CD4の調製<sup&gt; +</sup&gt;顕微鏡によるGD3およびGD2ガングリオシドの膜発現の分析のためのT細胞

要約

我々は、休止中のガングリオシドの膜発現と局在を決定するために顕微鏡で使用するための標準的な抗体染色プロトコルを記述し、ヒトナイーブCD4 ⁺ T細胞を活性化します。また、説明<追加の低入力RNAキットを必要としない40,000個の細胞を用いたリアルタイムPCR実験です。

要約

懸濁液中のナイーブCD4 ⁺ T細胞の活性化のために本明細書に記載される方法および共焦点顕微鏡分析のためにカバースリップでの付着が、プロファイリング実験その補体の発現はフローサイトメトリーのようなCD4 ⁺ T細胞の活性化に関与するガングリオシドの空間的な局在化および可視化を可能にする、西部ブロッティングまたはリアルタイムPCR。フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査を介してそれらの細胞内局在を介しガングリオシド発現の定量化は、高い親和性および特異性を有する抗ガングリオシド抗体の使用によって得ることができます。それにもかかわらず、懸濁液中の細胞の適切な取り扱いは、蛍光または共焦点顕微鏡の取得に必要な必要な接着を促進するための培養プレートの処理を含みます。本研究では、ナイーブCD4 ⁺ T細胞の活性化の際にGD3およびGD2ガングリオシドの発現とTCRと共局在を決定するためのプロトコルについて説明します。また、リアルタイムT<40,000細胞を使用してIME PCR実験は、細胞の数が少ないとし、追加の低入力RNAキットを必要とせずに行うことができる遺伝子解析実験を実証し、GD3およびGM2 / GD2合成酵素遺伝子の決意に記載されています。

概要

CD4 ⁺ T細胞は、抗原提示細胞¹による活性化の後、それらのエフェクター機能を介して、免疫応答を調整します。活性化の間に変調された細胞メカニズムの研究は、免疫機能の基本的なプロセスへの洞察を可能にします。それらは血液周辺²のセルの非常に小さな集団を表すしかし、ナイーブCD4 ⁺ T細胞の研究では、複雑になることができます。

蛍光顕微鏡を介していくつかの報告は、CD4 ⁺ T細胞の活性化に関与する異なる分子、細胞膜³に関連した主にタンパク質の局在を研究しました。ガングリオシドは、スフィンゴ糖脂質を含むシアル酸であり、それらは広く、彼らは豊富にある神経細胞で研究されているが、そのような免疫細胞のような他の細胞もまた、生物学的に関連する機能^4,5でガングリオシドを発現します。我々は以前に股関節を報告しましたST8Sia 1（GD3シンターゼ）およびGM2 / GD2シンターゼシアリルトランスフェラーゼα2,8のアップレギュレーションがヒトナイーブCD4 ⁺ T細胞の活性化中tは、それは、GD2の著しい表面neoexpression及びGD3ガングリオシド⁶のアップレギュレーションを誘導します。免疫細胞におけるGD3、GD2およびその他のガングリオシドのさらなる研究は、免疫機能のタンパク質ベースの部分図を補完する必要があります。

一般的に、ガングリオシド発現の研究は、このような薄層クロマトグラフィー^（TLC）7などの技術に基づいているが、この技術は、生物学的分析を制限し、原形質膜で、または細胞内区画にガングリオシドの空間的局在を許可していません。

本研究では、抗CD3 /抗CD28活性化後のヒトナイーブCD4 ⁺ T細胞およびPBMCにおけるGD3およびGD2ガングリオシドの抗体媒介性の同定および局在化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルのそれの私とリンパ球の小サイズ（10マイクロメートル）を考慮すると、高品質の画像⁶を取得して、懸濁液中の細胞の数が少ないにガングリオシドの遺伝子及び分子の発現を分析することも可能です。

プロトコル

健康な男性ドナーからの末梢血を、インフォームドコンセントとセントロ・デ・InvestigaciònアンDinámicaCelular-大学自治デルエスタード・デ・モレロスの生命倫理委員会の承認を得ました。

1.単離およびヒトナイーブCD4 ⁺ T細胞の活性化

1. インフォームドコンセントを通して健康なヒトのドナー由来の末梢血の2ミリリットルを採取し、滅菌PBS-EDTAの2ミリリットル（1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、2 mMのEDTA、pH7.4）で希釈しました。以前に^8に記載^{されている}よう^に 1.077密度のショ糖溶液3mlの上にゆっくりと希釈した血液を追加します。
   注：密度の違いによる遠心分離中差動移行は、赤血球を完全に沈殿させますと低密度の単核細胞の層は、上記形成します。末梢血2mlをpurificati後、約0.5×10 ⁶のナイーブCD4 ⁺ T細胞をレンダリングします手順について。
2. ノーブレークで21°C（30mmの固定角丸底チューブに使用ローター）で250×gで遠心分離を30分間は、末梢血単核細胞（PBMC）の勾配を生成します。遠心分離後、PBMCを明らかに白色リングとして観察することができます。ピペットでのPBMCを収集し、洗浄のために滅菌チューブに移します。
3. 10分間、250×gでPBS-EDTA溶液で3回洗浄した後、ナイーブCD4 ⁺ T細胞の精製に進みます。選別方法または精製キットのいくつかのタイプは、この目的のために利用可能です。好ましくは、精製のために> 1×10 ⁷のPBMCを使用します。
   1. 磁気ビーズによるネガティブ選択によりナイーブCD4 ⁺ T細胞を精製します。抗CD45RO、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD56、CD123、抗TCRγ/δ、抗HLA-DR、及びCD235a（グリコホリンA）抗体を用いて負の選択を行います。 Fを介してCD4 + CD45RA +細胞を決定することにより、純度の割合を評価します低フローサイトメトリー。
      注：必要に応じて、単球の接着を促進し、ナイーブCD4 ⁺ T細胞の精製を継続する添加培地10mlに1×10 ⁶細胞/ mlの密度で37℃、5％CO ₂で一晩のPBMCのインキュベーションに進みます。末梢血からのナイーブCD4 ⁺ T細胞の効率的な回収、精製システムに大きく依存します。
4. 5μg/ mlの抗CD3モノクローナル抗体を用いてPBSのウェルあたり250μLを添加することによって、24ウェル細胞培養プレートを準備し、37℃で少なくとも2時間インキュベートします。
   注：ナイーブCD4 ⁺ T細胞からのより少ない数（ 例えば、2×10 ^{4〜1×10 5）}を使用するときに96ウェルを有するプレートを使用することができます。
5. 24ウェルまたは96ウェルプレートからの抗CD3抗体希釈を削除して、滅菌1×PBSを用いて二回プレートを洗浄します。
6. 純度> 95％のナイーブCD4 ⁺ T細胞を希釈（CD4 +ウシ胎児血清3％を補充した高度なRPMI 1640培地中で1×10 ⁶細胞/ mlの密度にCD45RA +）が（またはRPMI血清の10％）、2mMグルタミンおよび抗生物質（1 U / mlペニシリン、1を補充しました/ mlのストレプトマイシン）。
   注：ガングリオシドの局在化​​はPBMCにおいて必要とされている場合は、以下に説明するように、希釈および刺激のために同じプロトコルに従ってください。
7. 抗CD3コーティングしたウェルに、24ウェルプレート中の非被覆ウェル（コントロール細胞）に細胞希釈の500μlのを追加します。代わりに、96ウェルプレートのウェルに細胞希釈液100μlを追加します。
8. 抗CD28抗体を1μg/ mlで添加することにより、抗CD3コーティングされたウェル中のナイーブCD4 ⁺ T細胞の刺激条件を完了します。
9. 抗CD28抗体を添加することなく非被覆ウェル中のコントロールとして、休止CD4 ⁺ T細胞を保管してください。 37°の標準条件下で0〜72時間、休止および活性化CD4 ⁺ T細胞をインキュベートC、5％CO _2。
10. 37℃でインキュベートしたナイーブCD4 ⁺ T細胞を休止中のCD69早期活性化マーカー（16時間後に活性化）またはCD25後期の活性化マーカー（48時間後に活性化）の発現をフローサイトメトリーによって評価し、活性化され、適切な活性化を確認するにはおよび抗CD3 / CD28抗体^9,10の非存在下または存在下で、5％CO _2。

2.安静時の付着と活性化ナイーブCD4 ⁺ T細胞

1. 少なくとも15分間、オートクレーブ処理、UV光露光によって12ミリメートルラウンドカバースリップを滅菌します。
2. 滅菌24ウェル細胞培養プレートにカバースリップを置きます。
   注：以下、1×10 ⁵細胞と培養のためには、カバーガラスに細胞の分散を防止するようになって小さなウェルを有するスライドチャンバーを使用することが好ましいです。
3. 被覆カバースリップポリ-L-リジン200μlで（またはスライドチャンバー）（MW 150~300キロダルトン）、0.1％（w / v）の溶液とは、rで5分間インキュベートOOM温度（RT）は、室温で少なくとも1時間除去し、乾燥しました。
4. 注意深く混合し、24ウェルプレートの休止及び活性化されたナイーブCD4 ⁺ T細胞を収集します。必要に応じて、ポリ-L-リジンコートしたカバースリップに1×10 ⁵個^の細胞を転送するために、新鮮な補充培地で調整した細胞をカウントします。 ^37°Cの 、5％CO ₂で6時間の最小値のための細胞をインキュベートします。

3.ナイーブCD4 ⁺ T細胞を収集し、安静時の固定および活性化

1. 慎重に培養した休息から培地を除去し、ナイーブCD4 ⁺ T細胞を活性化しました。
2. ゆっくりRT滅菌PBS500μlのを追加します。
   注：慎重に加え、ウェルからの溶液の除去は、カバーガラスからの細胞の剥離を防ぐことができます。
3. PBSを捨て、完全に培地を除去するために、別の500μlのPBSを追加します。
4. 4％パラホルムアルデヒド（FILTフィルタリングを500μlの添加により細胞を固定飼料を4℃で好ましい）または一晩（顕微鏡分析を妨害し得る微粒子を除去）し、室温で30分間インキュベートします。
   注意：パラホルムアルデヒドは毒性と揮発性化合物です。人間の発癌物質であることが知られています。適切な安全プロトコルで慎重に使用してください。
5. 固定液を取り出して、室温でPBSで少なくとも2回以上洗います。
6. 次のステップに進むか、染色するまで数日間4℃で500μlのPBSでプレートウェルを維持します。
   注：このプロセスの間に無菌性は、微生物の増殖を防ぐことができます。

4.染色、共焦点顕微鏡によってマウントと可視化

1. 井戸からPBSを削除してください。冷たいブロッキングバッファー（1×PBS、0.5％標準グレードのウシ血清アルブミン、1％ウシ胎児血清のpH 7.4）500μlのを追加します。氷上で20分間インキュベートします。
2. 慎重にブロッキング緩衝液を除去し、一次抗体を追加（抗ガングリオシドGD3クローンR24を、GD2クローン14G2a）、PE結合抗CD25およびAPC結合抗TCRと2.5μgの/ mlにブロッキング緩衝液中に希釈したコントロールをアイソタイプ。
3. 氷の上または一晩4℃で2時間インキュベートします。
   注：スロー軌道攪拌が望ましいです。
4. 慎重に抗体を外し、ゆっくりと500μlのPBSを追加します。二回繰り返します。
5. 二次抗体を0.1μg/ mlにブロッキング緩衝液中に希釈した（R24抗GD3、アレクサフルオロ14G2a抗GD2のための488結合またはアレクサフルオロ647結合抗IgG2aのためのFITC結合抗IgG3の）を追加します。
6. 振盪せずに暗所で氷上で1時間インキュベートします。
7. 4.4に記載のように）PBSで3回洗浄します。サンプルの脱水を避けるために十分なPBSでウェルを保管してください。
8. 0.1μgの/ mlにPBSで希釈ヘキスト333258汚れを追加します。
9. RTで15分間インキュベートし、削除します。 PBSで3回洗浄します。
10. ペーパータオル上でスライドを置き、マウントソリューション（PBS中50％グリセロール）又は商業取り付け溶液20μlを追加フェージングやサンプルから急冷避けるためです。
11. 慎重に細かいピンセットでカバースリップをピックアップしてマウントソリューションの上に置きます。細胞が接続されているカバーガラスの側面が溶液に接触していることを確認してください。マニキュアでカバーグラスをシールし、蛍光または共焦点顕微鏡を用いて分析します。

RNAの単離5.

1. 抗CD3抗体（5μg/ ml）コーティングした96ウェルプレートを準備します。刺激を完了するために、4×10 ⁴ナイーブCD4 ⁺ T細胞/ウェルで抗CD28抗体（1μg/ ml）を補充した培養培地100μlをインキュベートします。 0〜72時間37℃でインキュベートし、5％CO _2。
2. 別のポスト活性化時間後にマイクロ遠心チューブに細胞を配置します。
3. 室温で5分間、250×gで500 PBSμlの遠心分離機を追加します。
4. 上清を除去し、1ミリリットルTrizol試薬を追加します。
5. RTで5分間インキュベートし、-80でサンプルを維持します76;少なくとも24時間、C。必要なときにRNA単離に進みます。
   注：少なくとも24時間、-80℃でサンプルを残してはRNA収量を向上させます。また、手の手袋の使用は、RNアーゼによるRNAの分解を避けるために不可欠です。
6. 水浴中で2分間37℃でインキュベートすることによって試料を解凍。
7. 200μlのクロロホルムを加え、（ボルテックスによりRNAの積極的な混合を避けるために）30秒間手で激しく振ります。 RTで5分間インキュベートします。
8. 4℃で12,000×gで遠心分離15分。
9. 新しいマイクロチューブに水相を回復します。
10. 500μlのイソプロパノールを加え、チューブを3回転倒。
11. RTで10分間インキュベートし、4℃で12,000×gで10分間遠心操作します。
12. 反転により上清を捨てます。
13. 4℃で12,000×gでの氷冷75％エタノール及び遠心分離機10分の1ミリリットルを追加します。
14. 完全に上清を破棄し、開いたチューブのキャップを残してRNAペレットを乾燥させます。
    しませんE：この時点でペレットがはっきりと表示されません。とにかく進みます。
15. 分子グレードの水20μlにペレットを再懸濁。ナノドロップを用いて260 nmおよび280 nmの吸光度を測定することにより、核酸の濃度および純度を計算します。
16. 任意の従来の逆転写キットを用いてmanufacturer'sプロトコールに従って、cDNAの合成に慎重に進みます。
    注：約0.5μgのRNAは、4×10 ⁴ナイーブCD4 ⁺ T細胞から得られます。 cDNAは、RNAの100ngのより合成し、低RNAインプットキットを必要とすることなく、リアルタイムPCR反応で使用することができます。

結果

この原稿に記載されているプロトコルは、培養の良い品質と接着し、休止し、活性化されたヒトナイーブCD4 ⁺ T細胞（ 図1）をレンダリングします。活性化CD4 ⁺ T細胞は、休止状態（ 図1A）と比較して特徴的な増殖プロフィール（ 図1B）を示します。 CD25後期活性化マーカーは、共焦点顕微鏡（ 図1C）に?...

ディスカッション

説明されたプロトコルは、少数の細胞から出発したCD4 ⁺ T細胞または他の免疫細胞（ 例えば 、のPMBC、 図5）の細胞懸濁液中のガングリオシドまたはタンパク質を局在化するために使用することができます。小さなT細胞の大きさや非接着特性のために、貧しい人々の情報や低品質の蛍光顕微鏡像結果の取得細胞が正常に付着していない場合。

そ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7