Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

Resumen

Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 ⁺ vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando <40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Resumen

Los métodos aquí descritos para la activación de las células T CD4 ⁺ no tratados previamente en suspensión y su adhesión en cubreobjetos para el análisis de microscopía confocal permiten la localización espacial y la visualización de los gangliósidos que participan en la activación de células T CD4 ^+, que la expresión complemento experimentos de perfiles tales como citometría de flujo, en el oeste Blot o PCR en tiempo real. La cuantificación de la expresión de gangliósidos a través de citometría de flujo y su localización celular a través de microscopía se puede obtener por el uso de anticuerpos anti-gangliósido con alta afinidad y especificidad. Sin embargo, un manejo adecuado de células en suspensión implica el tratamiento de placas de cultivo para promover la adherencia necesaria requerida para la fluorescencia o la adquisición microscopía confocal. En este trabajo, se describe un protocolo para determinar GD3 y GD2 expresión de gangliósidos y colocalización con el TCR durante la activación de ingenuo células T CD4 ^+. También, en tiempo real, texperimentos ime PCR usando <40.000 células se describen para la determinación de la GD3 y GM2 genes / GD2 sintasa, lo que demuestra que los experimentos de análisis de gen se puede realizar con un bajo número de células y sin la necesidad de kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Introducción

Las células T CD4 ⁺ orquestan la respuesta inmune a través de sus funciones efectoras después de la activación por las células presentadoras de antígeno ^1. El estudio de los mecanismos celulares que están moduladas durante la activación permite penetración en un proceso básico de la función inmune. Sin embargo, el estudio de las células T CD4 ⁺ vírgenes puede ser complicado debido a que representan una población muy pequeña de células en la periferia de sangre ^2.

A través de microscopía de fluorescencia varios informes han estudiado la localización de diferentes moléculas implicadas en la activación de células T CD4 ^+, principalmente proteínas asociadas a la membrana plasmática ^3. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y aunque han sido ampliamente estudiados en las células nerviosas en el que son abundantes, otras células tales como las células inmunes también expresan gangliósidos con biológicamente funciones relevantes ^4,5. Hemos informado anteriormente de that durante la activación de las células T CD4 ⁺ vírgenes humanos hay una regulación por incremento de la α2,8 sialiltransferasa ST8Sia 1 (GD3 sintasa) y la sintasa GM2 / GD2, que inducen la neoexpression superficie significativa de GD2 y la regulación al alza de GD3 gangliósido ^6. El estudio adicional de GD3, GD2 y otros gangliósidos en células inmunes, es necesario complementar una vista parcial a base de proteínas de la función inmune.

Comúnmente, el estudio de la expresión de gangliósidos se basa en técnicas tales como cromatografía en capa fina (TLC) ^7, pero esta técnica no permite la localización espacial de los gangliósidos en la membrana plasmática o en compartimentos subcelulares, limitando el análisis biológico.

En este trabajo, se describe un protocolo para la identificación mediada por anticuerpos y localización de GD3 y GD2 gangliósidos en células T CD4 ⁺ vírgenes humanos y PBMCs después de la activación anti-CD28 anti-CD3 /. Con este protocolo se iTambién es posible analizar el gen y la expresión molecular de gangliósidos en un bajo número de células en suspensión, con la adquisición de imágenes de alta calidad ^6, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los linfocitos (9 m).

Protocolo

La sangre periférica de donantes varones sanos se obtuvo con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Bioética del Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

1. Aislamiento y activación de T humanas indiferenciadas CD4 ⁺ células

1. Recoger 2 ml de sangre periférica derivadas de donantes humanos sanos mediante el consentimiento informado y se diluye con 2 ml de PBS estéril-EDTA (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Añadir la sangre diluida lentamente en la parte superior de 3 ml de solución de sacarosa con 1,077 de densidad como se describe anteriormente ^8.
   Nota: La migración diferencial durante la centrifugación causado por diferencias en la densidad hará que los eritrocitos sedimentan a completamente y una capa de células mononucleares menos densos formará anteriormente. 2 ml de sangre periférica se rinden aproximadamente 0,5 x 10 ⁶ células T CD4 ⁺ vírgenes después de la Purificatisobre las medidas.
2. Centrifugar 30 minutos a 250 xg en 21 ° C (uso rotor para tubos de fondo redondo con ángulo fijo de 30 mm) sin interrupción para generar el gradiente de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Después de la centrifugación, el PBMC se puede observar claramente como un anillo blanco. Recoger las PBMCs con una pipeta y transferir al tubo estéril para el lavado.
3. Después de tres lavados con solución de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min proceder a la purificación de células T CD4 ⁺ vírgenes. métodos de selección o varios tipos de kits de purificación están disponibles para este propósito. Preferiblemente, utilice> 1 x 10 ⁷ PBMCs para la purificación.
   1. Purificar las células T CD4 ⁺ no tratados previamente por selección negativa con perlas magnéticas. Realizar la selección negativa con anticuerpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, y CD235a (glicoforina A). Evaluar el porcentaje de pureza mediante la determinación de células CD45RA + CD4 + a través de fcitometría de baja.
      Nota: Opcionalmente, se procede a la incubación de las PBMC durante la noche a 37 ° C y 5% de CO ₂ con una densidad de 1 x 10 ⁶ células / ml en 10 ml de medio suplementado para promover la adhesión de los monocitos y continuar con la purificación ingenuo células T CD4 ^+. La recuperación eficiente de las células T CD4 ⁺ vírgenes de sangre periférica depende en gran medida del sistema de purificación.
4. Preparar placas de cultivo celular de 24 pocillos mediante la adición de 250 l por pocillo de PBS con anticuerpo 5 mg / ml de anti CD3 monoclonal y se incuba durante al menos 2 horas a 37 ° C.
   Nota: Las placas con 96 pocillos se pueden utilizar cuando se utiliza un número más pequeño de células T CD4 ⁺ no tratados previamente (por ejemplo, 2 x 10 ⁴ -1 x 10 ^5).
5. Retire la dilución de anticuerpo anti CD3 desde el 24 de pozo o placas de 96 pocillos y se lavan las placas dos veces con PBS estéril 1x.
6. Diluir las células T CD4 ⁺ no tratados previamente con> 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a una densidad de 1 x 10 ⁶ células / ml en avanzado 1640 medio RPMI suplementado con 3% de suero bovino fetal (o RPMI suplementado con 10% de suero), glutamina 2 mM y antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 g / ml de estreptomicina).
   Nota: Si se requiere la localización de gangliósidos en PBMCs, siguen el mismo protocolo para la dilución y estimulación como se describe a continuación.
7. Añadir 500 l de la dilución de células a pocillos recubiertos anti-CD3 y a los pozos no recubiertos (células de control) en la placa de 24 pocillos. Alternativamente, añadir 100 l de la dilución de células a los pocillos de la placa de 96 pocillos.
8. Completar las condiciones de estimulación de células T CD4 ⁺ vírgenes en los pozos de anti-CD3 recubiertos mediante la adición de 1 mg / ml de anticuerpo anti CD28.
9. Mantener las células T CD4 ⁺ en reposo como el control en los pocillos no revestidos sin la adición de anticuerpos anti CD28. Incubar el reposo y activadas de células T CD4 ⁺ durante 0 a 72 horas en condiciones estándar de 37 °C y 5% de CO _2.
10. Para verificar una activación adecuada evaluar mediante citometría de flujo la expresión del marcador de activación temprana CD69 (16 horas después de la activación) o CD25 marcador de activación tardía (48 horas después de la activación) en reposo y activadas las células T CD4 ⁺ vírgenes se incubaron a 37 ° C y 5% de CO ₂ en ausencia o presencia de anticuerpos anti CD3 / CD28 ^9,10.

2. La adhesión de reposo y activadas las células T naive CD4 ⁺

1. Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos en autoclave y exposición a la luz UV durante al menos 15 minutos.
2. Coloque los cubreobjetos en placas de cultivo celular de 24 pocillos estériles.
   Nota: Para los cultivos con células de menos de 1 x 10 ^5, es preferible utilizar cámaras de diapositivas con pozos pequeños adaptados para evitar la dispersión de células en cubreobjetos.
3. cubreobjetos de la capa (o cámara de diapositivas) con 200 l de poli-L-lisina (MW 150 a 300 KDa) 0,1% (w / v) de la solución y se incuba durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar y secar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente.
4. Mezclar con cuidado y recoger el reposo y las células T CD4 ⁺ activadas ingenuas de las placas de 24 pocillos. Contar las células y, si es necesario, ajustar con medio suplementado fresco para transferir 1 x 10 ⁵ células a los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Se incuban las células durante un mínimo de 6 horas a 37 ^° C y 5% de CO _2.

3. La recolección y fijación de reposo y activadas Naïve células T CD4 ⁺

1. Retirar con cuidado el medio de reposo y se cultivaron las células T CD4 ⁺ activadas ingenuos.
2. Añadir 500 l de PBS estéril RT lentamente.
   Nota: Además cuidadosa y la eliminación de soluciones de los pozos impide el desprendimiento de células del cubreobjetos.
3. Desechar el PBS y añadir otros 500 l de PBS para eliminar completamente los medios de cultivo.
4. Fijar las células mediante la adición de 500 l filtrada paraformaldehído al 4% (filtración elimina micropartículas que pueden interferir con el análisis de microscopía) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente (preferido) o durante la noche a 4 ° C.
   Precaución: El paraformaldehido es un compuesto tóxico y volátil. Se sabe que es un carcinógeno humano. Utilice con cuidado con un protocolo de seguridad adecuado.
5. Retire el fijador y lavar al menos dos veces con PBS a temperatura ambiente.
6. Proceder al siguiente paso o mantener los pozos de la placa con 500 l de PBS a 4 ° C durante varios días hasta que las manchas.
   Nota: La esterilidad durante este proceso ayuda a evitar el crecimiento de microorganismos.

4. La tinción, montaje y visualización mediante microscopía confocal

1. Retire el PBS de los pozos. Añadir 500 l de tampón de bloqueo frío (1x PBS, 0,5% de grado estándar de albúmina de suero bovino, 1% de suero fetal bovino pH 7,4). Incubar durante 20 minutos en hielo.
2. Retire el amortiguador de bloqueo y añadir con cuidado los anticuerpos primarios (anti gangliósidos GD3 R24 clon, clon GD2 14G2a),PE-conjugado anti CD25 y APC-conjugado anti TCR e isotipos controles diluidos en tampón de bloqueo a 2,5 g / ml.
3. Incubar 2 horas en el hielo o la noche a 4 ° C.
   Nota: agitación orbital lenta es preferible.
4. Retire el anticuerpo con cuidado y lentamente añadir 500 l de PBS. Repetir dos veces.
5. Añadir los anticuerpos secundarios (FITC conjugado anti IgG3 para R24 contra GD3, Alexa Fluor 488-conjugado o Alexa Fluor 647-conjugado anti IgG2a para 14G2a contra GD2) diluido en tampón de bloqueo a 0,1 g / ml.
6. Incubar durante 1 hora en hielo en la oscuridad sin agitación.
7. Lavar tres veces en PBS como se describe en 4.4). Mantener los pocillos con PBS suficiente para evitar la deshidratación de las muestras.
8. Añadir Hoechst 333258 mancha diluido en PBS a 0,1 g / ml.
9. Incubar 15 minutos a temperatura ambiente y quitar. Lavar tres veces en PBS.
10. Colocar los portaobjetos en una toalla de papel y añadir 20 l de solución de montaje (50% de glicerol en PBS) o solución de montaje comercials para evitar la decoloración y el enfriamiento rápido de las muestras.
11. Recoja cuidadosamente el cubreobjetos con unas pinzas finas y colocarlo en la solución de montaje. Asegúrese de que el lado del cubreobjetos donde se unen las células está en contacto con la solución. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y analizar mediante fluorescencia o microscopía confocal.

5. Aislamiento de ARN

1. Preparar anticuerpo anti CD3 (5 mg / ml) recubiertas placas de 96 pocillos. Incubar 4 x 10 ⁴ células T CD4 ⁺ vírgenes / pocillo en 100 l de medio de cultivo suplementado con el anticuerpo CD28 contra (1 mg / ml) para completar el estímulo. Incubar a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 0-72 hr.
2. Después de diferentes tiempos post-activación colocar las células en un tubo de microcentrífuga.
3. Añadir 500 l de PBS y centrifugar a 250 xg durante 5 min a TA.
4. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de reactivo Trizol.
5. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y mantener la muestra a -8076; C durante al menos 24 h. Proceder con el aislamiento de ARN cuando sea necesario.
   Nota: Dejar la muestra a -80 ° C durante al menos 24 horas mejora el rendimiento de ARN. Además, el uso de guantes de la mano es esencial para evitar la degradación del ARN por RNasas.
6. Descongelar la muestra de incubación a 37 ° C durante 2 min en un baño de agua.
7. Añadir 200 l de cloroformo y agitar con fuerza a mano durante 30 segundos (para evitar la mezcla agresiva de ARN mediante agitación). Incubar 5 min a TA.
8. Centrifugar 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
9. Recuperar la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga.
10. Añadir 500 l de isopropanol y se invierte el tubo tres veces.
11. Incubar 10 min a RT y se centrifuga durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C.
12. Eliminar el sobrenadante por inversión.
13. Añadir 1 ml de hielo frío de etanol 75% y se centrifuga 10 min a 12.000 xg a 4 ° C.
14. Completamente descartar el sobrenadante y secar el pellet de ARN dejando el tapón del tubo abierto.
    Noe: En este punto el pellet no es claramente visible. Procede de todas maneras.
15. Resuspender el precipitado en 20 l de agua de grado molecular. Calcular la concentración y pureza de los ácidos nucleicos mediante la medición de la absorbancia 260 nm y 280 nm usando NanoDrop.
16. Proceder con cuidado para la síntesis de ADNc mediante el uso de cualquier kit de transcriptasa inversa convencional y siguiendo el protocolo del fabricante.
    Nota: Aproximadamente 0,5 a 2 g de ARN se obtiene a partir de 4 x 10 ⁴ células T CD4 ⁺ vírgenes. cDNA puede ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN y se utiliza en tiempo real, las reacciones de PCR sin la necesidad de kits de entrada baja de ARN.

Resultados

El protocolo descrito en este manuscrito hace que una buena calidad de culto y de descanso adherido y las células T CD4 ⁺ vírgenes humanos activados (Figura 1). Las células T CD4 ⁺ activadas muestran el perfil proliferativa característica (Figura 1B) en comparación con la condición de reposo (Figura 1A). El marcador de activación CD25 tarde es útil para evaluar la activación eficiente en 72 hr observada por...

Discusión

El protocolo descrito se puede utilizar para localizar gangliósidos o proteínas en las suspensiones de células de células T CD4 ⁺ o otras células inmunes (por ejemplo, PMBCs, figura 5) a partir de un pequeño número de células. Debido al pequeño tamaño de las células T y las propiedades no adherentes, la adquisición de fluorescencia imágenes microscópicas se obtenga información mala o baja calidad si las células están no se cumplen correctamente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7