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요약

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

초록

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

서문

현재 HIV-1 치료의 한계는 만성적 질환의 진행을 방지하기 위해 투여되어야한다는 것이다. HIV-1에 강한 T 림프구 또는 조혈 줄기 세포 이식, 약물 치료 -1,2-의 부재 HIV-1 복제의 장기간 제어를 제공하는 가능성을 가지며 또한 HIV-1 치료를 달성하기위한 효과적인 방법이 될 수있다 3. HIV-1 복제에 대해 내성 세포를 렌더링하기위한 한 가지 방법은자가 이식 동안 4 감염된 개인의 세포에 항 HIV-1 RNA를 또는 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것이다. 여러 후보 항 HIV-1 유전자는 단일 유전자에 HIV-1의 저항 현상을 방지하기 위해, 두 개 또는 세 개의 5 (6)의 조합에 일부 진입하여 임상 시험을 고안 하였다.

항 HIV-1 RNA를 인해 면역 반응을 유도하는 그들의 낮은 전위로하고 있기 때문에 결합 유전자 치료에 대한 상위 후보자들이다매우 짧은 유전자 서열로부터 전사된다. 일부 항 HIV-1 RNA를이 바이러스 항목 및 통합을 목표로 설계되었습니다. 그러나, 대부분의 항 HIV-1 RNA를는 바이러스 라이프 사이클 후 통합 단계 (도 1)을 대상. 후 통합 억제제는 리보 자임 (7), shRNA를 8 U1i RNA를 9로는 HIV-1 조절 단백질 문신 또는 계 1, 및 안티센스 기반의 RNA를 대상으로 HIV-1 RNA에 다른 사이트를 대상으로, 미끼 RNA를 포함. 항 HIV-1 RNA를의 효능을 비교하기 위해 사용 된 방법은 유전자 후보 RNA를 코딩하는 바이러스 성 일시적 후보의 RNA를 발현하는 플라스미드로 형질 감염된 세포에서 생산 및 HIV-1 발현 플라스미드를 측정 형질 세포에서 바이러스 복제를 모니터링 포함 10 -13. 우리는 이전에 새로운 리보 자임 대상 사이트 13 ~ 15에 대한 HIV-1 RNA를 선별하는 HIV-1 생산 분석을 사용했다. 이러한 방법은 RNA 인 이후의 포맷을 최적화하기 위해 정제 된간섭은 분자의 shRNA로 플라스미드 DNA로부터 발현 또는 합성 siRNA를 16로 전달. 상기 분석은 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포로부터 성숙 바이러스의 생산을 측정하고 (도 1) HIV-1 복제 사이클 후 통합 단계를 타겟팅 억제제의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 사전 통합 단계를 타겟팅 억제제를 들면, TZM-BL 세포 감염 분석 (17)와 같은 다른 분석은 항 바이러스 효능을 평가하기 위해 필요하다.

병원에서 항 HIV-1 RNA를의 전달을위한 주요 안전 문제는 인간의 RNA 또는 단백질과 선천성 면역 센서의 작동에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 항 HIV-1 siRNA의 독성을 평가하기 위해 다른 세포주 16 세포 생존력 분석을 이용했다. 우리는 또한 이중 가닥 RNA 면역 센서의 활성화를 측정 RNA 활성화 단백질 키나제 R (PKR) 및 수용체 3 (TLR3) 등 수신자뿐 아니라 전인터페론의 Pression의 유전자, ADAR1의 P150을 자극. 이러한 분석은 항 HIV-1 RNA를 효능은 세포 생존 또는 면역 센서의 활성화에 대한 간접적 인 효과에 기인 아니라는 것을 확인하는데 사용될 수있다. 또한 발전에서 잠재적 인 독성과 후보 RNA를 제외 유용하다.

다음 프로토콜에서, 절차는 새로운 치료의 RNA를 확인하고, 기존의 형식을 설명하는 최적화. 방법은 HIV-1 복제의 심사 RNA 기반 후 통합 억제제에 유용과 같은 바이러스 성 RNA 18 CRISPR의 레브 매개 수출을 대상으로 작은 분자와 같은 다른 후 통합 억제제를 화면에 적용 할 수 / 설계 카스 시스템은 통합 대상으로 HIV-1 DNA 19.

프로토콜

1. 세포와 형질

  1. 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 HEK 293T 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 세포 배양 배지에서 2 × 105 세포 / ㎖ 현탁액을 준비한다. 의 각 웰에 세포 현탁액의 500, 100 및 1,000 μl를 추가, 24도, 96도, 12 웰 플레이트, 바이러스 생산, 세포 생존 및 면역 활성 ​​분석, 각각 (그림 2A)합니다.
  2. 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2와 37 ° C에서 / O N 그들을 품어. 50~70%의 포화 상태로 세포를 성장.
  3. 형질 전환 계획에 따르면, 1.5 ml의 마이크로 튜브 (예, 그림 2B)에 테스트 RNA를 자신의 컨트롤의 희석을 준비합니다.
    1. 바이러스 생산 분석를 들어, HIV-1 발현 플라스미드의 10 NG / μL 희석을 준비하고 각 튜브에 10 μl를 추가합니다. 다음 5 μM 시험의 RNA 희석하여 음성 대조군 RN 준비A. 25 또는 100 nM의 최종 농도에 해당하는 튜브에 각 시험 RNA 및 음성 대조군 희석 2.5 또는 10 μl를 추가합니다.
    2. C : 세포 생존력 분석을 위해 5 μM 시험의 RNA 희석하고 양성 대조군 RNA, 저 분자량 폴리 I의 10 ㎎ / ㎖의 희석을 준비한다. 각각 100 nm의 또는 200 μg의 / ml의 최종 농도에 해당하는 튜브에 테스트 RNA 또는 양성 대조군 RNA 희석 2 μl를 추가합니다.
    3. 면역 활성 시험의 경우, 시험 RNA 또는 단계 1.3.2에서 제조 한 양성 대조군 RNA 희석 20 μl를 추가합니다. 각각 100 nm의 또는 200 μg의 / ml의 최종 농도에 해당하는 튜브에.
      단계 1.3.1에 ​​대한 ng를 25, 100의 최종 금액을주고, 테스트 RNA 발현 플라스미드를 들어 시험의 RNA의 5 μM 희석 대신에 10 NG / μL 희석을 준비 :합니다. 및 (100)는 단계 1.3.2에 대한 ng를. 및 1.3.3.
  4. 바이러스 성 자극에 대한 각각의 형질 튜브에 DMEM 50, 25 또는 75 μl를 추가각각 uction, 세포 생존 및 면역 활성 분석. 바이러스 생산 분석법 다음 단계 전에 생물학적 안전 수준 3 (BSL3) 실험실 세포 형질 제조 튜브를 가져온다.
  5. 트랜 튜브에 형질 전환 시약 순차적으로 2 μl를 추가하고 복합체 형성 할 수 있도록 15 ~ 20 분을 품어. 특정 형질 전환 시약 재료의 표를 참조하는 데 사용합니다.
  6. 적가 세포 배양 플레이트의 상응하는 위치에 각각의 마이크로 튜브에서 전체 형질 전환 혼합물을 추가한다. 부드럽게 소용돌이와 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 접시를 품어.
  7. 세포 배양 판 (그림 2C)에서 HIV-1 생산 (섹션 2), 세포 생존 능력 (섹션 3) 및 면역 활성화 (섹션 4)를 측정한다.

2. 바이러스 생산 분석

  1. 배양기에서 24 웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 BSL3 세포 배양 플레이트의 내부 소용돌이 부드럽게후드. A는 HIV-1 생산을 정량화하는 데 사용됩니다 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 잘 대응하는 각 우물에서 뜨는 150 μl를 전송합니다.
    주 : 일반 바이러스 정량 분석은 효소 면역 분석법 (ELISA) (20), 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) (21)에 의한 바이러스 RNA를 정량하여 HIV-1 캡시드 단백질 (P24)의 발현을 측정하여 활성을 측정 포함 에이즈-1 RT 효소. 2.2 2.5은 HIV-1 RT 활동 13,15,16를 정량화하는 방법을 설명하는 단계를 반복합니다.
  2. 전송 중단 바이러스 칵테일 15 (표 1) 25 μl를 함유하는 96 웰 플레이트에 웰 대응하는 상등액 5 μL. RT에서 5 분 혼합물을 품어하고 방사능 워크 스테이션에 접시를 전송합니다.
    참고 : 2.2 단계. 방사능 워크 스테이션이 BSL3 실험실에서 사용할 수없는 경우에만 필요합니다. 플레이트로부터 제거 할 필요가없는 경우BSL3 실험실, 2.3 단계로 진행합니다. 방사성 칵테일의 25 μL 대신 바이러스 / 방사성 붕괴 칵테일 (표 1) 50 μl를 추가합니다.
  3. 방사성 칵테일 (15) (표 1)를 준비하고, 바이러스 뜨는 및 중단 칵테일의 각 웰에 25 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  4. 스팟 5 유리 섬유 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) filtermat 용지에 해당하는 사각형 상 반응 혼합물의 μL 및 관광 명소가 10 분 동안 건조 할 수 있습니다. 두 개의 샘플들이 직접 서로 보더 없도록 다른 모든 사각형 반응 혼합물 스팟. 이 단계 2.6 분 (CPM) 당 수를 결정할 때 샘플 사이의 크로스 오버를 방지하는 데 도움이됩니다.
  5. 종이 95 % 에탄올이 1 분간 세척 한 다음 염수 배 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼 (표 1)을 5 분 동안 5 배 씻는다. 종이 건조 및 샘플 가방을 봉인 할 수 있습니다.
  6. 클립 샘플 가방 공동카세트에 filtermat 용지를 ntaining 및 마이크로 플레이트 섬광 계수기에 카세트를 삽입합니다. 실험에 사용 [32 P] dTTP를의 일괄 제공 기준 날짜 (32) P에 대한 CPM을 읽고 카운터를 설정합니다. 플레이트지도를 이용하여 판독하고 카운터를 시작하는 샘플을 선택한다.
  7. 모든 바이러스의 정량 방법, 인접 음성 대조군으로 각각 테스트 RNA에 대해 얻어진 값을 나누어 테스트 RNA를 각 복제에 대한 HIV-1 생산의 억제 백분율을 얻기 위해 (100)에 의해이 값을 곱한다. 다른 농도에서 다른 테스트 RNA를 비교 결과의 일례는도 3에 제공된다.

3. 세포 생존 분석

  1. / ml의 MTT (3- [4.5 디메틸 -2- 티아 졸릴] -2,5- 디 하이드로 -2H- 테트라 졸륨 브로마이드) 둘 베코 인산염 완충 식염수에 희석 (인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고 5 mg의 20 μL를 추가 각 웰에 DPBS). F 번호판을 품어또는 37 ℃에서 3 시간.
  2. 세제 (1 % NP-40, 이소프로판올 4 mM의 염산)도 각으로 산성화 이소프로판올 150 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어.
  3. 마이크로 플레이트 분광 광도계에서 570 nm에서 흡광도를 결정합니다.
  4. 인접 형질 전환 제어에 의해 각각의 샘플에 대해 얻어진 값을 나누어 각각 양성 대조군 및 테스트 RNA에 대한 상대 MTT 대사를 계산한다. 다른 테스트의 RNA와 양성 대조군을 비교 한 결과의 일례는도 4에 제공된다.

4. 면역 활성화 분석

  1. 인큐베이터에서 12 웰 플레이트를 제거하고 문화 매체를 대기음. 부드럽게 DPBS로 두 번 세포를 씻어 아니라 각 (프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제, 표 1 포함) 차가운 용해 버퍼 (22)의 70 μl를 추가합니다. 얼음에 10 분 동안 접시를 품어.
  2. 마이크로 튜브에 세포 용 해물을 전송하고 빠른 침지하여 그들을 동결액체 질소에서 튜브. 샘플은 해동 3의 총이 더 동결 해동 사이클을 반복 할 수 있습니다.
  3. 세포 파편을 펠렛, 4 ° C, 15,700 XG에서 15 분 동안 해물을 원심 분리기. 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 전송하고 쿠마 블루 (브래드 포드) 메소드 (23, 24)를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
  4. 10 % 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에서 각 샘플로부터의 단백질 75 μg의 해결 이전 25,26 바와 같은 니트로 셀룰로오스 막에 옮긴다.
  5. 막에 전기 및 전송 후, 증류수에 세척 한 다음 1 분 동안 폰소 s (표 1)에서 막을 배양하여 단백질 밴드를 보여준다. 80, 55 kDa의에서 막을 잘라 가이드로 밴드와 단백질 사다리를 사용합니다.
    주의 : 단계 4.4 샘플 16 × 18cm 34 kDa의 아래로 2 겔을 실행할 수 있으며,이 지정된 위치에 막을 잘라 통해 절단되지 쉽다 있도록관심의 밴드. 대안 적으로, 몇몇 겔 막을 절단 피하기 위해 동일한 샘플을 실행할 수있다.
  6. 0.05 % 트윈 20 (TBST, 표 1)를 포함하는 TBS 버퍼로 폰소 s 염색을 세척 할 것. 완전히 막 다루 5 % 무 지방 우유로 TBST를 추가합니다. 1 시간 동안 교반하면서 RT에서 막을 인큐베이션.
  7. 막 부화 O / N ADAR1 (110 및 150 kDa의) 포스 PKR (62 kDa 이상) 및 포스 IRF3 (47 kDa의)에 대하여 1000 년 1로 희석하고 3 % 소 혈청 알부민 TBST (BSA)과 항체에있어서, 각각 멤브레인의, 상단 중앙과 하단 부분에 대해.
  8. 멤브레인은 TBST 5 분 동안 5 배 1 시간 동안 (5000 년 1로 희석) 5 % 무 지방 우유와 퍼 옥시 다제 표지 염소 항 - 토끼 보조 항체와 TBST에 품어 씻으십시오.
  9. TBST 5 분 동안 막 배를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 영화에 밴드를 시각화하는 전기 화학 발광 (ECL) 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
  10. 필름의 단백질 밴드를 가시화 한 결과, 항체 박리 용액으로 10 분 동안 멤브레인의 중간 및 하단 부분을 세척한다. 및 IRF3 (500 1) 총 PKR에 대해 3 % BSA와 TBST에서 세포막 O / N 및 항체를 품어 (1,000에서 1에서) 각각 중앙과 하단 부분에 대해. 반복 4.8 단계를 반복합니다. 4.9. PKR 막 (중간)에 대한 항 - 토끼 이차 항체 대신에 퍼 옥시 다제 표지 된 염소 항 - 마우스를 사용.
  11. TBST 5 분 동안 막 5 배의 바닥 부분을 세척하고 (5000 년 1로 희석) 굴지에 대한 항체와 1 시간 동안 3 % BSA와 TBST에서 막을 품어. 반복 4.8 단계를 반복합니다. 4.9. 항 - 토끼 이차 항체 대신에 퍼 옥시 다제 표지 된 염소 항 - 마우스를 사용. 다른 테스트의 RNA와 양성 대조군을 비교 한 결과의 일례는도 5에 제공된다. 사용되는 특정 항체 물질의 표를 참조.

결과

절차의 일반적인 개략도 세 시험 RNA를도 2b에 제공되는 제어 RNA위한 예시 형질 계획도 2에 도시되어있다. 바이러스 생산 및 세포 생존 분석을 위해 각 테스트 구조에 대한 판독은 음성 대조군으로 정규화된다. 각 시험 RNA가 인접 대조군에 정상화되도록 복제가 세트로 형질 감염된다. 이것은 예를 들어, 음성 대조군 모두 제 형질, 경우 발생할 수 착...

토론

기재된 HIV-1 생산 분석법 HEK293T 셀들 (도 2)를 이용하여 수행하고, 효과적인 리보 자임 (13) shRNA를 10,29, siRNA를 30 및 U1i RNA 11,31 표적 부위를 HIV-1 RNA를 선별하는 데 사용되는 분석 비슷 하였다. HIV-1 생성을 정량화하기 위해 다양한 방법을 사용하여, 대부분의 연구는 후보의 RNA와 HIV-1 발현 플라스미드의 공동 형질 감염 후 바이러스 생산을 48 시간으로 측정...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

여기에 제시된 작품은 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다 (DCB-120266, PPP-133377와 AG에 HBF-348967을 부여).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

참고문헌

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