神経細胞の共培養し、神経炎症過程を研究する上でのそれらの使用上の注意を焦点を当てます。パイロットに可能に挿入された実験の非常に広大なスペクトルを考えると、この細胞培養技術のあらゆる側面をカバーするために耐え難いです。一例として、特定のプロトコルは、インサート共培養方法の具体的な理解を提供し、詳細に説明するリポ多糖（LPS）によって分泌されるサイトカインの効果は神経PC12細胞上N9ミクログリアを付活測定します。

プロトコル

NB：哺乳動物細胞培養のために必要に応じて、以下のステップの各々は、層流フード内で無菌条件下で実施すべきです。また、最適な滅菌細胞培養のための一般的なガイドラインは、適用例 、ヒントいつでも彼らは、交差汚染につながる時間細胞の量を減らすことができるの破棄正しく、メディア全体の変更を行うことなく、静かにすべての攪拌時に空気にさらされていますその均質なピペッティングなどを確保するために細胞懸濁液はまた、インサートは特別な処理を必要とするプラスチック製品の一種です。インサートが操作されたときにまず、簡単に涙ため、実験を危険にさらす可能性が脆弱な膜を、触れないように注意してください。膜を穿孔または接着細胞を解離の危険性があるとしても、細胞培養培地の真空吸引を行うためには適していません。次に、インサートは、マルチウェル組織培養プレートに緩くハングし、したがって、注意が時カ月使用しなければなりませんプラスチック製品をヴィングまたは接着細胞を解離避けるためにピペッティングするとき。大細孔サイズのインサートを使用する場合に加えて、細胞培養培地は、したがって、しばしば液体のレベルを監視することが重要であり、膜を通って浸透し、可能性があります。最後に、以下のプロトコルは、接着細胞用に設計されており、浮遊細胞に適したものにするために若干の変更を必要としていることに注意してください。

インサート共培養実験を行うための1.一般的なガイドライン

1. 挿入中の播種細胞型の第1位
   1. その梱包からの挿入をアンラップ。
   2. 適切な大きさの空のマルチウェル組織培養プレートにインサートを配置します。これを行うには、グリップピンセットを用いて、インサートの最上端を。
   3. 付着細胞の付着及び拡散を向上させるために、播種前に細胞培養培地でインサートを条件付けます。そうするために、細胞培養mediu有する膜の表面全体を覆​​いますマイクロピペットを用いてメートル。
      注：必要な数の挿入のためにこれを行います。
   4. プレートに蓋を交換し、同じ条件下で、少なくとも1時間またはO / Nインキュベート（通常37℃、5〜10％CO _2）。
   5. インサートが調整されるときに、マイクロピペットを用いて細胞培養培地の全てを除去します。使用した培地を捨てます。
   6. マルチウェルプレートと同様に、新鮮な細胞培養培地中の種子の細胞型＃1。そうするために、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液の適切な量を描き、インサート中の液体を分注します。
      注：必要な数の挿入を準備します。
   7. すべての挿入を播種した後、静かに細胞を均一に分配するために、次に前後に、左右のプレートを揺らし。これは、細胞がインサートの中心部に蓄積する原因となりますよう、円運動を行わないでください。
   8. 携帯要件（通常37℃、5〜10％CO通りで指定された板の上に蓋を置き、インキュベート_の2）。
2. マルチウェル組織培養プレート中に播種細胞型＃2
   1. 項1に記載の新鮮な細胞培養培地中の種の細胞型＃2。
   2. 挿入の数のために必要な数のウェルを準備します。細胞が均等にウェル中に分布していることを確実にするために）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。
   3. プレートに蓋を置き、同じ条件下でインキュベートする（通常37℃、5〜10％CO _2）。
3. インサートで爽やかミディアム
   1. マイクロピペットを用いて、細胞型の＃1を含むインサートで、一部または細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。
   2. 新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ゆっくりインサートの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。
   3. プレートに蓋を置き、ステップ1.1.4に従ってインキュベートします。
4. マルチウェル組織培養プレート中でさわやかなミディアム
   1. micropiを使用しましたpette、一部または細胞型の＃2を含むウェルにおける細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。
   2. 新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ウェルの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。
   3. プレートに蓋を置き、以前に確立された細胞培養プロトコルに従ってインキュベートします。
5. 細胞型＃2を含むマルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ＃1を含むインサートを移します。
   注：両方の細胞型は、適切な成長段階に達したときに、この手順を実行します。
   1. ）をウェルへの挿入を転送する前に、以前の手順で説明するように、任意の必要なメディアの変更を行う1.3）と1.4。
      注：この時点で、それはインサートメーカーの指示によって指定された両方の区画内のメディアの適切な量を分注することが重要です。
   2. グリップ、セルTを含むインサートの最端をピンセットを用いてYPE＃1と優しくウェル細胞型＃2を含む適切なに配置します。
   3. すべての挿入を転送した後、インサートの膜の下に気泡が存在するかどうかを確認。
      注：気泡がインサートの膜を横切る任意の交換を防止し、実験全体を危険にさらすことができます。
   4. 気泡が存在する場合、非常に穏やかによく使用ピンセットからインサートを持ち上げて、細胞培養培地に戻って突入。気泡が消えます。彼らはまだ存在している場合は、角度でバック細胞培養培地への挿入を浸漬優しくしてみてください。
      注：ノックや接着細胞を解離回避するために、インサートを攪拌しないでください。
   5. すべての気泡を除去し、両方の区画内のメディアのボリュームが、プレートに蓋を配置し、インキュベートすることを確認した後。
6. 共培養系でリフレッシュメディア
   注：この膜は容易にインサートとの間のメディアの交換を可能にし、よく、培地をリフレッシュすることで行われますが、拡散のみによって上下コンパートメントで平衡に達するのに要する時間が非常に長くすることができるので、両方の区画。
   1. セルタイプの＃1を含むインサートで爽やか媒体はステップ1.3）と同様に行われます。
   2. セルタイプ＃2を含むウェル中の培地をリフレッシュするには、静かにピペットチップを収容するのに十分な広さのスペースを作成する側に挿入部をスライドさせます。 ）ステップ1.4のようにメディアを更新します。
   3. ）気泡の有無を確認し、1.5.5を介して手順1.5.3に従ってボリューム）を確認します。

2.例：神経PC12細胞にLPS活性化N9ミクログリアによって分泌されるサイトカインの効果を測定します

注：以下の手順はよく特定のフラスコ、皿のサイズのために設計されています。しかし、このプロトコルは任意のプラスチック製品の寸法に合わせてカスタマイズすることができます。メディアや組成の材料表を参照してください。

1. マルチでのPC12細胞を播種し、差別化ウェル組織培養プレート
   1. 暖かいルーチンPC12細胞培養培地、37℃の水浴中でPC12分化培地およびトリプシン-EDTA。
   2. 75cm ²のフラスコから60から80までパーセントコンフルエンスでPC12細胞を使用してください。
   3. 15 mmのパスツールピペットで、フラスコ中の全細胞培養培地の真空吸引を行います。
   4. 静かに滅菌リン酸緩衝生理食塩水5mlで細胞単層を洗浄し、パスツールピペットで液体を除去します。この段階で細胞を解離しないように注意してください。
   5. トリプシンEDTA 3mlで細胞単層を覆い、37℃で2~3分間インキュベートします。
   6. すべての細胞が顕微鏡下で分離されることを確認してください。非常に少数の細胞が浮遊している場合は、5分間の最大のために長い期間インキュベートします。
   7. トリプシンEDTAを不活性化するために、ルーチンPC12細胞培養培地10mlを加えます。
   8. ほとんどの細胞は、O底から解離していることを確認しながら10ミリリットルピペットで、穏やかに粉砕しますフラスコF。細胞懸濁液中の気泡を作成しないでください。
   9. 同じ10mLのピ​​ペットを用いて50mlの遠心管に細胞懸濁液を移します。
   10. 3200×gで1分間遠心操作
   11. ペレットを乱さないように注意しながらパスツールピペットで上清を捨てます。
   12. 10ミリリットルピペットでルーチンPC12細胞培養培地の10ミリリットルを追加します。
       注：ペレットが非常に小さい、または大きい場合には、この量を調整することができます。
   13. ペレットを均質化するために、同じ10ミリリットルピペットで粉砕します。 PC12細胞は、多くの場合、ピペッティング少なくとも20ので、一緒に凝集し、必要なdownare。
       注：活発摩砕が必要であるが、細胞懸濁液中の気泡を作成しないように。
   14. 1.5mlチューブでは、トリパンブルー中の細胞懸濁液の適切な希釈を準備します。以前に確立されたプロトコール⁷⁴に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。
   15. 個別の50mlチューブに、細胞懸濁液を分割PC12分化培地で24ウェルプレートから（3万¢/ cm ²でよく、製造業者のプロトコルに従ってあたり0.6 ml）をウェルに播種するために希釈された細胞懸濁液を適切に得ることができます。
       注：以前に確立されたプロトコル⁷⁵で指定された24ウェルプレートは、以前に、コラーゲンでコーティングされている必要があります。
   16. よくマイクロピペットを用いて、あたりの細胞懸濁液0.6ミリリットルを配布します。
   17. 全てのウェルを播種しているとき、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。
   18. PC12細胞の適切な分化は、共培養実験を行う前に、PC12分化培地^15,16の5％CO ₂の湿潤雰囲気中で37℃で7-9日間、24ウェルプレートをインキュベートすることを可能にします。
   19. 液体の半分を除去し、新鮮なPC12分化培地の等量それを置き換えることにより、一日おきに培地交換を行います。
2. インサートにN9ミクログリアを播種し、LPSで処理します
   1. 一日の共培養実験を行う前に、1.1.4からステップ1.1.1）以下、細胞接着を最適化するためにルーチンN9細胞培養培地とPTFE0.4μmの細孔インサートを前処理）
   2. 37℃の水浴中で暖かいルーチンN9細胞培養培地およびトリプシン-EDTA。
   3. 一方、後で使用するために1.5mlチューブにLPSの約10mgの重量を量ります。
      注：LPSが強力な炎症誘発性内毒素であり、特定の安全上の注意、メガネ、手袋、及び粒子状人工呼吸器を必要とするので、強く推奨されています。
   4. 75cm ²のフラスコから80〜90％のコンフルエンスでN9細胞を使用してください。
   5. ）2.1.14へのステップ2.1.3）に従います。常にルーチンN9細胞培養培地の代わりに、ルーチンのPC12細胞培養培地を使用します。また、N9ミクログリアが）ので、より少ないピペッティング上下がステップ2.1.13で必要になることがあり、一緒にPC12細胞がそうであるように同じくらいを凝集しないことに注意してください。
   6. 個別の50mlチューブに、OにN9細胞培養培地で細胞懸濁液を分割24ウェルプレート中で保持するように設計されたインサート（60,000¢/ cm ²で、製造業者のプロトコルに従ってインサートあたりが0.05mL、膜表面積については、メーカーの情報を参照）を播種するための適切な希釈細胞懸濁液btain。
      注：これらのインサートは、すでに製造者によって、コラーゲンでコーティングされており、細胞接着のために最適化されます。
   7. マイクロピペットを用いて、インサートあたりの細胞懸濁液の0.05ミリリットルを配布します。
   8. すべての挿入がシードされている場合、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。
   9. 4μgの2 / mlの/ mlであり、1μgの/ mlの作業溶液を得るために、N9の処理媒体を用いて、LPSの連続希釈液を実行します。
   10. ピペットを2μg/ mlの最終希釈を得るために、インサートの1組で4 / mlのワーキング溶液0.05ミリリットル。
   11. それぞれを1μg/ mlおよび0.5μgの/ mLの最終希釈液を得た異なるセットのインサート内の他の2つの作業のソリューションのための手順を繰り返し2.2.10）。
   12. に共培養実験を行う前に、LPSとN9ミクログリアの活性化を可能にするために、5％CO ₂湿潤雰囲気中で37℃で24時間のインサートを含有するプレートをcubate。
3. N9ミクログリアと神経PC12細胞を共培養します
   1. PC12細胞を分化の7-9日目に、37℃の水浴中で暖かいN9処理媒体とPC12の処理媒体によって、LPSとのインキュベーションの24時間後N9ミクログリアを活性化させます。
   2. N9の処理媒体の0.1ミリリットルによって全体の使用済み培地を交換し、ステップ1.3）のようにN9ミクログリアの総培地交換を行います。すべてのinsert.Thisのためにこれを行うインサートでのみアクティブN9ミクログリアを残して、LPSの痕跡をすべて削除する必要があります。
   3. ステップ1.4のように神経PC12細胞の総培地交換を行います）。ステップ1.5のように24ウェルプレートへの挿入を移し）、5％CO ₂湿潤雰囲気中で37℃で24時間または48時間N9-PC12の共培養を.Incubate。
   4. 24後時間または48時間、細胞毒性、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、または他のアッセイのために上清および/または細胞を回収。

結果

インサート共培養システムの使用は、CNSの異なる細胞プレイヤー間パラクリン関係を披露神経炎症プロセスの研究に特に適切です。 CNSにおける免疫は彼らの安静分岐した状態（ 図2A）でその環境を監視し、検知乱れが可能であるミクログリアと呼ばれる常駐細胞によって主に達成される可能性がトラブルの適切な神経機能^76-78のために必要な非常...

ディスカッション

任意の挿入共培養系の実験の最も重要なステップは、実際に使用するための適切な挿入を選択する際に宿ります。孔径及び膜材料が播種される細胞の種類および実験の目的を考慮し忘れることなく、十分な考慮しなければなりません。例えば、走化性アッセイは、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析するために細胞共培養物よりも膜?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated horse serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum