Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Resumen

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introducción

Una limitación de los actuales tratamientos para el VIH-1 es que deben ser administrados crónicamente para prevenir la progresión de la enfermedad. Trasplante de VIH-1 resistentes a los linfocitos T, o células madre hematopoyéticas, tiene el potencial de proporcionar el control a largo plazo del VIH-1 de replicación en ausencia de la terapia con medicamentos 1,2 y también puede ser un enfoque eficaz para alcanzar una cura de VIH-1 3. Una forma de hacer que las células resistentes al VIH-1 de replicación es insertar uno o más genes que codifican anti-VIH-1 ARN o péptidos en células de un individuo infectado durante un trasplante autólogo 4. Varios genes candidatos anti-VIH-1 han sido diseñados con algunos ensayos clínicos que entran en combinaciones de dos o tres 5 6, para prevenir el desarrollo de resistencia del VIH-1 a un solo gen.

Anti-VIH-1 ARN se encuentran entre los mejores candidatos para la terapia génica de combinación debido a su bajo potencial para provocar respuestas inmunes y porquese transcriben a partir de secuencias de genes muy cortos. Algunos ARN anti-VIH-1 se han diseñado para actuar sobre la entrada y la integración viral. Sin embargo, la mayoría de los anti-VIH-1 ARN diana pasos posteriores a la integración en el ciclo de vida viral (Figura 1). Inhibidores de la post-integración incluyen ARN señuelo, apuntando a los VIH-1 proteínas reguladoras Tat o Rev 1, y ARN antisentido basados ​​en, dirigidos a diferentes sitios en el VIH-1 ARN, como las ribozimas 7, 8 y shRNAs U1i ARNs 9. Los métodos que se han utilizado para comparar la eficacia de los anti VIH-1 ARN incluyen la supervisión de la replicación viral en las células transducidas con genes que codifican para los ARN candidatos y medición de la producción viral en células transfectadas transitoriamente con plásmidos que expresan ARN candidatos y un plásmido de expresión del VIH-1 10 -13. Hemos utilizado anteriormente un ensayo de producción de VIH-1 para detectar el VIH-1 RNA para el nuevo ribozima sitios diana 13-15. Estos métodos ya se han refinado para optimizar el formato de un ARNmolécula de interferencia expresa a partir de ADN plásmido como un shRNA o entregada como un ARNsi sintético 16. El ensayo mide la producción de virus maduros a partir de células 293T de riñón embrionario (HEK) humanos, y se puede utilizar para comparar los efectos de los inhibidores que se dirigen a pasos posteriores a la integración en el ciclo de replicación del VIH-1 (Figura 1). Para inhibidores que se dirigen a los pasos de pre-integración, se necesitan ensayos alternativos, tales como un ensayo de infectividad celular TZM-bl 17 para evaluar la eficacia antiviral.

Las principales preocupaciones de seguridad para la entrega de los anti-VIH-1 ARN en la clínica incluyen los posibles efectos fuera de la meta de ARN o proteínas humanas, y la activación de sensores inmune innata. Para evaluar la toxicidad de anti-HIV-1 siRNAs, hemos utilizado un ensayo de viabilidad celular en diferentes líneas celulares 16. También se midió la activación de los sensores inmunes de ARN bicatenario, ARN proteína quinasa activada por R (PKR) y Toll like receptor 3 (TLR3), así como exsión del gen de interferón estimulado, p150 ADAR1. Estos ensayos se pueden usar para confirmar que la eficacia de anti-HIV-1 ARN no se debe a efectos indirectos sobre la viabilidad celular o la activación inmune sensor. También son útiles en la exclusión de los ARN candidatos con los potenciales efectos tóxicos de un mayor desarrollo.

En los siguientes protocolos, procedimientos para identificar nuevos ARN terapéuticas y optimizar el formato de los existentes se describen. Los métodos son útiles para los inhibidores de la post-integración basadas ARN de detección de VIH-1 de replicación y pueden ser adaptados a la pantalla de otros inhibidores de la post-integración, tales como pequeñas moléculas de direccionamiento Rev exportación mediada por ARN viral 18 o CRISPR / sistemas de Cas diseñados para dirigir integrada VIH-1 DNA 19.

Protocolo

1. Las células y transfecciones

  1. Cultura células HEK 293T en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Preparar una suspensión 2 x 10 5 células / ml en el medio de cultivo celular. Añadir 500, 100 y 1.000 l de la suspensión celular a cada pocillo de 24 pocillos, placas de 96 pocillos y 12 pocillos, para la producción viral, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente (Figura 2A).
  2. Hacer girar suavemente las placas y se incuban O / N a 37 ° C con 5% de CO2. Se cultivan las células a 50-70% de confluencia.
  3. De acuerdo con un plan de la transfección, se preparan diluciones de ARN de prueba y sus controles en tubos de 1,5 ml (micro ejemplo, la Figura 2B).
    1. Para el ensayo de la producción viral, preparar una 10 ng / l de dilución de un plásmido de expresión del VIH-1 y añadir 10 l a cada tubo. Siguiente preparar 5 M diluciones de ARN de ensayo y un control negativo RNA. Añadir 2,5 o 10 l de cada dilución de ARN de ensayo y de control negativo a los tubos correspondientes para 25 ó 100 nM concentraciones finales.
    2. Para el ensayo de viabilidad celular, preparar 5 M diluciones de ARN de prueba y un 10 mg / ml de dilución de la RNA control positivo, de bajo peso molecular de poli I: C. Añadir 2 l de ARN de ensayo o diluciones de ARN de control positivo a los tubos correspondientes para 100 nM o concentraciones finales ml 200 g /, respectivamente.
    3. Para el ensayo de la activación inmune, añadir 20 l de RNA de ensayo o las diluciones de ARN de control positivo preparados en la etapa 1.3.2. a los tubos correspondientes para 100 nM o 200 mg / ml concentración final, respectivamente.
      Nota: Para las pruebas de ARN plásmidos de expresión, preparar 10 ng diluciones / l en lugar de las 5 micras diluciones de ARN de ensayo, dando cantidades finales de 25 y 100 ng para el paso 1.3.1. y 100 ng para los pasos 1.3.2. y 1.3.3.
  4. Añadir 50, 25 o 75 l de DMEM a cada tubo para la transfección viral producción, la viabilidad celular y ensayos de activación inmune, respectivamente. Para los ensayos de producción viral, llevar las células y los tubos de transfección preparados a un nivel 3 de laboratorio bio-seguridad (BSL3) antes del siguiente paso.
  5. Añadir 2 l de la secuencialmente reactivo de transfección a los tubos de transfección y se incuba de 15 a 20 min para permitir que los complejos a la forma. Ver la Tabla de materiales para el reactivo de transfección específico a utilizar.
  6. Añadir toda la mezcla de transfección de cada tubo micro gota a gota a las posiciones correspondientes en las placas de cultivo celular. Hacer girar suavemente y se incuban las placas durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
  7. Medir el VIH-1 de producción (sección 2), la viabilidad celular (sección 3) y la activación inmune (sección 4) en las placas de cultivo celular (Figura 2C).

2. Ensayo de la producción viral

  1. Eliminar las placas de cultivo celular de 24 pocillos de la incubadora y agitar suavemente las placas en el interior del cultivo celular BSL3capucha. Transferir 150 l de sobrenadante de cada pocillo a un pocillo correspondiente en una placa de 96 pocillos de fondo plano, que se utiliza para cuantificar la producción de VIH-1.
    Nota: ensayos de cuantificación virales comunes incluyen la medición de la expresión de la proteína de la cápside del VIH-1 (p24) por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) 20, la cuantificación de ARN viral mediante transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) 21 y la medición de la actividad de la enzima de VIH-1 RT. Los pasos 2.2 a 2.5 explicar los métodos para cuantificar VIH-1 RT actividad 13,15,16.
  2. Transferencia de 5 l de sobrenadante a los pocillos correspondientes en una placa de 96 pocillos, que contiene 25 l de un cóctel viral interrupción 15 (Tabla 1). Incubar la mezcla durante 5 min a TA y la transferencia de la placa a una estación de trabajo radiactividad.
    Nota: El paso 2.2. sólo es necesario si una estación de trabajo radiactividad no está disponible en el laboratorio NBS3. Si las placas no tienen que ser retirados de laNBS3 laboratorio, continúe en el paso 2.3. y añadir 50 l de cóctel de interrupción radiactivo / viral (Tabla 1) en lugar de los 25 l de cóctel radiactivo.
  3. Preparar un cóctel radiactiva 15 (Tabla 1), y añadir 25 l a cada pocillo de sobrenadante viral y cóctel de interrupción. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 horas.
  4. Punto 5 l de la mezcla de reacción en las casillas correspondientes en una fibra de vidrio Di Etil amino etil (DEAE) Filtermat de papel y permitir que las gotas se sequen durante 10 min. Detectar la mezcla de reacción en cada otra cuadrado, de manera que no hay dos muestras Boarder directamente entre sí. Esto ayuda a evitar el cruce entre las muestras para determinar las cuentas por minuto (cpm) en el paso 2.6.
  5. Lavar los papeles 5X para 5 min con tampón 2x citrato de sodio salino (SSC) (Tabla 1), seguido de dos lavados de 1 min con 95% de etanol. Permitir que los papeles se sequen y sellan en bolsas de muestra.
  6. Clip bolsas de muestras containing el papel Filtermat en un casete e inserte el cassette en un contador de centelleo de microplacas. Poner el contador a leer cpm de 32P con la fecha de referencia que establece el lote de [32P] dTTP utilizado en el experimento. Seleccione el que las muestras de leer Cómo utilizar el mapa plato y activar el contador.
  7. Para cualquier método de cuantificación viral, dividir los valores obtenidos para cada ARN de ensayo por el control negativo adyacente y multiplicar este valor por 100 para obtener el porcentaje de inhibición de producción de VIH-1 para cada réplica de los ARN de prueba. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo a diferentes concentraciones se proporciona en la Figura 3.

3. ensayo de viabilidad de la célula

  1. Retire las placas de 96 pocillos de la incubadora y se añaden 20 l de 5 mg / ml de MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio) diluido en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada pocillo. Se incuban las placas fo 3 horas a 37 ° C.
  2. Añadir 150 ml de isopropanol acidificado con detergente (1% NP-40, HCl 4 mM en isopropanol) a cada pocillo e incubar las placas durante 2 horas a RT.
  3. Determinar la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
  4. Calcular el metabolismo de MTT relativa para cada ARN de control positivo de la prueba y dividiendo el valor obtenido para cada muestra por su control de transfección adyacente. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo y un control positivo se proporciona en la Figura 4.

4. Ensayo de Activación Inmune

  1. Retire las placas de 12 pocillos de la incubadora y aspirar el medio de cultivo. Lavar suavemente las células dos veces con DPBS y añadir 70 l de tampón de lisis frío 22 (incluyendo inhibidores de la proteasa y de fosfatasa, la Tabla 1) a cada pocillo. Se incuban las placas durante 10 minutos en hielo.
  2. Transferir lisados ​​celulares para microtubos y rápido congelarlos por inmersión de latubos en nitrógeno líquido. Dejar que las muestras se descongelen y se repiten durante 2 ciclos de congelación y descongelación más para un total de 3.
  3. Centrifugar los lisados ​​durante 15 min a 4 ° C, 15.700 xg, para sedimentar los residuos celulares. Transferir el sobrenadante a tubos nuevos micro y determinar la concentración de proteína usando el método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24.
  4. Resolver 75 g de proteína de cada muestra en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y la transferencia a una membrana de nitrocelulosa como se ha descrito previamente 25,26.
  5. Después de la electroforesis y la transferencia a una membrana, revelar bandas de proteínas mediante la incubación de la membrana en Ponceau S (Tabla 1) durante 1 min seguido de lavado en agua doblemente destilada. Usar las bandas y la escalera de proteína como una guía para cortar la membrana en 80 y 55 kDa.
    Nota: En el paso 4.4 muestras se pueden ejecutar en 16 x 18 cm 2 geles abajo a 34 kDa, de manera que es fácil de cortar la membrana en las posiciones especificadas y no cortar a través de labandas de interés. Por otra parte, varios geles se pueden ejecutar con las mismas muestras para evitar el corte de la membrana.
  6. Lavar la tinción Ponceau S con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabla 1). Añadir TBST con leche no grasa al 5% para cubrir completamente las membranas. Se incuban las membranas a temperatura ambiente con agitación durante 1 hr.
  7. Se incuban las membranas de O / N en TBST con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y los anticuerpos se diluyó a 1 en 1000 contra ADAR1 (110 y 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), y fosfo-IRF3 (47 kDa), para las piezas superior, media e inferior de la membrana, respectivamente.
  8. Lavar las membranas 5X para 5 min con TBST y se incuban en TBST con leche 5% sin grasa y de cabra anti-conejo anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (diluido a 1 en 5000) durante 1 hora.
  9. Lavar las membranas 5x durante 5 min con TBST y aplicar la solución de electroquimioluminiscencia (ECL) para visualizar las bandas en las películas según las instrucciones del fabricante.
  10. Después de visualizar las bandas de proteína en las películas, lavar las piezas intermedias de la membrana durante 10 min con una solución de anticuerpo de extracción. Se incuban las membranas O / N en TBST con BSA al 3% y anticuerpos contra PKR total de (a 1 en 500) y IRF3 (a 1 de cada 1.000), por el medio y piezas inferiores, respectivamente. Repita los pasos 4.8. y 4.9. utilizando marcado con peroxidasa de cabra anti-ratón en lugar del anticuerpo secundario anti-conejo para la membrana de PKR (medio).
  11. Lavar la pieza inferior de la membrana 5x durante 5 min con TBST y se incuba la membrana en TBST con BSA al 3% durante 1 hora con un anticuerpo contra actina (diluido a 1 en 5000). Repita los pasos 4.8. y 4.9. utilizando marcado con peroxidasa de cabra anti-ratón en lugar del anticuerpo secundario anti-conejo. Un ejemplo de los resultados que comparan diferentes ARN de ensayo y un control positivo se proporciona en la Figura 5. Ver la Tabla de materiales para los anticuerpos específicos para ser utilizados.

Resultados

Un esquema general de los procedimientos se muestra en la Figura 2 con un plan de transfección ejemplo para tres ARN de prueba y un ARN de control proporcionada en la Figura 2B. Para los ensayos de producción y la viabilidad celular virales, La lectura para cada construcción de prueba es normalizada a un control negativo. Las réplicas se transfectan en conjuntos, de modo que cada ARN de ensayo se normalizó a su control negativo adyacente. Esto se ha...

Discusión

El ensayo de la producción de VIH-1 descrito se realizó utilizando células HEK293T (Figura 2) y es similar a los ensayos utilizados para la detección de VIH-1 RNA de ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, siRNA 30, y ARN U1i sitios 11,31 objetivo. El uso de diferentes métodos para cuantificar la producción de VIH-1, la mayoría de estudios han medido la producción viral 48 horas después de la co-transfección de un plásmido de expresión de VIH-1 con los AR...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

El trabajo presentado aquí fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (otorga DCB-120266, PPP-133377 y 348967 a HBF-AG).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

Referencias

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Infecci nN mero 115el VIH 1la terapia de RNAla eficaciala toxicidadla estimulaci n inmunela viabilidad celularMTTPKRADAR1TLR3IRF3la fosforilaci n

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados