CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

요약

우리는 쉬고 강글리오사이드 활성화 인간 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 세포막 발현 및 위치 파악을 결정 현미경에 사용하기위한 표준 항체 염색 프로토콜을 설명한다. 또한 실시간 PCR 실험은 <추가 낮은 입력 RNA 키트를 필요로하지 않는 40,000 세포를 사용하는 기술.

초록

서스펜션의 순진한 CD4 ⁺ T 세포의 활성화를 위해 본원에 기술 된 방법 및 공 초점 현미경 분석 된 커버에서의 준수는 실험을 프로파일 링하는 보수 표현 유동 세포 계측법 등의 CD4 ⁺ T 세포 활성화에 관여하는 강글리오사이드의 공간 현지화 및 시각화를 허용, 서부 블 롯팅 또는 실시간 PCR. 유동 세포 계측법 및 현미경을 통해 세포 지역화 통해 강글리오사이드 발현의 정량화는 높은 친화력과 특이성 안티 - 강글리오사이드 항체의 사용에 의해 얻을 수있다. 그럼에도 불구하고, 현탁액 중의 세포의 적절한 처리가 형광 또는 초점 현미경 취득 요구 필요한 접착 성을 촉진하는 배양 플레이트의 치료를 포함한다. 이 작품에서 우리는 순진한 CD4 ⁺ T 세포 활성화하는 동안 GD3 및 GD2 강글 리오 시드의 표현과 TCR와 colocalization을 결정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 리얼 t<40,000 세포를 사용 IME PCR 실험은 세포의 낮은 숫자 및 추가 저 입력 RNA 키트의 필요없이 수행 될 수있는 유전자 분석 실험을 보여주는 상기 GD3 및 GM2 / GD2 합성 효소 유전자의 결정을 위해 설명된다.

서문

CD4 ⁺ T 세포는 항원 제시 세포에 의해 활성화 ^한 후 자신의 이펙터 기능을 통해 면역 반응을 조율. 활성화 과정에서 변조 된 세포 메커니즘 연구는 면역 기능의 기본 과정에 대한 통찰력을 할 수 있습니다. 그들이 주변 ^혈액이 세포의 매우 작은 모집단을 대표하기 때문에, 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 연구는 복잡해질 수있다.

형광 현미경을 통해 여러보고 CD4 ⁺ T 세포 활성화에 관여하는 다른 분자 플라즈마 막 ^(3)에 주로 연관 단백질의 위치 파악을 연구 하였다. 강글리오사이드는 시알 산 함유 글리 고스되어 있으며 광범위가 같은 면역 세포로서 풍부한 다른 세포 인 신경 세포 연구되었지만 또한 생물학적으로 중요한 기능과 ^4,5- 강글리오사이드를 표현한다. 우리는 이전에 그쪽을보고ST8Sia 1 (GD3 합성 효소)과 GM2 / GD2 합성 효소 시알 산 전이 효소 α2,8의 상향 조절이 인간의 순진한 CD4 ⁺ T 세포의 활성화 동안 t, 즉 GD2의 중요한 표면 neoexpression 및 GD3의 강글 리오 시드 ^(6)의 상향 조절을 유도한다. 면역 세포 GD3, GD2 강글 리오 시드 등의 추가의 연구는 면역 기능의 단백질 기반의 부분도를 보완 할 필요가있다.

일반적 갱글 발현 연구는 박층 크로마토 그래피 (TLC) ^(7)과 같은 기술에 기초하지만, 이러한 기술은 생물학적 분석을 제한하는 세포막 또는 세포 내 구획 강글리오사이드의 공간적 위치 파악을 허용하지 않는다.

이 작품에서 우리는 항 CD3 / 안티 CD28 활성화 후 인간의 순진한 CD4 ⁺ T 세포와 PBMC를에 GD3 및 GD2 강글리오사이드의 항체 매개 식별 및 위치 파악을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 IT 내가 함께림프구의 작은 크기 (9 μm의)을 고려하여, 고품질의 화상 ^(6)의 획득과, 현탁액 중의 세포의 낮은 숫자의 강글리오사이드의 유전자 발현 및 분자를 분석하는 것도 가능하다.

프로토콜

건강한 남성 기증자로부터 말초 혈액 동의하고 센트로 드 Investigaciòn 엔 DINAMICA Celular- 대학교 자치시 델 에스 타도 데 모렐 로스의 생명 윤리위원회의 승인을 얻었다.

1. 분리 및 인간 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 활성화

1. 동의서를 통해 건강한 인간 기증자로부터 유래 말초 혈액 2 ㎖를 수집하고 멸균 PBS-EDTA 2 ㎖로 희석 (1 배 인산염 완충 식염수 (PBS), 2 mM의 EDTA, pH를 7.4). 이전 ⁸ 설명한 바와 같이 1.077 밀도 자당 용액 3 ㎖의 상단에 천천히 희석 혈액을 추가합니다.
   주 : 밀도 차이에 의한 원심 분리시 차등 마이그레이션 적혈구 침강 완전히 발생할 덜 조밀 한 단핵 세포의 층 위에 형성된다. 말초 혈액 2 ㎖를 purificati 후 약 0.5 × ¹⁰⁶ 나이브 CD4 ⁺ T 세포를 렌더링단계에.
2. 더 휴식 21 ° C (30mm의 고정 된 각도 둥근 바닥 튜브를 사용 로터) 250 XG에 원심 분리기 30 분 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 기울기를 생성합니다. 원심 분리 후, PBMC를 명확히 백색 링으로서 관찰 될 수있다. 피펫으로 PBMC를 수집하고 세척 멸균 튜브에 전송합니다.
3. 10 분 동안 250 XG에 PBS-EDTA 용액으로 세척 한 후 세 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 정제를 진행. 정렬 방법 또는 정제 키트 여러 종류의 이러한 목적으로 사용할 수있다. 바람직하게는, 정제> 1 × 10 ⁷ PBMC를 사용합니다.
   1. 자기 구슬과 음의 선택에 의해 순진한 CD4 ⁺ T 세포를 정화. 안티 CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, 안티 TCRγ / δ, 안티 HLA-DR 및 CD235a (글리코 포린의 A) 항체와 부정적인 선택을 수행합니다. F 통한 CD4 + CD45RA + 세포를 측정하여 순도의 비율을 평가낮은 세포 계측법.
      주 : 선택적으로, 밤새 37 ° C, 5 % 단핵 세포 부착을 촉진하고 나이브 CD4 ⁺ T 세포를 정제하여 계속 보충 된 10 ml의 배지에 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 CO _2에서 한 PBMC 배양 진행. 말초 혈에서 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 효율적인 복구가 크게 정화 시스템에 의존한다.
4. 5 μg의 / ㎖의 항 CD3 모노클로 날 항체와 PBS의 웰 당 250 μL를 첨가하여 24 웰 세포 배양 플레이트를 준비하고, 37 ℃에서 적어도 2 시간 동안 배양한다.
   참고 : 96 웰 플레이트와 함께 사용할 수있다 나이브 CD4 ⁺ T 세포로부터 작은 수를 사용하는 경우 (예를 들어, X10 -1 2 × ^{105 (4)).}
5. 24도 또는 96 웰 플레이트에서 항 CD3 항체 희석을 제거하고 두 번 멸균 1X PBS를 이용하여 접시를 씻으십시오.
6. + 순도> 95 %로 나이브 CD4 ⁺ T 세포 (CD4 희석소 태아 혈청을 3 %로 보충 고급 RPMI 1640 배지에 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 밀도 CD45RA +)가 (혹은 RPMI 혈청의 10 %), 2 mM의 글루타민 및 항생제 (1 U / ㎖ 페니실린, 1 보충 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신).
   참고 : 강글 리오 시드 현지화가 PBMC를 요구하는 경우 아래에 설명 된대로, 희석 및 자극에 대해 동일한 프로토콜을 따릅니다.
7. 항 CD3 코팅 우물과 24 웰 플레이트에서 비 코팅 된 웰 (대조군 세포)에 세포 희석 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 상기 96 웰 플레이트에 세포 희석액 100 ㎕를 추가한다.
8. 항 CD28 항체 1 μg의 / ㎖를 첨가하여 항 CD3 피복 웰 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 자극 조건을 완료.
9. 항 CD28 항체를 첨가하지 않은 웰의 코팅 대조군으로서 휴지 CD4 ⁺ T 세포를 유지한다. 37 °의 표준 조건 하에서 72 시간 0의 휴식과 활성화 된 CD4 ⁺ T 세포를 품어C, 5 % CO _2.
10. 37 ° C에서 배양 순진한 CD4 ⁺ T 세포를 휴식의 CD69 초기 활성화 마커 (16 시간 포스트 활성화) 또는 CD25 늦은 활성화 마커 (48 시간 포스트 활성화)의 발현 유동 세포 계측법에 의해 평가하고 활성화 적절한 활성화를 확인하려면 5 % 없거나 항 CD3 / CD28 항체 ^9,10의 존재하에 CO _2.

2. 휴식의 준수 및 활성화 나이브 CD4 ⁺ T 세포

1. 적어도 15 분간 고압 증기 멸균 및 자외선 노출에 의해 12mm 라운드 커버 슬립을 소독.
2. 멸균 24 웰 세포 배양 접시에 배치 된 커버.
   주 : 1 미만 × ¹⁰⁵ 세포 배양의 경우는 커버 슬립에 세포의 분산을 방지하도록 작은 우물와 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 바람직하다.
3. 코팅 된 커버 폴리 -L- 라이신으로 200 μL (또는 슬라이드 챔버) (MW 150-300 KDa의) 0.1 % (w / v)의 용액을 (R)에서 5 분 동안 배양움 온도 (RT)는 실온에서 적어도 1 시간 동안 제거하고 건조.
4. 신중하게 혼합하고 24 웰 플레이트에서 휴식 및 활성화 순진한 CD4 ⁺ T 세포를 수집합니다. 세포를 세어 필요한 경우 폴리 -L- 리신 코팅 된 커버 슬립을 1 × ¹⁰⁵ 세포를 전송할 새로운 보충 배지로 조정한다. 37 ^O C에서 6 시간의 최소 5 % CO ₂ 세포를 품어.

3. 나이브 CD4 ⁺ T 세포를 수집 및 휴식의 고정 및 활성화

1. 조심스럽게 배양 휴식 및 활성화 순진한 CD4 ⁺ T 세포에서 매체를 제거합니다.
2. RT 멸균 PBS 500 μl를 천천히를 추가합니다.
   참고 : 우물에서 솔루션의주의 추가 및 제거는 커버 슬립에서 세포의 분리를 방지 할 수 있습니다.
3. PBS를 폐기하고 철저하게 문화 매체를 제거하기 위해 또 다른 500 μl의 PBS를 추가합니다.
4. 500 μL 여과하고 4 % 파라 포름 알데히드의 첨가 (FILT하여 세포를 고정배급은 현미경 분석에 방해) 및 (선호) 또는 밤새 4 ° C에서 RT에서 30 분 동안 배양 할 수 미립자를 제거합니다.
   주의 : 파라 포름 알데히드는 독성 및 휘발성 화합물이다. 인간 발암 물질로 알려져있다. 적절한 안전 프로토콜을 신중하게 사용합니다.
5. 정착액을 제거하고 RT에서 PBS로 두 배 이상 씻는다.
6. 다음 단계로 진행 또는 염색까지 몇 일 동안 4 ° C에서 PBS 500 μL와 함께 접시 우물을 유지한다.
   참고 :이 과정에서 불임은 미생물의 성장을 방지 할 수 있습니다.

4. 염색, 공 초점 현미경에 의해 설치 및 시각화

1. 우물에서 PBS를 제거합니다. 차가운 블로킹 완충액 500 ㎕를 추가 (1X PBS, 0.5 %의 표준 등급의 소 혈청 알부민, 1 % 소 태아 혈청의 pH 7.4). 얼음에 20 분 동안 품어.
2. 신중하게 차단 버퍼를 제거하고 일차 항체 추가 (항 강글리오사이드 GD3 클론 R24을, GD2 클론 14G2a)PE-복합 항 CD25 및 APC - 복합 안티 TCR 및 2.5 μg의 / ㎖로 버퍼를 차단에 희석 컨트롤을 아이소 타입.
3. 얼음에 2 시간 또는 밤새 4 ° C를 품어.
   주 : 느린 오비탈 교반이 바람직하다.
4. 조심스럽게 항체를 제거하고 PBS의 천천히 500 μl를 추가합니다. 두 번 반복합니다.
5. 이차 항체 0.1 μg의 / ㎖로 버퍼를 차단에 희석 (R24 안티 GD3, 알렉사 플 루어 14G2a 방지 GD2에 대한 488 공역 또는 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티의 IgG2a에 대한 FITC 복합 항 IgG3)를 추가합니다.
6. 흔들림없이 어둠 속에서 얼음에 1 시간 동안 품어.
7. 4.4에 설명 된대로) PBS에 세 번 씻으십시오. 샘플의 탈수를 피하기 위해 충분한 PBS로 우물을 유지합니다.
8. 0.1 ㎍ / ml의 PBS에 희석 훽스트 333258 얼룩을 추가합니다.
9. 실온에서 15 분을 품어 제거합니다. PBS로 세 번 씻으십시오.
10. 종이 타월에 슬라이드를 삽입하고 설치 솔루션 (PBS에 50 % 글리세롤) 또는 상업적 장착 용액 20 μl를 추가들 페이딩 및 샘플에서 담금질 방지 할 수 있습니다.
11. 조심스럽게 고급 핀셋으로 커버 슬립을 선택하고 설치 솔루션에 놓습니다. 세포가 부착 된 커버 슬립의 측면이 용액과 접촉에 있는지 확인합니다. 매니큐어로 된 커버를 밀봉 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다.

RNA의 5 격리

1. 항 CD3 항체 (5 μg의 / ㎖) 코팅 된 96 웰 플레이트를 준비합니다. 자극을 완료하기 위해 4 × ¹⁰⁴ 나이브 CD4 ⁺ T 세포 / 웰의 항 CD28 항체 (1 μg의 / ㎖)이 보충 된 배양 배지 100 μl를 부화. 0 ~ 72 시간 동안 CO _2를 37 ° C에서 품어 5 %.
2. 다른 후 활성화 시간 후 microcentrifuge 관에 세포를 배치합니다.
3. RT에서 5 분 250 XG에 500 PBS의 μL와 원심 분리기를 추가합니다.
4. 상층 액을 제거하고 1ml의 트리 졸 시약을 추가합니다.
5. RT에서 5 분 동안 품어에서 샘플을 유지 -8076 적어도 24 시간 동안 C. 필요할 때 RNA 분리를 진행합니다.
   참고 : 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 떠난다는 RNA 수율을 향상시킨다. 또한, 손 장갑 RNases 사용하여 RNA 분해를 방지하는 데 필수적이다.
6. 수욕에서 2 분 동안 37 ℃에서 항온 처리 샘플을 해동.
7. 200 μl의 클로로포름을 추가하고 30 초 (텍싱에 의해 RNA의 적극적인 혼합을 방지하기 위해)을 위해 손으로 격렬하게 흔들어. 실온에서 5 분 품어.
8. 4 ℃에서 12,000 XG에 원심 분리기 15 분.
9. 새로운 microcentrifuge 관에 수상을 복구 할 수 있습니다.
10. 500 ㎕의 이소프로판올을 추가하고 튜브를 세 번 반전.
11. 4 ° C에서 12,000 XG에 10 분 동안 10 RT에서 분 원심 분리기를 품어.
12. 반전에 의해 상층 액을 버린다.
13. 4 ℃에서 12,000 XG에 얼음 차가운 75 % 에탄올과 원심 분리기 10 분의 1 ML을 추가합니다.
14. 완전히 뜨는을 버리고 오픈 튜브의 캡을 떠나는하여 RNA 펠렛을 건조.
    아니E :이 시점에서 펠릿을 명확하게 표시되지 않습니다. 어쨌든 진행합니다.
15. 분자 수준의 물 20 μL에 펠렛을 재현 탁. nanodrop를 사용하여 260 nm 내지 280 nm의 흡광도를 측정함으로써 농도 및 핵산의 순도를 계산한다.
16. 임의의 통상적 인 역전사 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성 심하게 진행.
    주 : 약 0.5 μg의 RNA는 4 × ¹⁰⁴ 나이브 CD4 ⁺ T 세포로부터 얻어진다. cDNA를 RNA 100에서 NG synthetized 낮은 RNA 입력 장비의 필요없이 실시간 PCR 반응에서 사용될 수있다.

결과

이 논문에 기술 된 프로토콜은 배양의 좋은 품질과 접착 휴식 및 활성화 인간의 순진한 CD4 ⁺ T 세포 (그림 1) 렌더링합니다. 활성화 된 CD4 ⁺ T 세포는 휴면 상태 (도 1A)와 비교하여 특징적인 증식 프로파일 (도 1B)를 도시한다. CD25 늦은 활성화 마커 공 초점 현미경 (그림 1C)에 의해 관찰 72 시간의 효율적인 활?...

토론

기술 된 프로토콜은 CD4 ⁺ T 세포 또는 세포의 수가 적은부터 다른 면역 세포 (예 PMBCs,도 5)의 세포 현탁액 갱글 또는 단백질 지역화하는데 사용될 수있다. 때문에 T 세포 비 접착 특성의 작은 크기의 불량 정보 또는 낮은 품질의 형광 현미경 사진의 결과를 취득 셀이 올바르게 부착되지 않은 경우.

이 선도, 치료 중 강글리오사이드의 공간 지역화 및 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7