Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Resumen

ácidos grasos de fosfolípidos proporcionan información sobre la estructura de las comunidades microbianas del suelo. Presentamos métodos para la extracción de muestras de suelo con una mezcla de fase única de cloroformo, el fraccionamiento de los lípidos extraídos usando columnas de extracción en fase sólida, y metanolisis para producir ésteres metílicos de ácidos grasos, que se analizan por cromatografía de gases capilar.

Resumen

ácidos grasos de fosfolípidos (PLFAs) son componentes clave de las membranas celulares microbianas. El análisis de PLFAs extraído de los suelos puede proporcionar información sobre la estructura general de las comunidades microbianas terrestres. PLFA perfiles se ha utilizado ampliamente en una variedad de ecosistemas como un índice biológico de la calidad del suelo en general, y como un indicador cuantitativo de la respuesta del suelo a la administración y otros factores de estrés ambiental aterrizar.

El método estándar que aquí se presenta describe cuatro pasos clave: 1. extracción de lípidos a partir de muestras de suelo con una mezcla de cloroformo monofásica, 2. fraccionamiento usando columnas de extracción en fase sólida para aislar los fosfolípidos de otros lípidos extraídos, 3. metanolisis de fosfolípidos para producir ácidos grasos ésteres metílicos (FAME), y 4. el análisis FAME por cromatografía de gases capilar usando un detector de ionización de llama (GC-FID). Dos estándares son utilizados, incluyendo 1,2-sn dinonadecanoyl- glicero-3-fosfocolina (PC (19:0/19: 0)) para evaluar la recuperación general del método de extracción, y decanoato de metilo (MeC10: 0) como patrón interno (ISTD) para el análisis GC.

Introducción

Ácidos grasos de fosfolípidos (PLFAs) forman parte de las membranas celulares microbianas de las bacterias y los dominios Eukarya. Los microorganismos producen PLFAs de diferentes longitudes de cadena y composición como un medio para mantener la integridad de la membrana celular y la función celular en respuesta a las condiciones ambientales inmediatos; por lo tanto, se puede argumentar que las comunidades microbianas que están separados geográficamente, pero están sometidos a condiciones similares de suelo expresarán PLFAs similares. PLFAs de suelo con una longitud de cadena de 14 a 20 átomos de C son típicamente considerados como de origen predominantemente bacterias y hongos ^1. En cultivos mixtos, análisis PLFA no se puede utilizar para identificar las especies microbianas individuales, pero puede proporcionar una huella digital global de las comunidades microbianas que se encuentran en los suelos. Además, dado que PLFAs se degradan rápidamente después de la muerte de células, pueden ser considerados como representativos de la comunidad microbiana del suelo viable ^2. esta technique se ha utilizado ampliamente para caracterizar la composición estructural de las comunidades microbianas que se encuentran en una amplia gama de ambientes, que van desde los bosques ^3-4 a ^5-6 praderas y campos agrícolas ^7. Se ha aplicado con éxito en la caracterización de la respuesta del suelo a los cambios de gestión de la tierra, incluyendo bosque claro-corte ^{8, 9} encalado, la recuperación de ^10-12, así como las perturbaciones tales como incendios ^13, la contaminación por metales e hidrocarburos ^{14 15} y ¹⁶ plaga de insectos .

El método analítico PLFA contemporánea ha evolucionado durante los últimos seis décadas a través de varios avances importantes por una serie de grupos de investigación. En 1958, una mejora significativa surgió de ajustar el cloroformo: metanol: agua en proporción de la solución de extracción para desplazar la mezcla de un monofásica a un sistema bifásico ^17. Esta extracción de lípidos optimizada y la pro forma aislada revisadaProtocolo llegó a ser conocido como el método de Bligh y Dyer. El protocolo fue adoptado por muchos laboratorios durante las próximas décadas y, durante este tiempo, White y sus colegas contribuyeron avances significativos en el método; por ejemplo, mejoraron la etapa de extracción mediante el intercambio de un tampón de fosfato para el agua, y que optimizan el análisis por cromatografía de gases (GC) a través de la identificación de picos mejorada y cuantificación. Tal vez de más importancia para la ciencia del suelo, determinaron en 1979 que los lípidos extraídos se podrían usar como un índice de la estructura microbiana cuando examinaron la biomasa microbiana de sedimentos marinos ^18.

Otros desarrollos se produjeron en la década de 1980 como el método más ampliamente utilizado se convirtió en la ciencia del suelo, específicamente en relación con la rizosfera ^19. En ese momento, el método incluye nonadecanoate de metilo (MeC19: 0) como un estándar interno ¹⁹ y el uso de una columna de ácido silícico para el fraccionamiento de lípidos ^{21 <}/ Sup>. Después de su trabajo con White ^19,21, Tunlid regresó a Suecia y comenzó la investigación en colaboración con Bååth y Frostegård. Mediante el examen de la eficacia de diferentes tampones de extracción de un conjunto de suelos que varían en contenido de materia orgánica, el grupo mostró que el tampón de citrato aumentó la cantidad de fosfato de lípidos extraído en comparación con el tampón de fosfato ^22. Además, su publicación el ²³ de 1993 sobre la influencia del encalado en las comunidades microbianas del suelo pasó a convertirse en un clásico de la citación en el suelo Biología y Bioquímica ^24. Los investigadores utilizaron análisis de componentes principales en su procesamiento de datos. análisis de FAG, como el método se llama ahora, genera grandes conjuntos de datos y el uso de procedimientos estadísticos multivariados para procesar estos datos era muy innovador para la época y de inspiración para muchos. Paralelamente a la labor que se realiza en Suecia, las modificaciones en el procedimiento PLFA estaban siendo investigados enAlemania por Zelles y sus colegas ^25-26. Su versión del procedimiento fue notable por su uso de una columna de extracción en fase sólida (SPE) en lugar de la columna de ácido silícico, pero, en general, era más intensa de laboratorio.

El artículo de Frostegård ^23, junto con la metodología detallada en blanco y Ringelberg ^27, sentó las bases para una explosión en el uso de la técnica PLFA para investigar cuestiones fundamentales de la ciencia del suelo. Desde entonces, otro refinamiento del método por Firestone y sus colegas han incluido la adición de un estándar GC interno (C10: 0) y C19: 0 como un estándar sustituta para mejorar la cuantificación ^28, y sustituyendo el uso de decantación embudos para viales de fondo redondo para simplificar extracción ^29. Más recientemente, Chowdhury y Dick ³⁰ investigaron el paso de metilación e informó de que de los dos procedimientos de metilación usados ​​en la literatura la ciencia del suelo el método ident KOH / MeOHified una gama más grande de ácidos grasos.

El método presentado se basa en gran medida en el método original desarrollado por Bligh y Dyer, e incorpora las modificaciones mencionadas anteriormente, tales como el uso de KOH metanólico para la etapa de metilación. Dos estándares se utilizan para cada muestra: norma sustituto de 1,2-dinonadecanoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (PC (19: 0/19: 0)), que se añade a la muestra de suelo antes de la primera extracción para evaluar la eficiencia y la recuperación de todo el protocolo, y un estándar de instrumento de decanoato de metilo (MeC10: 0), que se añade antes de la identificación y cuantificación por GC.

Reconocemos que el método PLFA es comúnmente utilizado por muchos laboratorios de ecología microbiana en todo el mundo, y ha sido documentado en numerosas ocasiones, incluso por la Organización Internacional de Normalización ^2. El objetivo de este trabajo es presentar un protocolo fácil de seguir y robusto que puede ser útil para sueloslos científicos que están tratando de aprender la técnica PLFA.

Protocolo

NOTA: Asegúrese siempre de que el adecuado equipo de protección personal (EPP) se lleva durante todo el protocolo. Artículos de vidrio no debe ser tocado con las manos desnudas. Los lípidos de los dedos, el pelo, grasas, aceites e hidrocarburos son todos los posibles contaminantes. Siempre use guantes de nitrilo y guantes de enjuague con alcohol al 70% durante la manipulación de vidrio limpio.

1. Preparación de la cristalería para el análisis

1. Cristalería desechable (por ejemplo, tubos de centrífuga)
   1. Envolver en papel de aluminio y el calor en el horno de mufla durante cuatro horas y media a 450 ºC.
2. Politetrafluoroetileno (PTFE) -lined tapas
   1. Remojar las tapas durante una hora en un detergente fosfato, y luego lavar con cepillo en agua caliente y detergente de fosfato. Enjuague el jabón con agua del grifo.
   2. Colocar en baño ácido (HCl al 5%) durante una hora única (no dejar más tiempo ya que los revestimientos se pueden caer de las tapas si se remojan durante demasiado tiempo. Enjuague tres vecesen el agua del grifo. Enjuague tres veces en agua destilada. Secar en estufa a 40 ºC.
3. Vidrio reutilizables (por ejemplo, 10 ml, 15 ml, 45 ml viales / frascos)
   1. Lavar con cepillo en agua caliente y detergente de fosfato. Enjuague el jabón con agua del grifo y colocar en baño ácido (HCl al 5%) durante la noche. Enjuague tres veces con agua del grifo, luego enjuagar tres veces en agua destilada y luego se seca en estufa a 40 ºC.
   2. Envolver en papel de aluminio limpio (50 ml frascos se envuelven individualmente y otros artículos de vidrio se envuelve en lotes de muestra, por ejemplo, 20) y se calienta en el horno de mufla durante cuatro horas y media a 450 ºC.
4. Cristalería volumétrica (por ejemplo, matraz aforado)
   1. Lavar con cepillo en agua caliente y detergente de fosfato. Enjuague el jabón con agua del grifo y colocar en baño ácido (HCl al 5%) durante la noche. Enjuague tres veces con agua del grifo, enjuague tres veces en agua destilada, y luego se seca en un horno a 40 &# 186; C.
   2. Antes de su uso enjuagar 3 veces con una pequeña cantidad de disolvente (por ejemplo, metanol) - No coloque la cristalería volumétrica en el horno de mufla.

2. Recopilación y procesamiento de muestras de suelo antes del análisis PLFA

1. Recoger muestras del suelo en bolsas estériles, ya menos que estos pueden ser analizadas inmediatamente, congelarlos tan pronto como sea posible. Almacenar las muestras en el congelador (-80 ° C) hasta que esté listo para proceder con la liofilización de muestras. Congelar lotes secas de muestras siguiendo las instrucciones del liofilizador.
2. Transferir cada muestra liofilizada a la bolsa estéril nuevo etiquetado. Pesar la muestra de material liofilizado en una bolsa en el tubo de centrífuga amortiguado pre-etiquetados para la extracción de FAG.
   NOTA: Una pauta general es utilizar 0,5 g de materiales orgánicos (carbono contenido> 17% en peso) y hasta 3,0 g de muestras de suelo mineral. peso de la muestra de registro para cada muestra.
3. Por cada 10 muestras, también pesan a cabo unaduplicado adicional para el análisis, y por cada 20 muestras incluye un espacio en blanco (es decir, un tubo de centrífuga que no tiene ninguna muestra en él - se utiliza como un control para identificar cualquier posible contaminación durante el proceso de extracción PLFA). lotes de proceso de tubos de muestras al mismo tiempo.
   NOTA: Un conjunto de 20 muestras corresponderá a un lote de 23 tubos de muestras (muestras 1 a 10, en un duplicado de la muestra 10, muestras de 12 a 22, un duplicado de la muestra 22, y uno en blanco = lote de 23 tubos de muestra).
   NOTA: Llevar a cabo la extracción, separación y luego, a continuación, la metilación en lotes de muestras antes de prepararlos para el análisis de GC y correr a todos juntos. Esto ayuda a identificar dónde han ocurrido errores si algo va mal, y puede ayudar a reducir el número de extracciones repetidas necesarias.

3. Técnica PLFA (pasos son para la muestra individual, sino todo un lote completo a la vez)

NOTA: Todos los pasos de la técnica PLFA descritos en los pasos1-3 a continuación deben llevarse a cabo en una campana de extracción utilizando el EPP adecuado y siguiendo las directrices de seguridad del laboratorio.

1. Extracción (Paso 1):
   1. Preparar 5,0 M KOH por disolución de 14 g de KOH en 50 ml agua destilada y desionizada (dH ₂ O).
   2. Preparar tampón de citrato 0,15 M disolviendo 31,52 g de ácido cítrico monohidratado en 400 ml de _dH2O Se ajusta a pH 4,00 ± 0,02 mediante la adición de 5,0 M de KOH; aproximadamente serán necesarios 45-50 ml de 5,0 M KOH para ajustar el pH a 4,00. Cuando se ajusta el pH, diluir tampón de citrato a 1.000 ml usando un matraz aforado. Almacenar tampón de citrato en el refrigerador cuando no esté en uso (hasta un mes).
   3. Preparar diario el PC (19: 0/19: 0) nonadecanoate estándar sustituto diluyendo 250 l de la solución madre (10 mg / ml) en 25 ml de cloroformo (este proporciona suficiente estándar sustituto para un lote de 23 muestras). Añadir 0,5 ml de PC (19: 0/19: 0) solución patrón sustituto para el tubo de muestra de centrífuga.
   4. UNdd el agente de extracción de Bligh y Dyer para la muestra de suelo en el orden siguiente: i) 2,0 ml de tampón de citrato, ii) 2,5 ml de cloroformo, y iii) 5,0 ml de metanol. muestra de tapa con una tapa de PTFE forrado y agitar durante 30 segundos; colocar en agitador de extremo a extremo para 2 hr.
   5. Centrifugar a 226 xg durante 15 minutos con el casquillo encendido. Dibuje sobrenadante con una pipeta Pasteur y la transferencia a un vial de vidrio de 45 ml etiquetados.
   6. Añadir una segunda ronda de Bligh y Dyer de extracción de cada muestra, y repetir los pasos 4 y 5 anteriores. Dibuje sobrenadante con una pipeta Pasteur y traslado a la misma vial de vidrio ml marcado 45.
   7. Añadir al sobrenadante marcado que contiene 45 ml vial de vidrio: i) 5,0 ml de cloroformo, y ii) tampón 5,0 ml de citrato. Casquillo con el blanco de vidrio y tapa de vórtice PTFE forrado vial durante 30 segundos. Dejar reposar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad (para evitar la oxidación).
   8. aspirar con cuidado la fase acuosa superior del vial 45 ml (si no hay vacío está disponible, la pipeta debe reducirse a través de la aquefase ous con mucho cuidado para no recoge ninguna de la pipeta al pipetear la fase orgánica). Pipeta fase orgánica inferior al marcado vial de 15 ml.
   9. Place lote de viales de 15 ml bajo N comprimido ₂ (para evitar la oxidación) a temperatura ambiente. Evaporar el cloroformo lentamente, configurando el caudal de N ₂ rizar la superficie del líquido en el vial, pero no subir los lados del vial.
   10. Tornillo en muestras de tapa y almacenar PTFE forrado en el congelador a -20 ºC envuelto en papel de aluminio (envoltura en lotes en lugar de individualmente) hasta que esté listo para continuar con el paso 2.
2. Lípidos fraccionamiento (Paso 2)
   1. Coloque soporte de columna SPE con espigas en el tanque de vidrio. Insertar nuevas columnas SPE (sílice, 500 mg, 6 ml) en las espigas. columnas de Label necesarios (se recomienda evitar mezclar las muestras).
   2. Condicionar cada columna mediante la adición de 5 ml de acetona y dejar que se drene a través, y luego añadir dos adiciones de 5 ml de cloroformo (volumen total = 10 ml). Permitir segundo lavado cloroformo fluya hacia fuera hasta ~ 1 mm por encima de la frita y luego cerrar la espita.
   3. Re-disolver la muestra (almacenado en 15 ml vial al final de la Etapa 1) mediante la adición de 0,5 ml de cloroformo al vial y agitar suavemente. muestra a la columna de SPE usando una pipeta Pasteur de transferencia de re-disolvió; repetir para un total de 2 transferencias (volumen total de transferencia de 1 ml de cloroformo por muestra).
   4. Coloque la muestra de lípidos directamente en el centro de la columna y llevar el solvente para drenar por completo en el tanque.
   5. Eluir lípidos neutros mediante la adición de 5 ml de cloroformo a cada columna. Permita que el solvente para drenar por completo en el tanque.
   6. Eluir glicolípidos mediante la adición de 5 ml de acetona a cada columna. Permitir disolvente para drenar por completo en el depósito de recogida.
   7. Eliminar columna de la base del tanque y drene el tanque con aparato de vacío. Inserte rack con tubos de centrífuga limpio y etiquetados en el tanque. Sustituir la columna de soporte en el tanque; columna etiquetada anterior debe alinearse con la etiqueta centrtubo ifuge continuación.
   8. Eluir fosfolípidos en tubos de centrífuga mediante la adición de 5 ml de metanol a cada columna. Espere a columnas SPE a secarse en campana de humos antes de deshacerse de ellos. Fracciones de fosfolípidos abajo secos a temperatura ambiente bajo N ₂ comprimido.
   9. Tubos de purga con N _2. Tornillo de tapa y almacenar muestras de PTFE forrado en el congelador a -20 ºC envueltos en papel de aluminio (envoltura en lotes en lugar de individualmente) hasta que esté listo para proceder con el Paso 3.
3. Metilación de los lípidos (Paso 3).
   1. Encienda el baño de agua caliente ajustada a 37 ºC. Preparar ácido acético 1 M (si no está ya hecha) por disolución de 57,1 ml de ácido acético glacial en 1.000 ml de _H2O destilada usando un matraz aforado de 1000 ml. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de tres meses. .
   2. Preparar lote de KOH metanólico. Preparar la solución de 0,2 M KOH por disolución de 0,45 g de KOH en 40 ml de metanol. Ajustar el volumen de KOH y metanol de acuerdo con unatamaño del lote nticipated en el Paso 3. Preparar esta solución todos los días; no almacenar por períodos más largos.
   3. Extraer muestras (en tubos de centrífuga almacenados después del paso 2) del congelador y permita que las muestras alcancen la temperatura ambiente. Añadir 0,5 ml de cloroformo y 0,5 ml de metanol a cada muestra, seguido de 1,0 ml de KOH metanólico. tubos con tapa herméticamente con la tapa forrada de PTFE. Agitar para mezclar.
   4. Colocar las muestras selladas en baño de 37 ° C durante 30 minutos. Asegúrese de que el nivel del agua es de un mínimo de 1-2 mm por encima del nivel del líquido de la muestra. Eliminar y permitir que las muestras se enfríen. Mientras que las muestras están en baño de agua, etiquetar pequeños frascos de vidrio con ID de muestra (vial de vidrio de 10 ml con tapón de PTFE forrado).
   5. Añadir 2,0 ml de hexano a cada muestra y de remolino. A continuación, añadir 0,2 ml de ácido acético 1,0 M a cada muestra y agitar para mezclar de nuevo; la separación de fases debe ser visible.
   6. Añadir 2,0 ml de _H2O destilada a cada muestra para romper fase. muestras de vórtice durante 30 segundos. A continuación, las muestras de centrifugación a 226 xg durante 2 min.
   7. Utilizandocorta pipeta Pasteur, transferir la fase superior de limpiar etiquetado viales de 10 ml. Tenga cuidado de no transferir cualquiera de la fase inferior (acuosa).
   8. Añadir 2,0 ml de hexano a cada tubo de centrífuga y se muestra remolino. muestras de vórtice durante 30 segundos. A continuación, las muestras de centrifugación a 226 xg durante 2 min.
   9. El uso a corto pipeta Pasteur, de nuevo agregar la fase superior al vial de vidrio de 10 ml etiquetados.
   10. Se evapora el disolvente en 10 marcado con vial de vidrio ml a temperatura ambiente bajo N _2. Tornillo en muestras de tapa y almacenar PTFE forrado en el congelador a -20 ºC envuelto en papel de aluminio (envoltura en lotes en lugar de individualmente) hasta que esté listo para proceder con el análisis de GC. Asegúrese de etiquetar todas las muestras.
4. El análisis de cromatografía de gases (GC)
   NOTA: Identificación y cuantificación de los PLFAs individuales se lleva a cabo utilizando un GC conectado ya sea a un FID o un detector MS. Si bien las instrucciones a continuación son para GC-FID, la preparación de la muestra sería válida para GC-MS como wana. Un ejemplo de configuración de un sistema de GC-FID incluiría un 25 m x 0,2 mm x 0,33 m (5% -fenil) columna -metilpolisiloxano con el siguiente protocolo de temperatura: Temperatura inicial 190 ºC, rampa de 10 ºC / min a 285 ºC , mantenga 9,5 min, rampa de 60 ° C / min hasta 310 ºC, mantenga 0,42 min ^31.
   1. Preparar el estándar interno GC (ISTD) mediante la adición de una gota de MeC10: 0 (metil decanoato) a 100 ml de hexano (registro añadido peso a 0,1 mg). Encienda los gases a GC y luego encienda el GC. Asegúrese de que el H _2, N ₂ y cilindros de aire están abiertos y que no hay suficiente gas para ejecutar el análisis ₍₂ H nunca debe llegar por debajo de 500 psi).
   2. Comprobar que las condiciones de una buena calibración se cumplen mediante la ejecución de patrones de calibración que contienen una mezcla de ácidos grasos, seguido por un espacio en blanco hexano. La identidad de los ácidos grasos individuales puede ser manualmente asignado basado en comparaciones con tiempos de retención obtenidos para los estándares, o esto puede ser automaticaLLY asignado utilizando comercialmente disponibles softwares ^31. En todos los casos, la identificación inequívoca se puede lograr utilizando un detector de MS ^2.
      NOTA: Las muestras adicionales de una buena calibración incluyen una línea de base plana y no hay contaminación en el enjuague hexano.
   3. Disolver cada residuo de muestra PLFA (contenido en vial de vidrio de 10 ml de metilación de lípidos Paso 3) en 150 l de la solución de ISTD y transferir en un vial GC (Alternativamente, puede utilizar 50 a 75 l si se anticipa respuesta de la muestra a ser débiles, como en muy suelos arenosos).
   4. Ajuste el volumen de inyección de muestra de 2 l. Ajuste la temperatura FID 300 ºC. Ejecutar las muestras usando una temperatura de entrada de 250 ºC, con H ₂ como el (velocidad de flujo de 1,3 ml / min) de gas portador y una relación de división de 30: 1.

Resultados

Los ácidos grasos son designados como X: YωZ, donde X representa el número de átomos de carbono, Y representa el número de dobles enlaces, y Z indica la posición del primer doble enlace desde el extremo alifático (ω) de la molécula. Los sufijos 'c' y 't' indican isómeros geométricos cis y trans. El prefijos y sufijos "a" y "i" se refiere a anteiso e iso ramificación y Yo y OH especificar grupos metilo y grupos hidroxilo, respectivamente.

carrera post-GC, comprobar que las muestras recibidas ISTD adecuada mirando a la 10: 0 pico. También puedes ver la respuesta de los estándares de GC, es decir, los viales que contienen hexano con una solución de patrón interno añadido; éstos no deben tener otros picos. la respuesta estándar interno debe ser similar a lo largo de todas las carreras.

La Figura 1 presenta un repreanálisis de la muestra tiva. El gran pico del disolvente hexano aparece característicamente en un tiempo de retención (RT) alrededor de 1,8 min. El pico del patrón ISTD (C10: 0) aparece en una RT de 3,4 minutos, mientras que C19: 0 tiene un RT de 16,2 minutos. El análisis GC separa las PLFAs en función de su longitud de la cadena, con cadenas más largas de elución más lenta; por ejemplo, C18: 0 eluye a 14,4 minutos, mientras que C16: 0 eluye a 10,8 min. Además, este protocolo de análisis puede separar PLFAs en función de su grado de insaturación y la posición de su doble enlace; por ejemplo, C18: 0 eluye a 14,4 min, mientras que C18: 1 9c, y C18: 1 7c eluyen a 14,0 y 14,1 min, respectivamente (Figura 1). Por último, PLFAs de similar longitud de cadena y la saturación, pero la configuración de ramificación diferente (anteiso frente ISO) se pueden separar; por ejemplo, C15: 0i y C15: eluyen 0a a 8,6 y 8,7 min, respectivamente (Figura 1).

Las áreas de los diferentes picos de GC pueden ser importado en una hoja de cálculo para procesar la información más cromatograma de gases. Cada PLFA identificado se cuantifica (nmol g ^-1 de suelo seco) usando la siguiente ecuación:

donde F es un factor de ajuste que tiene en cuenta la selectividad FID y las diferencias molaridad entre los ácidos grasos ^32, areaPLFA es el área del pico para cada uno identificado PLFA, areaC10: 0 es el área del pico para la ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std añadido es la cantidad de ISTD (nmol) a cada muestra antes de realizar la GC, la relación (C19: 0 std añadido / C19: 0 muestra) corresponde a la recuperación de la PC (C19: 0 / C19: O) estándar sustituta, y el peso de la muestra es la cantidad de secado al horno del suelo (g) añadido al tubo de muestra centrífuga original y utilizado para extraer PLFAs.

NOTA: Las áreas bajo la diferepicos nt se expresan como áreas de los picos, la respuesta o respuesta% dependiendo del sistema de GC. Dentro de la gama relevante para suelo PLFA caracterización, las áreas se puede suponer que es linealmente proporcional a los pesos de ácidos grasos; Alternativamente, los factores de corrección pequeñas se pueden aplicar para dar cuenta de FID selectividad ^32. Además, ya que los resultados se expresan inicialmente en una base de porcentaje en peso, tienen que ser normalizados para producir cantidades molares. Ajustar las diferencias de molaridad se consigue teniendo en cuenta los pesos moleculares de los ácidos grasos individuales; tablas publicadas ³² ​​y ^{31 de} software comercial también están disponibles para ayudar cuando la normalización de molaridad.

La cantidad de patrón interno (nmol) a cada muestra se puede calcular más ampliamente como:

C10: 0std añadido = [ISTD] × V _{(enfermedad de transmisión sexual en el original)}

donde [ISTD] es la concentración (nmol ^-1 l) de la MeC10: 0 (decanoato de metilo) disuelto en hexano (consulte el paso 3.4.1), y V _{(enfermedad de transmisión sexual en el original)} es el volumen (L) de solución de ISTD preparado añadió a cada muestra antes de realizar la GC (es decir, 150 l según la etapa 3.4.4).

La cantidad de C19: 0 (nmol) presente en cada muestra durante el análisis GC corresponde a:

donde areaC19: 0 es el área del pico de C19: O, mientras que la cantidad correspondiente de C19: 0 (nmol) a cada muestra al inicio del método de extracción PLFA (cf. Paso 3.1.3) es:

donde [19: 0] _Std (mg ^L-1 ) es la concentración de la C19: 0 nonadecanoate estándar sustituto disuelto en cloroformo (Paso 3.1.3), V _{(19: 0 std añadido)} es el volumen de la norma sustituto preparado añadido a cada muestra al comienzo de la extracción PLFA método (cf. Paso 3.1.3), M _{19: 0} es el peso molecular de 1,2-dinonadecanoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (PC (19: 0/19: 0)).

NOTA: Un mol de C19: 0 nonadecanoate rendimientos estándar sustitutas dos moles de C19: 0 siguiendo el paso de metilación, mientras que el C10: 0 se añade estándar después de la metilación.

Los siguientes PLFAs están excluidos de los análisis de las comunidades microbianas del suelo: i) PLFAs que son <14 C y> 20 ° C en longitud, y ii) PLFAs con menos del 0,5% del total en el área del pico. Una vez que se han excluido estos PLFAs, las respuestas de todos los PLFAs restantes pueden ser sumados para obtener el total de bi PLFAomass (nmol g ^-1 de suelo seco). El análisis univariante de los datos PLFA (por ejemplo, ANOVA, a raíz de la transformación de datos según sea apropiado para cumplir con los supuestos de la prueba que se lleva a cabo) puede ser utilizado para comparar la biomasa total PLFA y / o biomasa PLFA de los grupos seleccionados entre grupos / las muestras tratamientos. Por ejemplo, la Figura 2 se presentan los resultados para la distribución relativa de los diferentes grupos, tales como PLFA PLFAs de cadena lineal saturados, saturados PLFAs ya sea con mitad de la cadena (10-metilo) o ramificación de terminal, y mono- o poliinsaturados PLFAs, así como la suma de PLFAs totales (nmol g ^-1 de suelo seco). En este ejemplo particular, la edad de los árboles (que disminuye desde el sitio 1 al sitio 3) se ve para influir tanto en PLFAs total y la distribución relativa de los diferentes grupos PLFA.

Para evaluar los patrones generales en la composición PLFA entre las muestras, el análisis multivariante de todos PLFAs puede ser Conducted ^33. Los datos PLFA necesitan ser transformadas según sea necesario antes del análisis multivariado seleccionado para cumplir con los supuestos de la prueba estadística y la pregunta de investigación se aborda, por ejemplo, una transformación Hellinger se utiliza a menudo para relativizar los datos. La Figura 3 muestra los resultados de un no -metric escalamiento multidimensional (CMBD) ordenación de los mismos datos que se utilizaron en la Figura 2; NMDS es una técnica multivariante no paramétrico, que produce el posicionamiento de 2 ó 3 dimensiones de puntos de datos en base a la similitud de la clasificación de las puntuaciones entre las muestras.

Figura 1. Representante GC-FID cromatograma. Una muestra obtenida de un suelo Pardo chernozemic cultivadas se utilizó para este análisis. Los tiempos de retención y PLFAs correspondientes (entre paréntesis) y su área del pico (pA) unare se indica en la figura para los picos representativos. Para mayor claridad, no todos los picos están indicadas en la figura, aunque esta muestra particular cedió 33 PLFAs identificados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. La abundancia relativa de las seis clases diferentes de PLFAs (% del total de PLFAs), y la biomasa total PLFA (nmol g ^-1 de suelo seco). Las muestras de suelos forestales Luvisolic se utilizaron para este análisis. Los resultados indican mayores PLFAs totales para el suelo en el Sitio 1, que se encuentra debajo de los árboles de mayor edad (> 50 años), seguidos de los de edad intermedia (25 años) árboles (sitio 2), y por último los más jóvenes (10 años) árboles ( sitio 3). PLFAs relativamente más saturados están presentes en el menor;sitio, mientras que más PLFAs insaturados están presentes en el sitio más antiguo. Las barras de error representan las desviaciones estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. escalamiento multidimensional no métrico (CMBD) ordenación de PLFAs (utilizando% del total de PLFAs datos) de los ejes 2 y 3 de una solución de 3 dimensiones. Esta ordenación se calcula utilizando los mismos datos que los que se utilizan para la Figura 2. La el sitio más joven (sitio 3) separa muy claramente de los de mayor edad dos sitios (sitios 2 y 3), que muestran la superposición en su composición de la comunidad microbiana PLFA. La cantidad de variación en los datos de comunidad PLFA explicada por cada eje se incluye entre paréntesis; 72,5% de la variación se explica por estos dos ejes para un 3-dimensolución NMDS sional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Para minimizar y evitar una interpretación errónea de los datos FAG, la selección cuidadosa de datos debe hacerse debido a que algunos PLFAs que se encuentran en la comunidad microbiana del suelo también están presentes en los organismos eucariotas multicelulares simples y, como raíces de las plantas, algas y animales del suelo. Además, Archaea no contienen PLFAs; en cambio, las membranas archaeal están compuestos de lípidos de éter de fosfolípidos (PLELs). En consecuencia, el protocolo PLFA no se puede utilizar para caracterizar las comunidades archaeal en el suelo.

Asociar PLFAs individuales a grupos microbianos específicos debe ejercerse con precaución (ver la publicación de 2011 por Frostegård y sus colegas ³⁴ para una excelente discusión de algunas de las limitaciones del método FAG). En lugar de ello, puede ser más apropiado, como se hizo en la figura 2, a PLFAs de grupo sobre la base de su estructura química, por ejemplo, i) PLFAs saturados de cadena lineal, ii) PLFAs saturados con mid-chain (10-metilo) de ramificación, ácidos grasos saturados iii)-ramificados terminalmente, IV) PLFAs monoinsaturados, v) PLFAs poli insaturados, y vi) ácidos grasos hidroxilados.

puede necesitar ser ajustada en base a la cantidad de extraíbles PLFAs contenidos en una muestra de suelo dado Peso de la muestra. Al no ajustando la cantidad de suelo extraído en suelos menos activos por microbios, los usuarios corren el riesgo de no obtener un número suficiente de respuestas PLFA (picos) para representar con precisión la comunidad microbiana en general. En suelos muy microbiológicamente activos con altas concentraciones de PLFAs, los usuarios están en riesgo de sobrecarga de la columna de la GC, evitando de este modo la cuantificación exacta de PLFAs. En ambos casos, las muestras de suelo deben ser re-analizados para PLFAs. Un buen punto de partida es añadir 0,5 g de muestras de suelos orgánicos (como el suelo de los bosques), y aproximadamente 3 g de muestras de suelos minerales. Puesto que la cantidad de extraíbles PLFAs está típicamente correlacionado con la cantidad de carbono orgánico contenido en un suelo, que muestravuelo puede ser ajustado en función del contenido de carbono del suelo; por ejemplo, 1 g de muestra de suelo mineral puede ser suficiente para obtener una buena cuantificación PLFA cuando el contenido de carbono es del 10-15%, mientras que> 5 g puede ser necesario si el contenido de carbono es ≤ 0,5 %. Siempre es una buena idea para hacer una prueba con algunas muestras para optimizar el peso de la muestra antes de que todo el conjunto se ejecuta.

las estrategias de resolución de problemas comunes para el protocolo PLFA y análisis GC son los siguientes. Si la línea de base GC cromatograma es demasiado alta, el cilindro de gas H ₂ debe ser cambiado. Si los picos de disolvente o ISTD faltan en el cromatograma, puede haber un problema con la inyección de la muestra (por ejemplo, una jeringa, un problema con inyector automático, frasco vacío o falta, error en el posicionamiento vial tapado). Si se detectan más de tres picos en el blanco método / muestra, hay contaminación de la pieza en bruto, y hay una alta probabilidad de que el mismo contaminante (s) estará presente en la muestra de GC chromatograms. Encontrar la fuente de contaminación (medios generalmente acuosa), o por lo menos, asegurar que los picos correspondientes a los contaminantes se eliminan de los cromatogramas de muestras y que estos picos no se incluyen en ningún análisis estadístico de los datos PLFA. Además, es una buena idea ejecutar hexano enjuagues entre las muestras cuando se sospecha de arrastre. Picos adicionales en el enjuague hexano indicarán arrastre (es decir, los componentes más pesados ​​eluyen de ejecución anterior).

Los lípidos son particularmente susceptibles a la oxidación, y un cuidado especial debe ser ejercido a través del protocolo para proteger las muestras de la exposición al aire y la luz, como su almacenamiento en la oscuridad y mantenerlos bajo nitrógeno. Todas las muestras y blancos deben tener suficiente C19: 0 estándar sustituta. A falta C19: 0 pico, en cualquiera de las muestras o los espacios en blanco, indica una mala recuperación o una pérdida completa de analitos. Una respuesta de C19: 0 en las muestras que es considerablemente más baja que la método espacios en blanco / muestra indica una pérdida de analitos en algún momento de la metodología PLFA. Cuando se enfrentan con un mal C19: 0 de recuperación, todos los aspectos del procedimiento tienen que ser considerados cuidadosamente y examinados incluyendo la extracción inicial, todas las etapas de transferencia de la muestra, la extracción de SPE, la metilación de ácidos grasos, secado, almacenamiento y manipulación de la muestra con el fin de aislar el etapa o etapas en las que se perdieron analitos. Por otro lado, puede ser que la extracción de algunas muestras de suelo puede producir C19: 0, en el que la recuperación caso de la norma sustituto puede ser sobreestimada. Durante el uso de dos normas ((PC (19: 0/19: 0) y MeC10: 0) no es un requisito absoluto, hemos encontrado que esto es muy útil cuando se necesita para solucionar Mientras el MeC10:. 0 es la respuesta adecuada , solución de problemas puede enfocarse en los pasos previos al análisis de GC.

Como se señaló anteriormente, se debe tener cuidado al interpretar las relaciones de significación y los ecosistemas ecológicos basándose únicamente en los biomarcadores se derivand a partir de datos FAG, porque los estudios de cultivos puros revelan que las cepas bacterianas aisladas contendrán diferentes categorías de PLFAs. En su lugar, PLFAs biomarcadores deben ser vistos como una adición útil en una serie de pruebas al hacer inferencias ecológicos más amplios. En la literatura, se han propuesto PLFAs individuales y utilizados como biomarcadores para diferentes grupos microbianos. PLFAs saturados se utilizan típicamente para representar las bacterias gram-positivas y monoinsaturados PLFA se utilizan para las bacterias gram-negativas. biomarcadores reconocidos para bacterias gram-negativas incluyen ácidos grasos monoinsaturados con la insaturación en la posición ω5 o ω7, tales como C16: 1ω7, C18: 1ω7, y C18: 1ω5. Además, los ácidos grasos ciclopropilo también pueden ser representativos de bacterias gram-negativas ^35. Por lo tanto, PLFAs de bacterias gram-negativas se pueden calcular como igual a la suma de A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. biomarcadores reconocidos para las bacterias gram-positivas son sa ramificadas terminalmenteácidos grasos turated, iso-ramificado tal como C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; o anteiso ramificados, tales como C15: 0a y C17: 0a. Saturada con PLFAs mitad de la cadena (10-metil) de ramificación, como 10Me16: 0 y 10Me18: 0 son característicamente presente en actinomicetos ^36. Por lo tanto, PLFAs de bacterias gram-positivas pueden calcularse como igual a la suma de A: 0 (ISO, anteiso, 10-metilo).

Muchos biomarcadores asociados con hongos PLFA a menudo son poliinsaturados, pero algunos biomarcadores fúngicas son monoinsaturadas. Por ejemplo, en términos de biomarcadores monoinsaturadas hongos, C16: 1ω5 ha sido identificado como un indicador de los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) ^37, C18: 1ω9 es común en los hongos saprófitos, y ectomicorrizas típicamente contienen C16: 1ω9. La presencia de di-insaturado C18: 2ω6,9 se produce a menudo en conjunción con C18: 1ω9 y también se correlaciona bien con el ergosterol esteroles fúngicos, que indica que C18: 2ω6,9 puede representar adecuadamente ectomycorrhizae y hongos saprófitos ^38. El tri-insaturados C18: 3ω 6,9,12 también se ha utilizado como un marcador biológico para los hongos ^10; sin embargo, C18: 3ω6c se puede encontrar en otros organismos eucariotas, incluyendo plantas y algas, aunque normalmente no se encuentra en las bacterias. En términos de protistas del suelo, C20: 4ω6c ha sido reconocido como un biomarcador protista ^39, aunque, otros trabajos no pudo detectar C20: 4ω6c aun cuando las poblaciones de protistas viables se confirmaron visualmente utilizando microscopía de luz ^40.

Muchos estudios abordan las cuestiones ecológicas relacionadas con la comunidad microbiana del suelo en general mediante la utilización de técnicas de ordenación multivariantes como una herramienta de análisis de datos FAG. Al utilizar este enfoque, algunos autores han elegido para excluir PLFAs raras del conjunto de datos mediante la eliminación de PLFAs que están presentes en menos de 5% de las muestras ^4. Los ácidos grasos saturados normales C16: 0 y C18: 0 son abundantes en todos los microorganismos del suelo, incluyendo procariotas y eukaryotes. Por lo tanto, algunos investigadores optan por eliminar estos PLFAs antes del análisis estadístico sobre la base de que pueden no ser indicadores sensibles de la composición de la comunidad microbiana del suelo - a pesar de C16: 0 y C18: 0 todavía no se han incluido al sumar todos los PLFAs para un índice de la biomasa microbiana. En términos de análisis estadísticos, muchos investigadores deciden realizar una ordenación no métricas escalamiento multidimensional (CMBD) ya que esta técnica se adapta bien a los datos que no pueden ser distribuidos normalmente ^33. Análisis adicionales relacionados con las variables categóricas pueden incluir análisis de especies indicadoras, que se puede relacionar la aparición de PLFAs específicos a grupos categóricos y procedimientos de varias permutaciones de respuesta (MRPP), que pueden ayudar a determinar similitudes o diferencias entre las comunidades microbianas asignados a los grupos categóricos. Además, los árboles de regresión multivariante (MRT) pueden ser particularmente útiles cuando la influencia de múltiples variables experimentales otratamientos necesitan ser evaluados como posibles variables explicativas ⁵ (por ejemplo, la textura del suelo, la humedad, la edad reclamación).

Una vez establecido, el protocolo PLFA es un método analítico relativamente sencillo que puede ser muy útil cuando la cuantificación de la respuesta microbiana del suelo a los cambios ambientales y las perturbaciones antropogénicas. Mientras que las técnicas moleculares como la huella genética se adaptan mejor a la caracterización detallada de las comunidades microbianas, el método PLFA presenta la ventaja de proporcionar información cuantitativa sobre la biomasa microbiana total de ^34. En nuestro laboratorio de investigación, una persona puede procesar cómodamente a un conjunto de 20 muestras de más de 4 días, y hemos encontrado el protocolo que aquí se presenta como una técnica robusta y reproducible para evaluar la calidad biológica del suelo.

La potencia del método PLFA se puede extender en gran medida mediante el acoplamiento a análisis de isótopos estables ^{41, 42.} En concreto, la adición of ¹³ sustratos C-etiquetados a los suelos permite la cuantificación de la incorporación de sustrato en los microorganismos del suelo, aunque el análisis isotópico de PLFAs individuales ^41. Además, este método parece ser una herramienta muy prometedora para dilucidar los vínculos tróficos en el suelo telas de alimentos ^42.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports			Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen	Praxair	Ni-T	Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap	Fisher Scientific	05-569-3	Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D	Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-4	Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band	Grand & Toy	42199	1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000			Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C)	Revco	ULT2586-5-A36	Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column	Agilent Technologies		Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column	Agilent Technologies	19091B-105
Gas chromatograph insert	Agilent Technologies	5183-4692	Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid	Agilent Technologies	5188-6592	Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes	Fisher Scientific	H292-4	Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3))
Hot water bath -Isotemp 220	Fisher Scientific		Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-2	Used for freeze drying samples
KOH, ACS grade	Fisher Scientific	P250-500	Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes	Barnstead/Thermolyne	3,625,485	Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard	Sigma-Aldrich	299030-2.5G	Used for GC analysis
Methanol	Fisher Scientific	A454-4	Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software	MIDI, Inc., Newark, DE		Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System	Lab Sphere Inc	1200-A	Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves	Fisher Scientific	27-058-52	Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter - Accumet XL200	Fisher Scientific		Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette	Socorex	832.02	Used throughout Steps (1 per sample)
250 µl gastight syringe	Hamilton	1725	Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves	Sigma-Aldrich	Z529575	For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column	Agilent Technologies	5982-2265	Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached	Sigma-Aldrich		Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615	Barnstead International	M37615	Used in Steps 1-3
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade	Sigma-Aldrich	270733-4L	Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags	Fisher Scientific	01-812-120	Used in sample collection - 2 bags required per sample collected