Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Özet

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Giriş

Mevcut HIV-1 terapileri sınırlaması, kronik hastalığın ilerlemesini engellemek için de uygulanabilir olmasıdır. HIV-1 karşı T lenfosit veya hematopoietik kök hücre nakli, ilaç tedavisi 1,2 yokluğunda HIV-1 replikasyonu, uzun süreli kontrolünü sağlama potansiyeline sahiptir ve aynı zamanda, bir HIV-1 ilacı elde etmek için etkili bir yaklaşım olabilir 3.. HIV-1 replikasyonu dirençli hücre oluşturmak için bir yolu, otolog transplant 4 sırasında enfekte bireyin hücrelerine anti-HIV-1 RNA veya peptitler kodlayan bir ya da daha fazla gen eklemektir. Çeşitli aday anti-HIV-1 genlerinin herhangi bir tek genin HIV-1 direnç gelişmesini önlemek için, iki adet 5 ya da üç 6 kombinasyonları bazı giren klinik çalışmalarda dizayn edilmiştir.

Anti-HIV-1 RNA immün yanıtları ortaya çıkarmak için düşük potansiyel ve onlar için kombine gen terapisi için en iyi adaylar arasındaÇok kısa bir gen sekanslarından transkribe edilmektedir. Bazı anti-HIV-1 RNA, viral giriş ve bütünleşmesini hedeflemek üzere dizayn edilmiştir. Bununla birlikte, en anti-HIV-1 RNA, viral yaşam çevriminde sonrası entegrasyon adımlar (Şekil 1) hedefler. Sonrası entegrasyon inhibitörleri ribozimler 7, 8 ve shRNAs U1i RNA'lar 9 olarak, HİV-1 düzenleyici proteinleri tat veya rev 1 ve antisens dayalı RNA hedef HIV-1 RNA farklı sitesi hedef, yem RNA içerir. Anti-HIV-1 RNA etkinliğini karşılaştırmak için kullanılmış olan yöntemler genlerin aday RNA'lar kodlayan ve viral geçici aday RNA ifade eden plasmidler ile transfekte edilen hücrelerde üretim ve HIV-1 ifade plazmid ölçüm ile dönüştürülmüş hücrelerin viral replikasyonu izlenmesini, 10 -13. Daha önce yeni bir ribozim, hedef siteye 13-15 HIV-1 RNA taranması için bir HIV-1 üretimi deneyi kullandık. Bu yöntemler beri bir RNA biçimini optimize etmek için rafine edilmişgirişim molekülü, bir shRNA plazmid DNA'sından ifade edilen ya da sentetik bir siRNA 16 olarak verilir. Deney insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerinde olgun virüs üretimini ölçer ve (Şekil 1), HIV-1 replikasyon döngüsünde sonrası entegrasyon evreleri hedefleyen önleyicilerinin etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Ön entegrasyon basamakları hedefleyen inhibitörleri, böyle bir tzm-bl hücre enfektivite tahlil 17 gibi alternatif deneyler antiviral etkinliğini değerlendirmek için gereklidir.

Klinikte anti-HIV-1 RNA teslimi için önemli güvenlik kaygıları, insan RNA veya protein ve doğuştan gelen bağışıklık sensör aktivasyonu üzerindeki potansiyel hedef dışı etkiler bulunmaktadır. Anti-HIV-1 siRNA'lar toksisitesini değerlendirmek için, farklı hücre hatları 16 bir hücre canlılığı deneyi kullandık. Ayrıca, iki iplikçikli bir RNA bağışıklık sensörler aktivasyonu ölçülmüştür RNA aktive edilmiş protein kinaz R (PKR) reseptör 3 (TLR3) Toll benzeri gibi exinterferon pression geni ADAR1 P150 uyarılmış. Bu deneyler, anti-HIV-1 RNA etkinliği hücre canlılığı veya immün sensör aktivasyon dolaylı etkileri nedeniyle olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Ayrıca, daha da geliştirilmesi, potansiyel toksisite aday RNA'ların hariç yararlıdır.

Aşağıdaki protokollerde, prosedürler yeni tedavi RNA'lar belirlemek ve mevcut biçimi açıklanmıştır optimize etmek. Yöntemleri, HIV-1 replikasyonu tarama RNA temelli sonrası entegrasyon inhibitörleri için faydalı olan ve bu tür viral RNA 18 ya da CRISPR Rev aracılı ihracat hedefleme küçük moleküller gibi diğer sonrası entegrasyon inhibitörlerinin taranması için adapte edilebilir / tasarlanan Cas sistemleri entegre hedef HIV-1 DNA'sı 19.

Protokol

1. Hücre ve Transfeksiyonlar

  1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) içinde kültür HEK 293T hücreleri,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. Hücre kültürü ortamı içinde 2 x 10 5 hücre / ml'lik bir süspansiyon hazırlayın. Her çukuruna hücre süspansiyonundan 500, 100 ve 1000 ul, 24 oyuklu, 96 gözlü, 12 gözlü levhalar, viral üretimi, hücre canlılığı ve immün aktivasyon deneyleri sırasıyla (Şekil 2A) için.
  2. Yavaşça girdap plakalar ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de / Ç N onları kuluçkaya yatmaktadır. % 50-70 confluency hücreleri büyür.
  3. Bir transfeksiyon planına göre, 1.5 ml mikro tüpler (örneğin Şekil 2B) test RNA'lar ve kontrol seyreltileri hazırlanır.
    1. Viral üretimi deneyi için, bir HIV-1 ifade plazmidinin 10 ng / | il seyreltme hazırlanması ve her bir tüpe 10 ul ekle. Sonraki 5 uM test RNA'lar dilüsyonları ve negatif kontrol RN hazırlamakC. 25 ya da 100 nM nihai konsantrasyonlarda, ilgili tüplere her bir test RNA ve negatif kontrol seyreltme 2.5 ya da 10 ul ekle.
    2. C: Hücre canlılığı deneyi için 5 uM test RNA dilüsyonları ve pozitif kontrol RNA, düşük molekül ağırlıklı poli I bir 10 mg / ml seyreltme hazırlar. sırasıyla, 100 nM veya 200 ug / ml nihai konsantrasyonları, tekabül eden tüpler test RNA ya da pozitif kontrol RNA dilüsyonları 2 ul ekle.
    3. immün aktivasyon deneyi için, deney RNA veya adım 1.3.2 hazırlanan pozitif kontrol RNA dilüsyonları 20 ul ekle. sırasıyla, 100 nM veya 200 ug / ml nihai konsantrasyon, tekabül eden tüplere.
      Aşama 1.3.1 ng 25 ve 100 nihai miktarda vererek, test RNA ekspresyon plazmidleri, deney RNA'lar 5 uM dilüsyonları yerine 10 ng / | il dilüsyonları hazırlamak: edin. 100 adım 1.3.2 ng. ve 1.3.3.
  4. Viral ürünler için, her transfeksiyon tüpüne DMEM 50, 25 ya da 75 ul eklesırasıyla uction, hücre canlılığı ve bağışıklık aktivasyon tahlilleri. Viral üretim deneyleri için, bir sonraki adımdan önce bir biyo-güvenlik seviyesi 3 (BSL3) laboratuvara hücreleri ve hazırlanan transfeksiyon tüpleri getirmek.
  5. transfeksiyon tüplerine transfeksiyon reaktif sırayla 2 ul ekleyin ve kompleksleri oluşturmak için izin vermek için 15 ila 20 dakika inkübe edin. Belirli transfeksiyon reaktif Malzemesi Tabloya bakınız kullanılacak.
  6. damla damla hücre kültür plakaları içinde karşılık gelen pozisyonlarda, her mikro tüp tamamını transfeksiyon karışımı ekleyin. Yavaşça girdap ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edin.
  7. Hücre kültürü plakaları (Şekil 2C), HIV-1 üretimini (Bölüm 2), hücre canlılığı (bölüm 3) ve immün aktivasyon (bölüm 4) ölçün.

2. Viral Üretim Deneyi

  1. inkübatör 24-iyi hücre kültür plakaları çıkarın ve BSL-3 hücre kültürü içindeki girdap plakalar hafifçedavlumbaz. HIV-1 üretimini ölçmek için kullanılacak olan 96-gözenekli düz tabanlı plaka içinde de karşılık gelen her gözden üst fazın 150 ul aktarın.
    Not: Genel viral miktar deneyleri, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), 20, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) 21 yoluyla viral RNA miktarının HIV-1 kapsid proteini (p24) ekspresyonunu ölçmek ve aktivitesinin ölçülmesi bulunmaktadır HIV-1 RT enziminin. 2.2 2.5 HIV-1 RT aktivitesinin 13,15,16 ölçmek için yöntemler açıklar Adımları.
  2. Aktarım, bir viral bozulması kokteyli 15 (Tablo 1) 25 ul ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka gözenekleri içinde karşılık gelen süpernatan 5 ul. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı ve radyoaktivite iş istasyonuna plaka aktarın.
    Not: Adım 2.2. Bir radyoaktivite iş istasyonu BSL3 laboratuarda mevcut değilse gereklidir. Plakalar kaldırılması gerekmiyorsaBSL3 laboratuar, 2.3 adıma geçin. ve radyoaktif kokteyl 25 ul yerine viral / radyoaktif bozulması kokteyli (Tablo 1) 50 ul ekle.
  3. Radyoaktif bir kokteyl 15 (Tablo 1) Hazırlama ve viral süpernatan ve baskıyı kokteyl her çukuruna 25 ul ekle. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Nokta 5 cam elyaf Di Etil Amino Etil (DEAE) Filtermat kağıdı karşılık gelen kareler üzerine reaksiyon karışımının ul ve noktalar 10 dakika kurumasını bekleyin. hiçbir iki numune doğrudan birbirlerine yatılı böylece her meydanda reaksiyon karışımı nokta. Bu aşamada 2.6 dakikada (cpm) başına sayıları belirlerken örnekler arasında çapraz-over önlemeye yardımcı olur.
  5. Kağıtlar% 95 etanol ile iki kez 1 dakika yıkama yapılmıştır 2x tuzlu su, sodyum sitrat (SSC) tampon maddesi (Tablo 1) 5 dakika için 5 kat yıkayın. kağıtlar kurumaya ve örnek torbalarına bunları mühürlemek için izin verir.
  6. Klip örnek çanta coBir kaset içine Filtermat kağıt ntaining ve bir mikroplaka sintilasyon sayacı içine kaset takın. Deneyde kullanılan [32 P] dTTP parti için sağlanan referans tarihi ile 32 P cpm okumak için sayaç ayarlayın. plaka haritayı kullanarak okuma ve sayaç başlatmak için hangi örnekler seçin.
  7. herhangi bir virüs ölçümü yöntemi için, komşu negatif kontrol ile her test RNA için elde edilen değerler bölmek ve test RNA'ların her tekrarında HIV-1 üretiminin yüzde inhibisyonunu elde etmek için 100 ile bu değeri çarpın. Farklı konsantrasyonlarda farklı test RNA karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 3'te verilmektedir.

3. Hücre Canlılık Testi

  1. / Ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiyazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromid) Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltildi (inkübatör, 96 gözlü levhalar çıkarın ve 5 mg 20 ul her bir kuyunun DPBS). f inkübeveya 37 ° C'de 3 saat.
  2. deterjan (% 1 NP-40, izopropanol içinde 4 mM HCI) her ile asitleştirildi izopropanol 150 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
  3. Bir mikrolevha spektrofotometre 570 nm'de absorbans belirler.
  4. bitişik transfeksiyon kontrolü ile her numune için elde edilen değer bölünerek, her pozitif kontrol ve test RNA göreceli MTT metabolizmasını hesaplayın. Farklı test RNA ve pozitif kontrol karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 4'te verilmektedir.

4. Bağışıklık Aktivasyon Testi

  1. inkübatör 12-kuyu plakaları kaldırmak ve kültür ortamı aspire. Yavaşça DPBS hücreler iki kez yıkayın ve her bir (proteaz ve fosfataz inhibitörleri, Tablo 1 de dahil olmak üzere), soğuk lisiz tamponu 22 70 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin.
  2. mikro tüpler hücre lizatları aktarın ve hızlı daldırarak bunları dondurmaksıvı nitrojen içinde borular. Numuneler Çözülme ve 3 olmak üzere toplam 2 daha donma çözülme döngüleri için tekrar izin verin.
  3. Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 4 ° C'de, 15.700 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj lizatları. Yeni bir mikro tüpler süpernatantı aktarın ve Coomassie mavisi (Bradford) yöntemini 23,24 kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
  4. % 10 denatüre edici poliakrilamid jel içinde her bir numunenin proteinin 75 ug çözmek ve daha önce 25,26 tarif edildiği gibi bir nitroselüloz zara transfer.
  5. Bir membrana elektroforezi ve aktarımı sonra, iki kez distile su ile yıkama, ardından 1 dakika boyunca Ponceau S (Tablo 1) 'de membran inkübe edilerek protein bantları görülebilir. 80 ve 55 kDa zar kesmek için bir kılavuz olarak bantlar ve protein merdiven kullanın.
    Not: Adım 4.4 örnekleri 16 x 18 cm 34 kDa aşağı 2 jelleri çalıştırılabilir, belirtilen pozisyonlarda membran kesip kesip değil kolay şekildeilgi bantları. Alternatif olarak, çeşitli jeller zarı kesme önlemek için aynı örnekleri ile çalıştırılabilir.
  6. % 0.05 Tween 20 (TBST, Tablo 1) ihtiva eden Tris-tamponlu tuzlu su ile Ponceau S boyama yıkayın. Tamamen zarları kapsayan% 5 yağsız süt ile TBST ilave edin. 1 saat boyunca çalkalama ile, oda sıcaklığında membranlar inkübe edin.
  7. membranlar inkübe O / N ADAR1 (110 ve 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) ve fosfo-IRF3 (47-kDa) karşı 1,000'de 1 seyreltilmiş% 3 sığır serum albümini ile TBST (BSA) ve antikorlarda, sırasıyla membran, üst orta ve alt parçalar için.
  8. Membranlar TBST ile 5 dakika için 5 kat ve 1 saat (5,000 içinde 1 seyreltilmiş),% 5 yağsız süt ve peroksidaz-etiketli keçi anti-tavşan sekonder antikor ile TBST içinde inkübe yıkayın.
  9. TBST ile 5 dakika boyunca membranlar 5x yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre filmler bantları görselleştirmek için elektrokemiluminesan (ECL) çözümü uygulayın.
  10. filmler protein bantları görselleştirmek sonra bir antikor sıyırma çözeltisi ile 10 dakika boyunca zarın, orta ve alt parçaları yıkayın. ve IRF3 (500 'de 1 olarak), toplam PKR karşı% 3 BSA ile TBST içinde membranlar O / N ve antikor inkübe (1.000 de 1), sırasıyla, orta ve alt parçalar için. Yineleyin 4.8 adımları. ve 4.9. PKR membran (orta), anti-tavşan ikincil antikoru yerine peroksidaz etiketli keçi anti-fare kullanılmıştır.
  11. TBST ile 5 dakika için membran 5x alt parça yıkayın (5,000 içinde 1 seyreltilmiş) aktine karşı bir antikor ile 1 saat boyunca% 3 BSA ile TBST içinde membran inkübe edin. Yineleyin 4.8 adımları. ve 4.9. anti-tavşan sekonder antikor yerine peroksidaz etiketli keçi anti-fare kullanılmıştır. Farklı test RNA ve pozitif kontrol karşılaştırma sonuçlarının bir örneği Şekil 5'te sağlanmaktadır. Kullanılacak özel antikorlar için Malzemelerin tabloya bakınız.

Sonuçlar

Prosedürleri genel şematik bir üç test RNA ve Şekil 2B'de sağlanan bir kontrol RNA için bir örnek transfeksiyon planı, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Viral üretimi ve hücre yaşayabilirliği tahlilleri için, her bir test yapı için Okuması bir negatif kontrol normalize edilir. Her test RNA bitişiğindeki negatif kontrol normalize böylece çoğaltır, setler halinde transfekte edilir. Bu durum, örneğin, negatif kontroller tüm bi...

Tartışmalar

Tanımlanan HIV-1 üretimi deneyi HEK293T hücreleri (Şekil 2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve etkili bir ribozim 13 shRNA 10,29, siRNA 30 ve U1i RNA 11,31 hedef sitesi HIV-1 RNA taramak için kullanılan deneyler benzer edildi. HIV-1 üretimini ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılarak, çalışmaların çoğu, aday RNA'lar ile bir HIV-1 ifade plazmidinin Müşterek transfeksiyon sonrasında, virüs üretimini 48 saat ölçtük. HIV-1 ü...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Burada sunulan çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (DCB-120266, PPP-133377 ve AG için HBF-348967 verir).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

Referanslar

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

EnfeksiyonSay 115HIV 1 RNA tedavietkinliktoksisiteba kl k uyar mh cre canl l MTTPKRADAR1TLR3IRF3fosforilasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır