Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Zusammenfassung

Phospholipid-Fettsäuren liefern Informationen über die Struktur des Bodens mikrobiellen Gemeinschaften. Wir stellen Verfahren zur Extraktion aus Bodenproben mit einem einphasigen Gemisch von Chloroform, Fraktionierung des extrahierten Lipiden Festphasenextraktionssäulen verwendet und Methanolyse Fettsäuremethylester zu erzeugen, die durch Kapillar-Gaschromatographie analysiert.

Zusammenfassung

Phospholipid-Fettsäuren (PLFAs) sind Schlüsselkomponenten von mikrobiellen Zellmembranen. Die Analyse der PLFAs aus Böden extrahiert können Informationen über die Gesamtstruktur der terrestrischen mikrobiellen Gemeinschaften bieten. PLFA Profilierung wurde in einem Bereich von Ökosystemen als biologischer Index der Gesamtbodenqualität und als quantitativer Indikator für Boden Reaktion auf Landmanagement und andere Umwelt-Stressoren ausgiebig genutzt.

Die Standardmethode präsentiert hier skizziert vier wichtigsten Schritte: 1. Lipidextraktion aus Bodenproben mit einem einphasigen Chloroform-Gemisch, 2. Fraktionierung Festphasenextraktionssäulen mit Phospholipiden zu isolieren, von anderen extrahierten Lipide, 3. Methanolyse von Phospholipiden Fettsäure zu produzieren Methylester (FAME), und 4 FAME Analyse durch Kapillar-Gaschromatographie eines Flammenionisationsdetektors (GC-FID) verwendet. Zwei Standards verwendet werden, einschließlich 1,2-dinonadecanoyl- sn - glycero-3-phosphocholin (PC (19:0/19: 0) als internen Standard (ISTD) für die GC-Analyse: 0)), um die Gesamtrückgewinnung des Extraktionsverfahrens und Methyldecanoat (MeC10 zu beurteilen.

Einleitung

Phospholipid - Fettsäuren (PLFAs) Teil mikrobiellen Zellmembranen aus den Bereichen Bakterien und Eukaryonten. Mikroorganismen produzieren PLFAs unterschiedlicher Kettenlänge und Zusammensetzung als Mittel Zellmembranintegrität und Zellfunktion in Reaktion auf ihren unmittelbaren Umgebungsbedingungen aufrecht zu erhalten; daher kann man argumentieren, dass mikrobieller Gemeinschaften, die geografisch getrennt sind, aber auf ähnliche Bodenbedingungen ausgesetzt werden ähnliche PLFAs auszudrücken. Soil PLFAs mit einer Kettenlänge zwischen 14 und 20 C - Atomen sind typischerweise sein überwiegend Bakterien- und Pilzursprung ¹ betrachtet. In Mischkulturen können PLFA Analyse nicht zu identifizieren, einzelne mikrobielle Spezies verwendet werden, aber es kann eine Gesamt Fingerabdruck der mikrobiellen Gemeinschaften in Böden gefunden bieten. Da zusätzlich PLFAs auf Zelltod schnell abgebaut werden, können sie repräsentativ für die tragfähige Boden mikrobiellen Gemeinschaft ² betrachtet werden. Diese technique wurde die strukturelle Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften in einer Vielzahl von Umgebungen gefunden zu charakterisieren ausgiebig genutzt, aus den Wäldern im Bereich ^{3-4 5-6} und landwirtschaftliche Felder ⁷ bis Prärien. Es wurde bei der Charakterisierung von Boden Reaktion auf Land - Management - Veränderungen, einschließlich Wald Kahlschlag ^8, Kalkung ^9, Rekultivierung ^10-12 sowie Störungen wie Feuer ^13, Verunreinigung durch Metalle ¹⁴ und Kohlenwasserstoffe ¹⁵ und Insekten Ausbruch ¹⁶ erfolgreich angewendet .

Die zeitgenössische PLFA analytische Methode entwickelt, in den letzten sechs Jahrzehnten durch mehrere wichtige Fortschritte durch eine Reihe von Forschungsgruppen. 1958 stellte sich eine deutliche Verbesserung von Einstellung des Chloroform: Methanol: Wasser - Verhältnis in der Extraktionslösung ¹⁷ , um die Mischung aus einer monophasischen zu einem zweiphasigen System zu verschieben. Diese optimierte Lipidextraktion und die überarbeitete Isolation Prokoll wurde als Bligh und Dyer Verfahren bekannt. Das Protokoll wurde von vielen Labors in den nächsten Jahrzehnten angenommen und während dieser Zeit, Weiß und Kollegen bedeutende Fortschritte des Verfahrens beigetragen hat; beispielsweise verbessert sie den Extraktionsschritt durch einen Phosphatpuffer für Wasseraustausch, und sie die Analyse durch Gaschromatographie (GC) durch eine verstärkte Spitzen Identifizierung und Quantifizierung optimiert. Vielleicht von mehr Relevanz für Bodenkunde, bestimmt sie im Jahr 1979 , dass die extrahierten Lipide als Index mikrobieller Struktur verwendet werden könnte , wenn sie die mikrobielle Biomasse von Meeressedimenten ¹⁸ untersucht.

Weitere Entwicklungen traten in den 1980er Jahren als die Methode wurde weiter verbreitet in der Bodenkunde verwendet werden , insbesondere in Bezug auf die Rhizosphäre ^19. Zu dieser Zeit enthalten die Methode methyl nonadecanoate (MeC19: 0) als internen Standard ¹⁹ und die Verwendung einer Kieselsäuresäule für die Lipid - Fraktionierung ^{21 <}/ Sup>. Im Anschluss an seine Arbeit mit Weiß ^19,21 kehrte Tunlid nach Schweden und begann gemeinsame Forschung mit Bååth und Frostegård. Durch die Untersuchung in Gehalt an organischen Stoffen , die Effizienz der verschiedenen Extraktionspuffer für eine Suite von Böden unterschiedlicher, zeigte die Gruppe , dass der Citratpuffer die Menge an Lipid Phosphat extrahiert erhöhte sich im Vergleich zu dem Phosphatpuffer ^22. Ferner ²³ ihrer 1993 Veröffentlichung auf der Einfluss auf die Boden mikrobiellen Lebensgemeinschaften von Kalkung ging auf ²⁴ ein Zitat Klassiker in Bodenbiologie und Biochemie zu werden. Die Forscher verwendeten Hauptkomponentenanalyse in ihre Datenverarbeitung. PLFA Analyse, wie das Verfahren nun genannt wird, erzeugt große Datenmengen und die Verwendung von multivariaten statistischen Verfahren, um diese Daten zu verarbeiten, war sehr innovativ für die Zeit und inspirierend für viele. Parallel zu den Arbeiten in Schweden getan, wurden Änderungen an der PLFA Verfahren untersucht, inDeutschland von Zelles und Kollegen ^25-26. Ihre Version des Verfahrens war bemerkenswert für die Verwendung einer Festphasenextraktion (SPE) -Säule anstelle der Kieselsäuresäule aber insgesamt war Laborintensiv.

Frostegård Papier ^23, zusammen mit der detaillierten Methodik von White & ²⁷ Ringelberg, bildete die Grundlage für eine Explosion in der Verwendung der PLFA Technik grundlegende Fragen in der Bodenkunde zu untersuchen. Seitdem weitere Ausgestaltungen des Verfahrens von Firestone und Kollegen aufgenommen haben Zugabe eines internen GC - Standard (C10: 0) und C19: 0 als Surrogat Standard Quantifizierung zu verbessern ²⁸ und ersetzt die Verwendung von Trennt Trichter für Rundboden Fläschchen zu vereinfachen Extraktion ^29. Vor kurzem untersuchten ³⁰ Chowdhury und Dick die Methylierungsschritt und in der Bodenkunde Literatur verwendet , dass der beiden Methylierungsverfahren berichtet das KOH / MeOH Methode identified eine größere Auswahl an Fettsäuren.

Das vorgestellte Verfahren beruht auf der ursprünglichen Methode von Bligh und Dyer entwickelt weitgehend basiert, und umfasst die oben erwähnten Modifikationen, wie die Verwendung von methanolischem KOH für die Methylierungsschritt. Zwei Standards werden für jede Probe verwendet: ein Surrogat - Standard von 1,2-dinonadecanoyl- sn - glycero-3-phosphocholin (PC (19: 0/19: 0)), die zu der Bodenprobe zugesetzt wird vor der ersten Extraktions zu beurteilen, Effizienz und Wiederherstellung des gesamten Protokolls und ein Instrument Standard Methyldecanoat (MeC10: 0), die durch GC zur Identifizierung und Quantifizierung vor zugegeben.

Wir erkennen an, dass die PLFA Verfahren , das üblicherweise von vielen mikrobiellen Ökologie Labors weltweit verwendet wird, und oft wurde dokumentiert, einschließlich der von der International Organization for Standardization ^2. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein einfach zu folgen und robustes Protokoll zu präsentieren, die in den Boden nützlich sein kann,Wissenschaftler, die die PLFA Technik versuchen zu lernen.

Protokoll

HINWEIS: Achten Sie immer darauf, dass die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) ist im gesamten Protokoll getragen. Die Gläser sind nicht mit bloßen Händen berührt werden. Lipids von den Fingern, Haare, Fette, Öle und Kohlenwasserstoffe sind alle möglichen Verunreinigungen. Tragen Sie immer Nitril Handschuhe und spülen Handschuhe mit 70% Alkohol, wenn saubere Gläser Handhabung.

1. Herstellung von Glaswaren für Analyse

1. Einweg - Glas (zB Zentrifugenröhrchen)
   1. In Alufolie wickeln und Wärme in Muffelofen für vier und eine halbe Stunde bei 450 ºC.
2. Polytetrafluorethylen (PTFE) -lined caps
   1. Weichen Sie Kappen für eine Stunde in Phosphat-Waschmittel, und dann waschen mit Bürste in heißem Wasser und Phosphatreinigungsmittel. Spülen Sie Seife mit Leitungswasser.
   2. Platz in Säurebad (5% HCl) für eine Stunde nur (nicht verlassen mehr als die Auskleidungen aus den Kappen fallen können, wenn sie zu lange durchtränkt sind. Spülen Sie dreimalin Leitungswasser. Spülen dreimal in destilliertem Wasser. Trocken im Ofen bei 40 ° C.
3. Wiederverwendbare Glas (zB 10 ml, 15 ml, 45 ml Fläschchen / Dosen)
   1. Waschen mit Bürste in heißem Wasser und Phosphatreinigungsmittel. Spülen Sie Seife mit Leitungswasser und in Säurebad (5% HCl) über Nacht. Spülen Sie dreimal in Leitungswasser, dann spülen dreimal in destilliertem Wasser und trocknen im Ofen bei 40 ° C.
   2. Wickeln Sie in sauberen Aluminiumfolie (50 ml Gläser sind einzeln verpackt und andere Glaswaren werden in Probechargen eingewickelt, zB 20) und Wärme in Muffelofen für vier und eine halbe Stunde bei 450 ºC.
4. Volumenmessgeräte (zB Messkolben)
   1. Waschen mit Bürste in heißem Wasser und Phosphatreinigungsmittel. Spülen Sie Seife mit Leitungswasser und in Säurebad (5% HCl) über Nacht. Spülen Sie dreimal in Leitungswasser spülen dreimal in destilliertem Wasser, und dann trocken in einem Ofen bei 40 &# 186; C.
   2. Vor 3 mal mit einer kleinen Menge Lösungsmittel spülen zu verwenden (zB Methanol) - Volumenmessgeräte nicht in der Ofenmuffel gestellt.

2. Erhebung und Verarbeitung von Bodenproben Vor PLFA Analyse

1. Sammeln von Bodenproben in sterile Beutel, und es sei denn, diese sofort analysiert werden können, frieren sie so schnell wie möglich. Lagern Sie die Proben in Gefrierschrank (-80 ° C), bis sie bereit mit Gefriertrocknung von Proben, um fortzufahren. Gefriertrocknungs Chargen von Proben gemäß den Anweisungen des Gefriertrockners.
2. Bringen Sie jede gefriergetrockneten Probe zu neuen markierten sterilen Beutel. Abwiegen Probe aus gefriergetrocknetem Material im Beutel in vormarkiert dumpf Zentrifugenröhrchen für PLFA Extraktion.
   HINWEIS: Eine allgemeine Richtlinie ist 0,5 g für organische Materialien (Kohlenstoffgehalt> 17% wt) und bis zu 3,0 g für Mineralbodenproben. Nehmen Probengewicht für jede Probe.
3. Für alle 10 Proben wiegen auch aus einzusätzliche doppelte für die Analyse und für alle 20 Proben schließen ein Rohling (dh ein Zentrifugenröhrchen, die keine Probe darin hat - als Kontrolle verwendet eine mögliche Verunreinigung während des PLFA Extraktionsprozesses zu identifizieren). Verfahren Chargen von Probenröhrchen in der gleichen Zeit.
   HINWEIS: Eine Gruppe von 20 Proben einer Charge von 23 Probenröhrchen (Proben 1 bis 10, ein Duplikat der Probe 10, Proben 12 bis 22, ein Duplikat der Probe 22 und eine Leer = Charge von 23 Probenröhrchen) entsprechen.
   HINWEIS: Führen Sie Extraktion, dann Trennung, dann Methylierung in Chargen von Proben vor ihnen für die GC-Analyse vorbereitet und sie alle zusammen laufen. Dies hilft, zu erkennen, wo Fehler passiert, wenn etwas schief geht, und kann helfen, die Anzahl der notwendigen Wiederholungs Extraktionen senken.

3. PLFA Technique (Schritte sind für einzelne Probe, sondern komplette eine gesamte Charge zu einem Zeitpunkt)

HINWEIS: Alle Schritte des PLFA Technik in den Schritten1-3 unten sollte in einem Abzug mit geeigneten PSA und folgende Laborsicherheitsrichtlinien durchgeführt werden.

1. Extraktion (Schritt 1):
   1. Bereiten 5,0 M KOH mit 14 g KOH aufgelöst in 50 ml destilliertem, deionisiertem Wasser (dH ₂ O).
   2. Bereiten 0,15 M Citrat - Puffer durch Lösen von 31,52 g Citronensäure-Monohydrat in 400 ml dH ₂ O. Passen Sie auf pH 4,00 ± 0,02 durch Zugabe von 5,0 M KOH; etwa 45-50 ml 5,0 M KOH wird benötigt, um den pH auf 4,00 einzustellen. Wenn der pH-Wert eingestellt wird, verdünnte Citratpuffer bis 1.000 ml Messkolben werden. Speichern Citratpuffer im Kühlschrank bei Nichtgebrauch (für bis zu einem Monat).
   3. Bereiten Sie täglich den PC (19: 0/19: 0) nonadecanoate Surrogat-Standard von 250 & mgr; l der Stammlösung verdünnt (10 mg / ml) in 25 ml Chloroform (dies für eine Charge von 23 Proben genug Surrogat Standard zur Verfügung stellt). 0,5 ml des PC (19: 0/19: 0) Surrogat-Standardlösung zur Probe Zentrifugenröhrchen.
   4. EINdd das Bligh und Dyer Extraktionsmittel und der Bodenprobe in der folgenden Reihenfolge: i) 2,0 ml Citratpuffer, ii) 2,5 ml Chloroform und iii) 5,0 ml Methanol. Cap Probe mit einem PTFE-ausgekleideten Deckel und Wirbel für 30 Sekunden; legen in end-over-end-Schüttler für 2 Stunden.
   5. Zentrifuge bei 226 × g für 15 min mit Kappe auf. Zeichne Überstand mit einer Pasteur-Pipette und in ein markiertes 45 ml Glasfläschchen ab.
   6. Fügen Sie eine zweite Runde von Bligh und Dyer Extraktionsmittel zu jeder Probe, und wiederholen Sie die Schritte 4 und 5. Zeichnen Überstand mit einer Pasteurpipette und Transfer zum gleichen markierten 45 ml-Glasfläschchen aus.
   7. In den markierten 45 ml-Glasfläschchen enthaltende Überstand: i) 5,0 ml Chloroform und ii) 5,0 ml Citratpuffer. Cap mit weißen PTFE-ausgekleideten Kappe und Wirbelglas für 30 sec Fläschchen. Lassen Sie es über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur sitzen (Oxidation zu vermeiden).
   8. Vakuum vorsichtig die obere wässrige Phase der 45 ml Fläschchen aus (wenn kein Vakuum vorhanden ist, sollte die Pipette durch den aque absenkbarous Phase sehr sorgfältig zu sammeln nicht in der Pipette, wenn die organische Phase Pipettieren). Pipette untere organische Phase in etikettierte 15 ml Fläschchen.
   9. Ort Charge von 15 ml Fläschchen unter Druck N ₂ (zur Vermeidung von Oxidation) bei Raumtemperatur. Verdunsten Chloroform langsam ab, der N ₂ -Strom Einstellen der Oberfläche der Flüssigkeit in der Phiole zu kräuseln , aber nicht die Seiten der Phiole klettern.
   10. Schrauben Sie auf PTFE-ausgekleideten Deckel und Lagerung von Proben im Gefrierschrank bei -20 ° C eingewickelt in Alufolie (wrap in den Reihen nicht einzeln), bis bereit, mit Schritt 2 fortfahren.
2. Lipid - Fraktionierung (Schritt 2)
   1. Platzieren SPE-Säule Halter mit Zapfen auf dem Glasbehälter. Setzen Sie neue SPE-Säulen (Silica, 500 mg, 6 ml) in Zapfen. Label-Spalten wie erforderlich (empfohlen zu vermeiden Proben vermischen).
   2. Bedingung jede Spalte durch Zugabe von 5 ml Aceton und lässt sie durch entwässern, und fügen Sie dann zwei Zugaben von 5 ml Chloroform (Gesamtvolumen = 10 ml). Lassen zweite Chloroform Wasch fließen, bis ~ 1 mm über der Fritte und dann den Hahn schließen.
   3. Wieder auflösen Probe (gespeichert in 15 ml Fläschchen am Ende der Stufe 1) durch Zugabe von 0,5 ml Chloroform sanft Fläschchen und Wirbel. Transfer wieder aufgelöste Probe in die SPE-Säule mit einer Pasteurpipette; wiederholen für insgesamt 2 Transfers (Gesamttransfervolumen von 1 ml Chloroform pro Probe).
   4. Lay Lipidprobe direkt in die Mitte der Säule gegeben und Lösungsmittel vollständig in den Tank zu entleeren.
   5. Eluieren neutralen Lipiden durch Zugabe von 5 ml Chloroform auf jede Säule. Lassen Sie Lösungsmittel vollständig in den Tank zu entleeren.
   6. Glykolipide durch Zugabe von 5 ml Aceton zu jeder Säule eluieren. Erlauben Lösungsmittel vollständig in den Sammelbehälter abzulassen.
   7. Entfernen Sie Spalte aus dem Tank stehen und Behälter mit Vakuumvorrichtung abzulassen. Legen Sie Rack mit sauberen und markierte Zentrifugenröhrchen in den Tank. Ersetzen Sie Spalte auf Tank stehen; markierte Spalte oben sollte mit der Bezeichnung centr Line-Upifuge Rohr unten.
   8. Eluieren Phospholipide in Zentrifugenröhrchen durch Zugabe von 5 ml Methanol wurden zu jeder Spalte. Warten Sie, SPE-Säulen in Dunstabzug trocknen, bevor sie zu entsorgen. Austrocknungs Phospholipid - Fraktionen bei Raumtemperatur unter N ₂ zusammengedrückt.
   9. Purge Rohre mit N _2. Schrauben auf PTFE-ausgekleideten Deckel und Lagerung von Proben im Gefrierschrank bei -20 ° C in Aluminiumfolie (in den Reihen wickeln , anstatt einzeln) gewickelt , bis sie bereit zu Schritt 3 fortzufahren.
3. Lipid - Methylierung (Schritt 3).
   1. Schalten Sie den heißen Wasserbad auf 37 ° C. Bereiten 1M Essigsäure (falls nicht schon gemacht) von 57,1 ml Eisessig in 1000 ml dH ₂ O mit einem 1000 - ml - Meßkolben gelöst wird . Diese Lösung kann für bis zu drei Monaten bei Raumtemperatur gelagert werden. .
   2. Bereiten Sie Charge von methanolischer KOH. Bereiten 0,2 M KOH-Lösung durch Auflösen von 0,45 g KOH in 40 ml Methanol. Einstellen der Lautstärke von KOH und Methanol nach einemnticipated Losgröße in Schritt 3 diese Lösung täglich vorbereiten; nicht für längere Zeit speichern.
   3. Entfernen Proben (in Zentrifugenröhrchen gespeichert, nachdem Schritt 2) aus dem Gefrierschrank und lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur kommen. 0,5 ml Chloroform und 0,5 ml Methanol zu jeder Probe, gefolgt von 1,0 ml methanolischer KOH. Cap Rohre fest mit PTFE ausgekleideten Deckel. Swirl zu mischen.
   4. Platzieren gesiegelten Proben in 37 ºC-Bad für 30 min. Sicherzustellen, dass der Wasserstand mindestens 1-2 mm oberhalb der Höhe der Probenflüssigkeit ist. Entfernen Sie und lassen Sie Proben zu kühlen. Während Proben in einem Wasserbad sind, beschriften kleine Glasfläschchen mit Proben-IDs (10 ml Glasfläschchen mit PTFE-ausgekleideten Deckel).
   5. In 2,0 ml Hexan zu jeder Probe und wirbeln. Dann fügen Sie 0,2 ml 1,0 M Essigsäure zu jeder Probe und Wirbel wieder zu mischen; Phasentrennung sollte sichtbar werden.
   6. In 2,0 ml dH ₂ O zu jeder Probe Phase zu brechen. Vortex Proben 30 sec. Dann Zentrifuge Proben bei 226 × g für 2 min.
   7. Mitkurze Pasteurpipette übertragen die obere Phase zu reinigen 10 ml Fläschchen markiert. Seien Sie vorsichtig, nicht von der unteren (wässrigen) Phase zu überführen.
   8. In 2,0 ml Hexan zu jeder Probe Zentrifugenröhrchen und wirbeln. Vortex Proben 30 sec. Dann Zentrifuge Proben bei 226 × g für 2 min.
   9. Mit kurzen Pasteurpipette, fügen Sie wieder die obere Phase an das markierte 10 ml-Glasfläschchen.
   10. Verdunsten Lösungsmittel in markierte 10 ml Glasphiole bei Raumtemperatur unter N _2. Schrauben Sie auf PTFE-ausgekleideten Deckel und Lagerung von Proben im Gefrierschrank bei -20 ° C eingewickelt in Alufolie (wrap in den Reihen nicht einzeln), bis sie bereit mit GC-Analyse fortzufahren. Achten Sie darauf, alle Proben zu beschriften.
4. Gaschromatograph (GC) Analyse
   HINWEIS: Die Identifizierung und Quantifizierung der einzelnen PLFAs erfolgt ein GC unter Verwendung von mit entweder einem FID oder einem MS-Detektor. Während die nachstehenden Anweisungen für die GC-FID sind, würde die Probenvorbereitung für die GC-MS gelten als well. Ein Beispiel Set-up für einen GC-FID-System würde eine 25 m × 0,2 mm × 0,33 & mgr; m (5% -Phenyl) -methylpolysiloxan Säule mit dem folgenden Temperaturprotokoll enthalten: Anfangstemperatur 190 ºC, Rampe 10 ºC / min auf 285 ºC halten, 9,5 min, Rampe 60 ºC / min auf 310 ºC, halten 0,42 min ^31.
   1. Bereiten Sie die GC-internen Standards (ISTD) durch einen Tropfen MeC10 Zugabe: 0 (Methyldecanoat) zu 100 ml Hexan (Datensatz hinzugefügt Gewicht bis 0,1 mg). Schalten Sie Gase zu GC und schalten Sie dann den GC. Stellen Sie sicher , dass H _2, N ₂ und Luftzylinder offen sind und dass ausreichend Gas in die Analyse (H ₂ darf nicht unter 500 psi erhalten) laufen zu lassen.
   2. Überprüfen Sie, dass die Bedingungen einer guten Kalibrierung erfüllt werden durch Kalibrierungsstandards ausgeführt wird eine Mischung aus Fettsäuren, von einem Hexan leer gefolgt. Die Identität der einzelnen Fettsäuren können manuell zugewiesen werden basierend auf dem Vergleich mit Retentionszeiten für Standards erhalten, oder diese Automatica sein kannmit im Handel erhältlichen Software ³¹ lly zugeordnet. In allen Fällen können eindeutige Identifizierung unter Verwendung eines MS - Detektor ² erreicht werden.
      HINWEIS: Weitere Anzeichen für eine gute Kalibrierung umfassen eine flache Basislinie und keine Verunreinigung in dem Hexan spülen.
   3. Auflösen jedes PLFA Probenrückstand (enthalten in 10 ml Glasphiole vom Lipid Methylierungs Schritt 3) in 150 ul der ISTD-Lösung und Überführung in GC-Vial (alternativ 50 bis 75 & mgr; l verwendet werden, wenn Probenantwort erwartet wird, schwach zu sein, beispielsweise in sehr Sandböden).
   4. Stellen Sie die Probeninjektionsvolumen zu 2 ul. Stellen Sie die FID-Temperatur auf 300 ºC. Führen Sie die Proben einer Einlaßtemperatur von 250 ºC unter Verwendung von mit H ₂ als Trägergas (Fließgeschwindigkeit 1,3 ml / min) und einem Splitverhältnis von 30: 1.

Ergebnisse

Fettsäuren werden als X bezeichnet: YωZ, wobei X die Anzahl an Kohlenstoffatomen darstellt, Y die Anzahl der Doppelbindungen darstellt und Z bezeichnet die Position der ersten Doppelbindung vom aliphatischen (ω) Ende des Moleküls. Die Suffixe 'c' und 't' zeigen cis und trans-geometrische Isomere. Die Präfixe und Suffixe "a" und "i" beziehen sich auf anteiso und iso Verzweigung und Me und OH Methylgruppen und Hydroxylgruppen angegeben sind.

Post-GC beginnen, prüfen Sie, dass die Proben ausreichend ISTD erhalten, indem man die 10 der Suche: 0 Peak. Überprüfen Sie auch die Antwort der GC - Standards, dh die Fläschchen Hexan mit Zusatz von ISTD - Lösung enthält; diese sollten keine anderen Peaks haben. Interne Standardantwort sollte in allen Läufen ähnlich sein.

Abbildung 1 zeigt einen Vertretive Probelauf. Die große Hexanlösungsmittel Peak erscheint charakteristisch bei einer Retentionszeit (RT) ca. 1,8 min. Die ISTD Standardpeak (C10: 0) erscheint mit einer RT von 3,4 min, während C19: 0 RT von 16,2 min hat. Die GC-Analyse trennt die PLFAs basierend auf ihrer Kettenlänge, mit längeren Ketten langsamer eluierenden; zum Beispiel C18: 0 eluiert bei 14,4 min, während C16: 0 eluiert bei 10,8 min. Darüber hinaus kann dieses analytische Protokoll PLFAs basierend auf ihren Grad der Ungesättigtheit und die Position ihrer Doppelbindung trennen; beispielsweise C18: 0 eluiert bei 14,4 min, während C18: 1 9c und C18: 1 7c eluieren bei 14,0 und 14,1 min (Abbildung 1). Schließlich PLFAs ähnlicher Kettenlänge und Sättigung , aber unterschiedlichen Verzweigungskonfiguration (anteiso gegen iso) getrennt werden können; beispielsweise C15: 0i und C15: 0a eluieren bei 8,6 und 8,7 min (Abbildung 1).

Die Flächen der verschiedenen GC Peaks im seinin eine Tabelle portiert, um die Gaschromatogramm Informationen verarbeiten. Jeder identifiziert PLFA quantifiziert (nmol g ^-1 trockenem Boden) unter Verwendung der folgenden Gleichung:

wobei F ein Anpassungsfaktor ist, der ³² zwischen Fettsäuren in Betracht FID Selektivität und die Molarität Unterschiede nimmt, ist areaPLFA die Fläche des Peaks für jedes identifizierte PLFA, areaC10: 0 die Peakfläche für die ISTD ist (MeC10: 0), C10: 0 std hinzugefügt ist die Menge des ISTD (nmol) zu jeder Probe zugegeben vor dem GC laufen, wobei das Verhältnis (C19: 0 std hinzugefügt / C19: 0-Probe) entspricht der Erholung des PC (C19: 0 / C19: O) Surrogat-Standard, und das Probengewicht ist die Menge des ofengetrockneten Boden (g) zu dem ursprünglichen Zentrifugenröhrchen Probe und verwendet PLFAs zu extrahieren.

HINWEIS: Die Flächen unter den different Peaks werden als Peakflächen, Antwort oder% Reaktion in Abhängigkeit von der GC-System zum Ausdruck gebracht. Im Bereich relevant zu Boden PLFA Charakterisierung können Bereiche angenommen werden linear auf die Gewichte von Fettsäuren proportional zu sein; alternativ können kleine Korrekturfaktoren angewendet werden , um für FID ³² Selektivität berücksichtigen. Darüber hinaus, weil zunächst die Ergebnisse auf einer Gewichtsprozentbasis angegeben sind, müssen sie normiert werden molare Mengen zu ergeben. Einstellen für Molarität Differenzen unter Berücksichtigung der Molekulargewichte der einzelnen Fettsäuren erzielt wird; veröffentlichten Tabellen ³² und kommerzielle Software ³¹ auch zu helfen , zur Verfügung , wenn für Molarität zu normalisieren.

Die Menge des ISTD (nmol) zugesetzt kann zu jeder Probe weiter wie folgt berechnet:

C10: 0STD hinzugefügt = [ISTD] × V _{(STD hinzugefügt)}

wobei [ISTD] die Konzentration (nmol l ^-1) des MeC10: 0 (Methyldecanoat) in Hexan gelöst (siehe Schritt 3.4.1) und V _{(STD hinzugefügt)} das Volumen (L) der vorbereiteten ISTD - Lösung zugegeben vor jeder Probe in die GC Lauf (dh 150 ul nach 3.4.4 zu Schritt).

Die Menge an C19: 0 (nmol) in jeder Probe während der GC-Analyse entspricht:

wo areaC19: 0 ist die Peakfläche für C19: O, während die entsprechende Menge an C19: 0 (nmol) zu jeder Probe zu Beginn des Verfahrens PLFA Extraktion hinzugefügt (siehe Schritt 3.1.3) ist:

wo [19: 0] _Std (mg L ^-1 ) ist die Konzentration der C19: 0 nonadecanoate in Chloroform gelöst Surrogat - Standard (Schritt 3.1.3), V _{(19: 0 std zugegeben)} wird das Volumen der vorbereiteten Standard Surrogat zu Beginn der Extraktion PLFA zu jeder Probe gegeben Verfahren (vgl Schritt 3.1.3), M _{19: 0} ist das Molekulargewicht von 1,2-dinonadecanoyl- sn - glycero-3-phosphocholin (PC (19: 0/19: 0)).

HINWEIS: Ein Mol C19: 0 nonadecanoate Surrogat Standard ergibt zwei Mol C19: 0 nach dem Methylierungsschritt, während der C10: 0-Standard nach Methylierung hinzugefügt wird.

Die folgenden PLFAs werden in der Regel aus der Analyse von Boden mikrobiellen Gemeinschaften ausgeschlossen: i) PLFAs, die <14 C und> 20 ° C in der Länge, und ii) PLFAs mit weniger als 0,5% der gesamten in den Spitzenbereich. Sobald diese PLFAs ausgeschlossen wurden, können die Antworten von allen verbleibenden PLFAs summiert werden, um die Gesamt PLFA bi zu erhaltenomass (nmol g ^-1 trockenem Boden). Univariate Analyse von PLFA Daten (zB ANOVA, folgende Datentransformation als angemessen , um die Annahmen des Tests erfüllen durchgeführt wird ) verwendet werden können , insgesamt PLFA Biomasse und / oder PLFA Biomasse ausgewählter Gruppen unter Probengruppen / Behandlungen zu vergleichen. Zum Beispiel Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse für die relative Verteilung der verschiedenen PLFA Gruppen, wie geradkettige gesättigte PLFAs, gesättigten PLFAs entweder mit Mittelkette (10-methyl) oder terminale Verzweigung, und mono- oder polyungesättigte PLFAs sowie die Summe der gesamten PLFAs (nmol g ^-1 trockenem Boden). In diesem speziellen Beispiel das Alter der Bäume (die von Standort 1 an den Standort verringert 3) ist zu sehen, sowohl die Gesamt PLFAs zu beeinflussen und die relative Verteilung der verschiedenen PLFA Gruppen.

Zur Beurteilung Gesamtmuster in PLFA Zusammensetzung unter den Proben, multivariate Analyse aller PLFAs kann condu seincted ^33. Die PLFA Daten müssen als vor dem ausgewählten multivariate Analyse notwendig transformiert werden die Annahmen des statistischen Tests und der Fragestellung zu treffen angesprochen, beispielsweise eine Hellinger Transformation wird häufig verwendet , um die Daten zu relativieren. 3 zeigt Ergebnisse aus einem nicht -Metrik multidimensionale Skalierung (NMDS) Ordination der gleichen Daten , die in Abbildung 2 verwendet wurden; NMDS ist ein nicht-parametrisches, multivariates Verfahren, das von Rang Scores zwischen Proben 2- oder 3-dimensionale Positionierung von Datenpunkten auf der Basis der Ähnlichkeit erzeugt.

Abbildung 1. Repräsentative GC-FID - Chromatogramm. Ein von einem kultivierten Brown Chernozemic Boden erhaltene Probe wurde für diese Analyse verwendet. Die Retentionszeiten und entsprechenden PLFAs (in Klammern) und deren Spitzenbereich (pA) einwieder für repräsentative Erhebungen auf der Figur angegeben. Aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht alle Spitzen auf der Figur angezeigt werden, obwohl diese besondere Probe 33 identifiziert PLFAs ergab. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. relative Abundanz von sechs verschiedenen Klassen von PLFAs (% der gesamten PLFAs) und insgesamt PLFA Biomasse (nmol g ^-1 von trockenem Boden). Die Proben aus Wald Luvisolic Böden wurden für diese Analyse verwendet. Die Ergebnisse zeigen, größere Gesamt PLFAs für den Boden am Standort 1, die unter älteren Bäumen (> 50 Jahre) befindet, durch die Zwischen Alters (25 Jahre) Bäume (Seite 2) gefolgt, und nicht zuletzt die jüngste (10 Jahre) Bäume ( Seite 3). Relativ sind gesättigte PLFAs, die an der jüngstenWebsite, während mehr ungesättigte PLFAs vorhanden sind, auf dem ältesten Ort. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Nicht metrische multidimensionale Skalierung (NMDS) Ordination von PLFAs (unter Verwendung% der gesamten PLFAs Daten) für die Achsen 2 und 3 einer 3-dimensionalen Lösung. Dieses Ordination berechnet die gleichen Daten wie die für 2 Abbildung verwendet werden. Die jüngste Standort (Standort 3) trennt sehr deutlich von den älteren zwei Standorten (Sites 2 und 3), die Überlappung zeigen in ihrer PLFA mikrobiellen Gemeinschaft Zusammensetzung. Die Menge an Variation in der Daten PLFA Gemeinschaft von jeder Achse erläutert in Klammern eingeschlossen ist; 72,5% der Variation wird durch diese beiden Achsen für einen 3-Dimen erklärtnellen NMDS Lösung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Zur Minimierung und Vermeidung von Fehlinterpretationen der PLFA Daten müssen sorgfältig Daten-Screening durchgeführt werden, weil einige PLFAs, die im Boden mikrobiellen Gemeinschaft gefunden werden, sind auch in Einzel- und mehrzelligen eukaryotischen Organismen, wie Pflanzenwurzeln, Algen und Bodentiere. Darüber hinaus enthalten Archaea nicht PLFAs; stattdessen werden archaeal Membranen bestehen aus Phospholipid Etherlipide (PLELs). Folglich kann das Protokoll nicht PLFA archaeal Gemeinschaften verwendet werden, im Boden zu charakterisieren.

Zuordnen einzelner PLFAs zu spezifischen mikrobiellen Gruppen sollte mit Vorsicht erfolgen (siehe die 2011 Veröffentlichung von Frostegård und Kollegen ³⁴ für eine ausgezeichnete Diskussion über einige der Einschränkungen des PLFA Methode) ausgeübt werden. Stattdessen kann es sinnvoller sein, wie in Figur 2, zu einer Gruppe PLFAs basierend auf ihrer chemischen Struktur durchgeführt wurde, beispielsweise i) geradkettigen gesättigten PLFAs, ii) gesättigtem PLFAs mit mittleren chain (10-methyl) abzweig, iii) endständig verzweigten gesättigten Fettsäuren, iv) monoungesättigte PLFAs, v) polyungesättigte PLFAs und vi) Hydroxy-Fettsäuren.

Probengewicht müssen in einer bestimmten Bodenprobe, bezogen auf die Menge an extrahierbarem PLFAs eingestellt werden. Durch die nicht die Menge des Bodens in weniger mikrobiell aktiven Böden extrahiert Einstellung sind die Benutzer in Gefahr, keine ausreichende Anzahl von Antworten PLFA (Peaks) Erhalten genau die Gesamt mikrobiellen Gemeinschaft zu repräsentieren. mikrobiell aktiven Böden mit hohen Konzentrationen von PLFAs, werden die Benutzer bei Gefahr einer Überlastung der GC-Säule, wodurch verhindert genaue Quantifizierung von PLFAs In hoch. In beiden Fällen Bodenproben werden erneut analysiert für PLFAs. Ein guter Ausgangspunkt ist 0,5 g für organische Bodenproben (zB Waldboden) und etwa 3 g für Mineralbodenproben hinzuzufügen. Da die Menge an extrahierbarem PLFAs wird typischerweise auf die Menge an organischem Kohlenstoff in einem Boden, Probe wir enthalten korrelierteight kann basierend auf Bodenkohlenstoffgehalt eingestellt werden, beispielsweise 1 g Probe Mineralboden kann ausreichend sein , eine gute PLFA Quantifizierung zu erzielen , wenn Kohlenstoffgehalt 10-15% beträgt, während> 5 g erforderlich sein kann , wenn der Kohlenstoffgehalt ≤ 0,5 %. Es ist immer eine gute Idee, einen Probelauf mit ein paar Proben zu optimieren Probengewicht zu tun, bevor der gesamte Satz ausgeführt wird.

Häufige Fehlersuchstrategien für die PLFA Protokoll und GC-Analyse sind wie folgt. Wenn der GC - Chromatogramm Basislinie zu hoch ist, sollte der H ₂ Gaszylinder verändert werden. Wenn die Lösungsmittel oder ISTD Peaks aus dem Chromatogramm fehlt, könnte es ein Problem mit der Probeninjektion sein (zB gesteckt Spritze, Problem mit Autosampler, leer oder fehlende Fläschchen, Fehler mit Fläschchen Positionierung). Wenn mehr als drei Peaks in dem Verfahren / Probenleerwert ermittelt werden, gibt es eine Kontamination des Rohlings, und es gibt eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die gleiche Verunreinigung (en) in der Probe GC c vorliegenhromatograms. Finden der Kontaminationsquelle (in der Regel wäßrigen Medien) oder zumindest sicher, dass die Spitzen der Verunreinigung entspricht, aus der Probe entfernt Chromatogramme sind, und dass diese Peaks sind nicht in einer statistischen Analyse der Daten PLFA enthalten. Außerdem ist es eine gute Idee, Hexan Spülungen zwischen den Proben zu laufen, wenn Übertrag vermutet wird. Zusätzliche Peaks im Hexan Spülung zeigt an Übertrag (dh schwereren Komponenten aus vorherigen Lauf eluting).

Lipide sind besonders anfällig für Oxidation und besondere Sorgfalt muss während des gesamten Protokolls ausgeübt werden Proben von Luft und Licht ausgesetzt zu schützen, wie sie in der Dunkelheit zu speichern und sie unter Stickstoff gehalten wurde. Alle Proben und Blindproben müssen ausreichend C19 haben: 0 Ersatz-Standard. Eine fehlende C19: 0 Peak, entweder in Proben oder Rohlinge, deutet auf eine schlechte Erholung oder einen vollständigen Verlust von Analyten. Eine Antwort von C19: 0 in den Proben, die wesentlich niedriger als die m istethode / Probe-Rohlinge zeigt einen Verlust von Analyten an einem gewissen Punkt in der PLFA Methodik. Wenn mit einer schlechten C19 konfrontiert: 0 Erholung haben alle Aspekte des Verfahrens sorgfältig geprüft werden und untersucht, einschließlich der ersten Extraktion, alle Phasen der Probentransfer, SPE-Extraktion, Fettsäure-Methylierung, Trocknung, Lagerung und Manipulation der Probe, um die zu isolieren Stufe oder Stufen, wo Analyten verloren. Auf der anderen Seite kann es sein, dass die Gewinnung von einigen Bodenproben C19 ergeben kann: 0, wobei in diesem Fall Rückgewinnung des Surrogat-Standard hoch genug eingeschätzt werden kann. Während zwei Standards ((PC (19: 0/19: 0) und MeC10: 0) ist kein absolutes Erfordernis, haben wir dies sehr nützlich sein, wenn um zu beheben gefunden Solange die MeC10. 0 Antwort ausreichend ist Fehlerbehebung können, konzentrieren sich auf den Stufen vor der GC-Analyse.

Wie bereits erwähnt, muss Vorsicht geboten, wenn basiert ausschließlich ökologische Bedeutung und Ökosystem Beziehungen zu interpretieren auf Biomarkern ableitend von PLFA Daten, weil Reinkultur Studien zeigen, dass isolierte Bakterienstämme verschiedene Kategorien von PLFAs enthalten wird. Stattdessen Biomarkers PLFAs sollte als sinnvolle Ergänzung in einer Reihe von Beweisen betrachtet werden, wenn breitere ökologische Schlussfolgerungen zu ziehen. In der Literatur sind einzelne PLFAs als Biomarker für verschiedene mikrobielle Gruppen vorgeschlagen und verwendet. Gesättigte PLFAs werden typischerweise darstellen gram-positive Bakterien verwendet und einfach ungesättigten PLFA für gram-negative Bakterien verwendet. Erkannt Biomarker für gram-negative Bakterien umfassen Fettsäuren mit der Ungesättigtheit im ω5 oder ω7 Position, wie C16 einfach ungesättigt: 1ω7, C18: 1ω7 und C18: 1ω5. Zusätzlich kann cyclopropyl Fettsäuren auch repräsentativ für gram-negative Bakterien ³⁵ sein. 1ω5 + A:: 1ω7 + A: 0cyclo Daher PLFAs aus gram-negativen Bakterien können als gleich der Summe von A berechnet werden. Erkannt Biomarker für gram-positive Bakterien sind endständig sa verzweigteturated Fettsäuren, iso-verzweigten wie C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; oder anteiso-verzweigtkettige, wie C15: 0a und C17: 0a. Gesättigte PLFAs mit Mittelkette (10-methyl) Verzweigung, wie 10Me16: 0 und 10Me18: 0 sind charakteristisch in Actinomyceten ^36. Somit PLFAs aus gram-positiven Bakterien kann als gleich der Summe von A berechnet werden: 0 (ISO, anteiso, 10-methyl).

Viele Biomarker im Zusammenhang mit Pilz PLFA werden oft mehrfach, aber einige Pilz-Biomarker sind einfach ungesättigte. Zum Beispiel in Bezug auf die pilzliche einfach ungesättigten Biomarkern, C16: 1ω5 ist als Indikator für arbuskulären Mykorrhiza - Pilzen (AMF) ^37, C18 identifiziert: 1ω9 in saprophytischen Pilzen vorkommt, und Ectomycorrhizae enthalten typischerweise C16: 1ω9. Die Anwesenheit von di-ungesättigten C18: 2ω6,9 tritt häufig in Verbindung mit C18: 1ω9 und auch korreliert gut mit dem Pilz Sterol Ergosterol, das anzeigt, dass C18: 2ω6,9 adäquat darstellen ectomycorrhizae und saprophytischer ³⁸ Pilze. Die tri-ungesättigten C18: 3ω 6,9,12 wurde auch als ein Biomarker für die Pilze ¹⁰ verwendet wurden; Jedoch C18: 3ω6c kann in anderen eukaryotischen Organismen, einschließlich Pflanzen und Algen gefunden werden, obwohl es in der Regel nicht in Bakterien gefunden wird. Im Begriff des Bodens Protisten, C20: 4ω6c hat als Protisten Biomarkers ³⁹ erkannt wurde, obwohl andere Arbeit C20 zu erkennen ist fehlgeschlagen: 4ω6c selbst wenn tragfähige Protisten Populationen visuell bestätigt wurden mittels Lichtmikroskopie ^40.

Viele Studien adressieren ökologische Fragen zur mikrobiellen Gemeinschaft Gesamt Boden im Zusammenhang mit multivariaten Ordination Techniken als PLFA Datenanalyse-Tool verwenden. Bei dieser Methode haben einige Autoren gewählt , um seltene PLFAs aus dem Datensatz ausschließen , indem PLFAs zu entfernen , die ⁴ in weniger als 5% der Proben vorliegen. Die normalen gesättigten Fettsäuren C16: 0 und C18: 0 sind reichlich in allen Bodenmikroorganismen, einschließlich Prokaryoten und eukaryotes. Daher entscheiden sich einige Forscher diese PLFAs vor der statistischen Analyse auf der Basis zu entfernen, die sie nicht empfindliche Indikatoren für die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft sein kann - obwohl C16: 0 und C18: 0 sind noch aufgenommen werden, wenn alle PLFAs Summieren für ein Index der mikrobiellen Biomasse. Im Begriff der statistischen Analysen, entscheiden sich viele Forscher eine nicht-metrische multidimensionale Skalierung (NMDS) Ordination durchzuführen , wie diese Technik gut geeignet , um Daten, die normalerweise nicht ³³ verteilt werden kann. Weitere Analysen zu kategorischen Variablen im Zusammenhang kann Indikatorarten Analyse umfassen, die das Auftreten spezifischer PLFAs kategorischen Gruppierungen und Multi Antwort Permutation Verfahren (MRPP) beziehen können, die Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen den mikrobiellen Gemeinschaften zugewiesen kategorische Gruppen bestimmen helfen können. Zusätzlich kann multivariate Regressionsbäume (MRT) besonders nützlich sein, wenn der Einfluss von mehreren experimentellen Variablen oderBehandlungen benötigt als mögliche Erklärungsvariablen ⁵ (zB Bodenbeschaffenheit, Feuchtigkeit, Rekultivierung Alter) bewertet werden.

Einmal eingerichtet, ist das PLFA Protokoll eine relativ einfache analytische Methode, die sehr nützlich sein kann, wenn der Bodenmikroorganismen Reaktion auf Umweltveränderungen und anthropogene Störung zu quantifizieren. Während molekulare Techniken wie genetischen Fingerabdrucks besser geeignet , um die detaillierte Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften sind, stellt die PLFA Verfahren den Vorteil von ³⁴ quantitative Informationen über den Gesamt mikrobiellen Biomasse bereitstellt. In unserem Forschungslabor kann eine Person bequem eine Reihe von 20 Proben über 4 Tage zu verarbeiten, und wir haben das Protokoll vorgestellt, hier zu sein eine robuste und reproduzierbare Technik zu beurteilen bodenbiologische Qualität gefunden.

Die Leistung des PLFA Verfahren kann stark durch Kopplung an stabilen Isotopenanalyse ^{41, 42} verlängert werden. Genauer gesagt, zusätzlich of ¹³ C-markierte Substrate Böden ermöglicht die Quantifizierung des Substrats Inkorporation in Bodenmikroorganismen obwohl die Isotopenanalyse von Einzel PLFAs ^41. Außerdem scheint dieses Verfahren ein sehr vielversprechendes Werkzeug zur Aufklärung trophischen Verbindungen in Bodennahrungsstege ⁴² sein.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports			Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen	Praxair	Ni-T	Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap	Fisher Scientific	05-569-3	Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D	Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-4	Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band	Grand & Toy	42199	1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000			Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C)	Revco	ULT2586-5-A36	Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column	Agilent Technologies		Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column	Agilent Technologies	19091B-105
Gas chromatograph insert	Agilent Technologies	5183-4692	Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid	Agilent Technologies	5188-6592	Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes	Fisher Scientific	H292-4	Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3))
Hot water bath -Isotemp 220	Fisher Scientific		Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-2	Used for freeze drying samples
KOH, ACS grade	Fisher Scientific	P250-500	Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes	Barnstead/Thermolyne	3,625,485	Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard	Sigma-Aldrich	299030-2.5G	Used for GC analysis
Methanol	Fisher Scientific	A454-4	Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software	MIDI, Inc., Newark, DE		Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System	Lab Sphere Inc	1200-A	Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves	Fisher Scientific	27-058-52	Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter - Accumet XL200	Fisher Scientific		Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette	Socorex	832.02	Used throughout Steps (1 per sample)
250 µl gastight syringe	Hamilton	1725	Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves	Sigma-Aldrich	Z529575	For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column	Agilent Technologies	5982-2265	Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached	Sigma-Aldrich		Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615	Barnstead International	M37615	Used in Steps 1-3
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade	Sigma-Aldrich	270733-4L	Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags	Fisher Scientific	01-812-120	Used in sample collection - 2 bags required per sample collected