Intrarrenal Inyección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En un modelo de rata de pielonefritis

Resumen

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Resumen

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Introducción

Los modelos de roedores se han utilizado para estudiar numerosas manifestaciones de la enfermedad humana, incluyendo pielonefritis e infecciones del tracto urinario (ITU). Las IU son un problema de salud global y pueden afectar a niños, hombres y mujeres de todas las edades. ^{1 , 2 , 3} La manifestación inicial de las IU incluye cistitis, y si la infección asciende a lo largo del uréter, puede aparecer una infección renal (pielonefritis). Al mismo tiempo, la prevalencia de la diabetes se aproxima a 400 millones de personas en todo el mundo. ^{4 , 5} Es importante destacar que la incidencia de UTI puede ser hasta 4 veces mayor en pacientes obesos o con diabetes mellitus tipo 2, lo que aumenta el riesgo de infección recurrente por ITU (rUTI), sepsis, fibrosis renal por pielonefritis y disfunción vesical. ^{6 , 7 , 8} RoedorLos modelos son importantes en el estudio de las ITU, porque las actuales terapias con antibióticos producen una respuesta sostenida y preventiva sólo en un subconjunto de pacientes con IU. Para mejorar el cuidado clínico de la UTI, los pasos clave son entender el mecanismo de rUTI y sus procesos fisiopatológicos de la infección aguda a la inflamación a la fibrosis, así como el impacto de la diabetes mellitus tipo 2.

El objetivo de mejorar los modelos animales es desarrollar técnicas que permitan una evaluación más precisa de la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas. Se han empleado varios enfoques diferentes para inducir pielonefritis en ratas y / o ratones para estudiar la fisiopatología del daño renal, el efecto del tratamiento antibiótico y otros aspectos del curso natural de las ITU. Un enfoque común para establecer UTI retrógrada es el cateterismo transuretral. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}Este método introduce bacterias a través de la uretra en la vejiga urinaria de animales anestesiados. Si bien esta técnica simula de cerca la pielonefritis humana, la incidencia real y la magnitud de la infección pielonefritis puede ser muy variable debido a múltiples factores, incluyendo la falta de reflujo ureteral espontáneo o urinario micción durante o inmediatamente después de la inoculación. ¹¹ Como resultado, la variabilidad experimental en la inducción de una infección pielonefritis ascendente puede limitar la utilidad de este modelo para estudiar infecciones de los riñones, así como estrategias terapéuticas.

Este informe describe un modelo de rata de pielonefritis quirúrgica donde E. coli se inyecta directamente en el riñón de rata. A pesar de que este modelo de rata es invasivo, la cantidad de E. coli suministrada al riñón puede controlarse eficazmente permitiendo una infección renal robusta e inflamación. ¹⁴ Dentro de este procedimiento, también describimosCómo estas infecciones renales inducidas pueden ser monitoreadas longitudinalmente con Imágenes de Resonancia Magnética in vivo (MRI).

Protocolo

Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados del Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucionales (IACUC) en Case Western Reserve University. La duración del procedimiento quirúrgico descrito a continuación es de aproximadamente 45-60 min. El procedimiento de MRI en sí es de aproximadamente 15 minutos para cada punto de tiempo.

1. Anestesia

1. Anestesiar la rata en una cámara de isoflurano fijada al 2% de isoflurano mezclado con oxígeno para facilitar el manejo y retención de los animales antes de administrar la anestesia inyectable intraperitonealmente.
2. Después de 3-5 minutos de exposición al isoflurano, compruebe que el animal está anestesiado y no muestra ninguna respuesta al pellizcado.
3. Además, sedar a la rata con una inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina y ketamina: 75 mg / kg de ketamina / 10 mg / kg de xilazina. Cuando realice inyecciones intraperitoneales, retire la aguja para asegurarse de que las porciones del intestino u otros órganos vitales no hayan sido perforadas.
4. yoInyectar 2 mg / kg de bupivacaína por vía subcutánea en el sitio de la incisión para proporcionar alivio tópico del dolor.

2. Preparación del área quirúrgica

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y los suministros antes de que se usen para la cirugía y colocar en la almohadilla quirúrgica para la esterilidad. La mayoría de los instrumentos y suministros pueden autoclavarse y reutilizarse.
2. Use guantes estériles para todos los procedimientos quirúrgicos.
3. Use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar la piel del lado derecho del animal. Afeitar el animal desde el fondo de la caja torácica hasta la parte superior de la pata trasera, proporcionando un gran área sin pelo para la incisión.
4. Coloque el animal sobre una almohadilla quirúrgica estéril para aislar el área desinfectada de las áreas circundantes.
5. Frote la piel con un desinfectante como povidona yodada o betadina. Comience el lavado en el centro del sitio quirúrgico y muévase al exterior en una manera circular. Repita al menos tres veces con un nuevo trapo de yodo povidona o betadina.
Fregar el sitio quirúrgico con algodón con alcohol 70% hasta que la piel está clara, ya que el yodo puede ser tóxico si se absorbe.

3. Procedimiento quirúrgico

1. Mantener este procedimiento bajo condiciones asépticas.
2. Coloque el animal anestesiado en un lecho calentador caliente en posición de decúbito lateral izquierdo con el flanco derecho hacia arriba.
   NOTA: Se debe tener cuidado de mantener la temperatura corporal del animal a 35-37 ° C para prevenir la hipotermia. Esta cama de calentamiento también debe esterilizarse según sea necesario para mantener condiciones asépticas.
3. Sentirse por la caja torácica y realizar una pequeña incisión retroperitoneal dorsal derecha de 2-3 cm con una cuchilla de bisturí estéril de tamaño 10 que comienza en la parte inferior de la caja torácica.
4. Coloque gasa estéril longitudinalmente a lo largo de ambos lados de la incisión.
5. Diseccionar el tejido subcutáneo, la grasa y los músculos para visualizar y acceder a la cavidad abdominal. Utilice las tijeras Mayo de hoja curvada para permitir una penetración más profundaRación en la herida y cortar tejidos gruesos.
6. Una vez que el hígado es claramente visible y accesible, use fórceps romos para retraer el hígado hacia arriba.
7. Usando otro par de fórceps romos en la otra mano, exponga el riñón derecho para que se sienta justo fuera de la cavidad abdominal.
8. Utilice el dedo indicador y el pulgar de la mano izquierda para mantener el riñón en posición. Con la mano derecha, inyectar lenta y firmemente 0,1 ml de solución de E. coli UTI89 (concentración entre 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) desde una jeringa estéril hasta la pelvis renal (que aparece como una burbuja blanca) ¹⁵ .
   NOTA: Preparar el título bacteriano como se describe en la referencia ¹⁵ .
9. Coloque una tira de hemostasis absorbible sobre la aguja para evitar la salida del inóculo al peritoneo. Lentamente jale la aguja de la pelvis renal.
   NOTA: Debe tenerse cuidado de no perforar o infectar los tejidos circundantes resultando en infecciones fuera deOns y / o complicaciones.
10. Use una jeringa más grande para enjuagar completamente el riñón con solución salina normal antes de volver a colocarla en la cavidad abdominal.

4. Suturas

Nota: La sutura que será enterrada en los tejidos debe ser 4-0 suturas trenzadas no absorbibles. Se pueden usar suturas absorbibles o monofilamento para superficies corporales.

1. Coloque las suturas de manera uniforme y tan cerca del borde del tejido como sea posible para evitar la obstrucción del flujo sanguíneo; Típicamente no más de 0,3 cm del borde es necesario.
2. Agarre la piel y retírela ligeramente usando un par de fórceps dentados finos, y gire el soporte de la aguja en una posición pronada en preparación para perforar la piel.
3. Conduzca la aguja a través del espesor total de la piel supinando la muñeca para girar la aguja y pasarla a través de la piel.
4. Repita este proceso para el borde de la piel más cercano al individuo que realiza el procedimiento.
5. ApretarLas suturas lo suficiente como para oponerse a los bordes de los tejidos. Cualquier restricción obstruirá el suministro de sangre, cicatrización lenta de la herida y puede resultar en dehiscencia.
6. Sujete la sutura con nudos cuadrados, como si fuera una simple puntada interrumpida, excepto que sólo se cortó la hebra corta, dejando alrededor de una cola de 3-4 mm.
7. Después de haber atado la primera puntada, prepárese para colocar una segunda puntada a unos 3 mm de distancia de la primera, y continúe con la sutura en marcha.
8. Una vez que se ha alcanzado el final de la incisión, no tire completamente de la última puntada. En su lugar, utilice el lazo que se mantiene con el soporte de la aguja aquí como el cordón corto con el fin de amarrar el extremo distal del cierre de la sutura.
9. Usando los lazos del instrumento, atar la sutura usando nudos cuadrados. Esto da lugar a 3 hilos que sobresalen del nudo completo en el extremo distal.

5. Recuperación de animales

1. Inyectar 2,1 mg / kg de Yohimbina intraperitonealmente después de la cirugía para revertir la anestesia. UNSe espera que los nimales se recuperen completamente del procedimiento quirúrgico después de 3-5 h.
2. Mantenga el animal en una almohadilla de calentamiento (para evitar la hipotermia) y ropa de cama blanda absorbente después de la cirugía.
3. Proporcionar rehidratación con líquidos orales o parenterales hasta que pueda volver a la alimentación normal (dentro de las 24 horas). Inyectar aproximadamente 0,6 ml de solución salina normal peritonealmente inmediatamente después de la cirugía para limitar los efectos de la deshidratación.
4. Proporcionar analgesia como se describe en el IACUC aprobado Animal Care and Use Protocol. Inyectar 5 mg / kg de carprofeno por vía subcutánea para el tratamiento del dolor.
5. Monitorear las incisiones con regularidad por hinchazón, exudado, dolor o dehiscencia.

6. Validación mediante Imágenes de Resonancia Magnética

1. Realización de experimentos de resonancia magnética en vivo en escáneres de RMN de animales pequeños de alto campo.
2. Inducir la anestesia con isoflurano al 3% en oxígeno y colocar al animal con el riñón derecho en el isocentro en el escáner de RM y apropiarseBobina de radiofrecuencia. Proporcionar a los animales con 1-2% de anestesia de isoflurano continuamente durante el procedimiento de imagen a través de una nosecone.
   NOTA: Para las imágenes de IRM in vivo mostradas en la Figura 1 , se utilizó una bobina de volumen de tamaño de rata (diámetro interior = 72 mm).
3. Use un sistema de monitoreo y control de animales para mantener la tasa de respiración de cada animal (40-60 respiraciones / min) y la temperatura corporal central (35 ± 1 ° C).
4. Utilice una adquisición de resonancia magnética de eco de spin multi-rebanada y multi-eco para obtener imágenes axiales de alta resolución en T2 de los riñones infectados y de control. Los parámetros típicos de adquisición de MRI son el tiempo de repetición = 5.000 ms, el tiempo de eco = 40 ms, el grosor de corte = 2.0 mm, la resolución espacial en el plano = 200 μm, 3 medias de señal y un tiempo de adquisición de 8 min.

Resultados

Las técnicas de imagen médica ofrecen la oportunidad de evaluar de forma no invasiva la IU y la eficacia terapéutica. Por lo tanto, la resonancia magnética se utilizó para validar la inducción de infección aguda después de la inyección de 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli , y para visualizar los cambios en el riñón antes y después de la cirugía. La Figura 1a-b muestra una región progresivamente creciente de la infección renal (flechas amarillas)...

Discusión

La pielonefritis aguda ascendente en roedores (es decir, ratones y ratas) puede ser producida por cateterización transuretral. ^{16 , 17 , 18} Este método de infección transuretral es ventajoso porque no es invasivo y imita la fisiopatología humana de la infección ascendente. ^{17 , 18 , 19 , 20}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR