JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Özet

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Giriş

Kemirgen modelleri, piyelonefrit ve idrar yolu enfeksiyonları (UYE) de dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalık bulgusu üzerinde çalışmak için kullanılmıştır. İYE'ler küresel bir sağlık sorunudur ve her yaştan çocukları, erkekleri ve kadınları etkileyebilir. 1 , 2 , 3 ĐYE'lerin başlangıç ​​tezahürü sistit içerir ve infüzyon üretere yükselirse böbrek enfeksiyonu (pyelonefrit) izlenebilir. Aynı zamanda, diyabet prevalansı dünya çapında 400 milyon kişiye yaklaşıyor. 4 , 5 Obezite olan veya tip 2 diabetes mellitus olan hastalarda İYE insidansı, 4 kez daha yüksek olabilir ve bu da tekrarlayan İYE enfeksiyonu (rUTI), sepsis, piyelonefritten renal fibrozis ve mesane disfonksiyonu riskinde artışa neden olur. 6 , 7 , 8 KemirgenModeller, ĐYE'lerin incelenmesinde önemlidir, çünkü mevcut antibiyotik terapileri sadece ĐY

Hayvan modellerini geliştirmenin amacı, hastalık ilerlemesinin ve terapötik müdahalelerin daha doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan teknikler geliştirmektir. Sıçanlarda ve / veya farelerde böbrek hasarının patofizyolojisini, antibiyotik tedavisinin etkilerini ve diğer ĐYE'lerin doğal seyrini incelemek için pyelonefriti indüklemek için çeşitli farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Retrograd İYE'nin kurulması için ortak bir yaklaşım, transüretral kateterizasyondur. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Bu yöntem, bakterileri üretra yoluyla anestezi altındaki hayvanlardaki idrar torbasına sokar. Bu teknik insan pyelonefritini yakından taklit ederken, pyelonefrit enfeksiyonunun asıl insidansı ve büyüklüğü, aşılama sırasında veya hemen sonrasında spontan üreterik reflü eksikliği veya üriner boşalma dahil olmak üzere çok faktör nedeniyle aşırı değişkenlik gösterebilir. 11 Sonuç olarak, yükselen pyelonefrit enfeksiyonunu indüklemedeki deneysel değişkenlik böbrek enfeksiyonlarını ve terapötik stratejileri incelemek için bu modelin faydasını kısıtlayabilir.

Bu rapor, E. coli'nin sıçan böbreğine doğrudan enjekte edildiği cerrahi bir pyelonefrit fare modelini tanımlamaktadır. Bu sıçan modelinin invaziv olmasına rağmen, böbreklere verilen E. coli miktarı, etkili bir şekilde kontrol edilerek sağlam bir böbrek enfeksiyonu ve enflamasyon sağlar. 14 Bu prosedür dahilinde ayrıca,In vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) ile bu indüklenen renal enfeksiyonların boylamsal olarak izlenebileceği.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Case Western Reserve Üniversitesi'nde onaylanmış Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokollerine göre gerçekleştirildi. Aşağıda tarif edilen cerrahi işlemin süresi yaklaşık 45-60 dk'dır. MR işlemi her zaman noktası için yaklaşık 15 dakika sürer.

1. Anestezi

  1. İntra-peritoneal enjekte edilebilir anestezi uygulamadan önce hayvanın taşınmasını ve kısıtlanmasını kolaylaştırmak için oksijen ile karıştırılmış% 2 izofluran seti olan izofluran bölmesindeki sıçana anestezi uygulayın.
  2. İzofluran'a maruz bırakıldıktan 3-5 dakika sonra, hayvanın anestezi altında olup olmadığını kontrol edin ve parmak sıkışmasına tepki göstermeyin.
  3. İntra peritoneal bir ksilazin ve ketamin karışımı ile sedat sıçanı: 75 mg / kg ketamin / 10 mg / kg xylazin. İntra peritoneal enjeksiyon yaparken, bağırsağın veya diğer hayati organların parçalarının delinmediğinden emin olmak için iğneyi geri çekin.
  4. benTopikal ağrı kesici sağlamak için insizyon alanına subkutanöz olarak 2 mg / kg bupivakain konulmalıdır.

2. Cerrahi Alanın Hazırlanması

  1. Ameliyat için kullanılmadan önce cerrahi aletleri ve malzemeleri sterilize edin ve sterilite için cerrahi yastığa yerleştirin. Çoğu araç ve gereç otoklavlanabilir ve tekrar kullanılabilir.
  2. Tüm cerrahi işlemler için steril eldiven kullanın.
  3. Hayvanın sağ tarafındaki kürkü tıraş etmek için elektrikli tıraş bıçağı kullanın. Hayvanı kaburga kafesinin altından arka bacağın üst kısmına traş için büyük saçsız alan sağlayacak şekilde tıraş edin.
  4. Hayvanı, steril bir cerrahi yastığa yerleştirerek dezenfekte edilen bölgeyi çevredeki alanlardan ayırın.
  5. Cildinizi povidon iyot veya betadin gibi bir dezenfektan ile ovun. Cerrahi alanın merkezinde ovma işlemine başlayın ve dairesel bir şekilde dışarıya doğru hareket ettirin. Yeni bir povidon iyot veya betadin silinerek en az üç kez tekrarlayın.
  6. İyot emilirse toksik olabilir, cilt berrak oluncaya kadar cerrahi alanı% 70 alkollü çubuk ile ovun.

3. Cerrahi İşlem

  1. Bu işlemi aseptik koşullar altında koruyun.
  2. Anestezi altındaki hayvanı sağ yan yüzü yukarı bakacak şekilde sol yanal dekübitüs pozisyonunda sıcak bir ısıtma yatağına yerleştirin.
    NOT: Hipotermiyi önlemek için hayvanın çekirdek vücut ısısını 35-37 ° C'de tutmak için özen gösterilmelidir. Bu ısıtma yatağı, aseptik koşulları korumak için gerektiğinde sterilize edilmelidir.
  3. Kaburga kafesini hissedin ve kaburga kafesinin altından başlayan steril bir boy 10 kestane bıçağı kullanarak küçük 2-3 cm sağ dorsal retroperitoneal kesi yapın.
  4. İnsizyonun her iki yanında uzunlamasına steril gazlı bez koyun.
  5. Karın boşluğunu görselleştirmek ve erişmek için subkutanöz dokuyu, yağ ve kasları parçalayın. Daha derinlere nüfuz edebilmek için kıvrımlı bıçaklı Mayo makas kullanınRasyonunu yara haline getirin ve kalın dokuları kesin.
  6. Karaciğer açıkça görünür ve erişilebilir olduğunda, karaciğeri yukarıya doğru geri çekmek için künt forseps kullanın.
  7. Öte yandan başka bir çift künt forseps kullanmak, sağ böbrekleri ortaya çıkararak karın boşluğunun hemen dışına oturur.
  8. Böbrek yerlerine tutturmak için işaretçisiyle parmağınızı ve sol elinizin başparmağını kullanın. Sağ elle, steril bir şırınga ile böbrek leğene (beyaz bir kabarcık olarak görülen) 15 ° C'de 0.1 ml UTI89 E. coli solüsyonu (1 x 10 8 -1 x 10 9 arasında konsantrasyon) enjekte edin 15 .
    NOT: Bakteriyel titreyi referans 15'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  9. İnokulumun periton içerisine akmasını önlemek için iğne üzerine emilebilir bir hemostat şerit yerleştirin. İğneyi yavaşça böbrek pelvisinden çekin.
    NOT: Çevredeki dokuları delmemeye veya enfekte etmemeye özen gösterilmeli ve bu da hedef dışı enfeksiyona neden olmaktadır.Ons ve / veya komplikasyonlar.
  10. Karın boşluğuna geri koymadan önce böbrekleri normal tuzlu su ile iyice durulamak için daha büyük bir şırınga kullanın.

4. Sütürler

Not: Dokularda gömülecek sütür, absorpsiyon yapılmayan 4-0 örgülü dikiş olmalıdır. Emilebilir veya monofilament sütürler vücut yüzeyleri için kullanılabilir.

  1. Kan akışının engellenmesini önlemek için dikişleri eşit ve doku kenarına mümkün olduğunca yakın yerleştirin; Tipik olarak kenardan en fazla 0,3 cm uzaklıkta olmalıdır.
  2. Deriyi tutun ve bir çift güzel dişli forseps kullanarak hafifçe döndürün ve cildi delmek için hazırlıklı olarak iğne tutucusunu öne eğik bir konuma çevirin.
  3. İğneyi döndürmek ve deriden geçirmek için bilekleri sarkıtarak iğneyi cildin tam kalınlığına doğru itin.
  4. İşlemi yapan kişiye en yakın cilt kenarı için bu işlemi tekrarlayın.
  5. sıkmakDoku kenarlarına karşı koyacak kadar sütürler. Herhangi bir sıkılaştırma kan dolaşımını engelleyecek, yavaş yara iyileşmesi ve çatlamaya neden olabilir.
  6. Dikdörtgen düğümleri kullanarak sütürü sanki basit bir kesilen dikişmiş gibi sıkın, ancak kısa şerit kesilir, yaklaşık 3-4 mm'lik bir kuyruk bırakılır.
  7. İlk dikiş bağlandıktan sonra, ilk dikiş yaklaşık 3 mm uzaklıkta ikinci bir dikiş yerleştirmeye hazırlanın ve devam eden dikişe devam edin.
  8. İnsizyonun sonuna gelindiğinde, son dikişi tamamen içeri doğru çekmeyin. Bunun yerine, dikiş kapağının distal ucunu birbirine bağlamak için iğne tutacağı ile burada tutulan ilmek kısa şerit olarak kullanın.
  9. Bağlama kravatlarını kullanarak dikiş ipliğini kare düğümlerle birbirine bağlayın. Bu, 3 ucun tamamlanmış düğümden uzak uca yapışmasına neden olur.

5. Hayvan Kurtarma

  1. Anestezi tersine çevirmek için ameliyattan sonra intra-peritoneal olarak 2.1 mg / kg Yohimbine enjekte edin. bir3-5 saat sonra nimalslerin cerrahi prosedürden tamamen iyileşmesi bekleniyor.
  2. Hayvanı ısıtma yastığı (hipotermiden kaçınmak için) ve ameliyat sonrası emici yumuşak yatak takımı üzerinde tutun.
  3. Normal beslemeye geri dönene kadar oral veya parenteral sıvılar ile rehidrasyon sağlayın (24 saat içinde). Dehidrasyon etkilerini sınırlandırmak için ameliyattan hemen sonra yaklaşık 0.6 ml normal salin solüsyonunu peritoneal olarak enjekte edin.
  4. IACUC tarafından onaylanmış Hayvan Bakımı ve Kullanım Protokolünde tarif edildiği gibi analjezi sağlayın. Ağrı tedavisi için subkütan 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
  5. İnsizyonları düzenli olarak şişlik, eksüda, ağrı veya delinme için izleyin.

Manyetik Rezonans Görüntüleme yoluyla 6. Doğrulama

  1. Yüksek alanlı küçük hayvan MRI tarayıcılarında i n vivo MRI deneyleri yapın.
  2. Oksijen içinde% 3 izofluran ile anestezi indükleyin ve izobasöre doğru böbrek ile yerleştirin.Radyofrekans bobini yedi. Bir nosekondan görüntüleme prosedürü boyunca sürekli olarak% 1-2 izofluran anestezi uygulanan hayvanlara sağlayın.
    NOT: Şekil l'de gösterilen in vivo MR görüntüleri için sıçan boyutunda hacim bobini (iç çap = 72 mm) kullanıldı.
  3. Her hayvanın solunum hızını (40-60 nefes / dakika) ve çekirdek vücut sıcaklığını (35 ± 1 ° C) korumak için bir hayvan izleme ve kontrol sistemi kullanın.
  4. Hem enfekte hem de kontrol böbreklerinin yüksek çözünürlüklü, eksenel T2 ağırlıklı görüntüleri elde etmek için çok dilimli, çok eko-spinli bir eko MR görüntü alımı kullanın. Tipik MR görüntüleme parametreleri, tekrar süresi = 5.000 ms, eko süresi = 40 ms, dilim kalınlığı = 2.0 mm, düzlemsel uzaysal çözünürlük = 200 μm, 3 sinyal ortalamaları ve 8 dakikalık bir edinme zamanıdır.

Sonuçlar

Tıbbi görüntüleme teknikleri, İYE'yi ve terapötik etkinliği invaziv olmayan bir şekilde değerlendirme fırsatı sunar. Bu nedenle, MR 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli'nin enjeksiyonundan sonra akut enfeksiyon uyarılmasını doğrulamak için ve ameliyat öncesi ve sonrası böbrek değişiklikleri görselleştirmek için kullanılmıştır. Şekil 1a-b , giderek artan böbrek enfeksiyonu bölgesini gösterir (sarı oklar). Enfeksiyon sonras?...

Tartışmalar

Kemirgenlerde artan akut pyelonefrit (örn. Fare ve sıçanlar) transüretral kateterizasyon ile üretilebilir. 16 , 17 , 18 Bu transüretral enfeksiyon yöntemi, invazif olmadığı ve artan enfeksiyonun insan patofizyolojisini taklit ettiği için avantajlıdır. 17 , 18 , 19 , 20 Bununla b...

Açıklamalar

The authors have no other disclosures.

Teşekkürler

The authors would like to acknowledge the support of NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), the Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703), and the Clinical and Translation Science Collaborative of Cleveland (NIH/NCATS UL1 TR000439).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Absorbing PadFisher14-127-47
Sterile Cotton Gauze PadFisher22-415-469
Latex Surgical GlovesHenry Schein Animal Health21540
Curved Mayo ScissorsFisherS17341
Straight Blunt ForecepsFisher08-895
Scalpel Handle Fisher08-913-5
Sterile Scalpel BladesFisher53220
1 ml Luer-Lok SyringeBD Biosciences309628For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe BD Biosciences301031For saline wash
HemostatSeneca Medical240267
23 G 3/4 in. Needle BD Biosciences305143
30 G 1 in. Needle BD Biosciences305128
U-100 Insulin SyringeExel International 25846For medication injections
IsofluraneHenry Schein Animal Health050033
XylazineHenry Schein Animal Health33197Inject IP
KetaminePatterson Vetrinary 07-881-9413Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)Patterson Vetrinary 07-867-7097Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)Patterson Vetrinary 07-890-4584Inject SQ at site of incision 
4-0 Chromic Gut SutureEthicon Inc.U203H
4-0 Braided Vicryl SutureEthicon Inc.J304H
1 ml SubQ SyringeBD Biosciences309597
E. coli  UTI89 or CFT073ATCC700928
Surgicel Absorbable HemostatEthicon Inc.ETH1951CS 
Biospec 9.4T MRI Bruker 94/20 USR

Referanslar

  1. Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
  2. Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
  3. Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
  4. Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
  5. Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
  6. Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
  7. Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
  8. Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
  9. Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
  10. Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
  11. Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
  12. Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
  13. Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
  14. Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
  15. Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
  16. Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
  17. Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
  18. Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
  19. Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
  20. Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 125PiyelonefritYEcerrahi modelb brek hastalE E coliManyetik Rezonans G r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır