Интранальная инъекция<em&gt; Escherichia coli</em&gt; В крысиной модели пиелонефрита

Резюме

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Аннотация

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Введение

Модели грызунов использовались для изучения многочисленных проявлений заболеваний человека, включая пиелонефрит и инфекции мочевых путей (ИМП). ИМП являются глобальной проблемой здравоохранения и могут влиять на детей, мужчин и женщин всех возрастов. ^{1 , 2 , 3.} Первоначальное проявление ИМП включает цистит, и если инфекция поднимается вдоль мочеточника, может появиться инфекция почек (пиелонефрит). В то же время распространенность диабета приближается к 400 миллионам человек во всем мире. ^{4 , 5} Важно отметить, что заболеваемость УТИ может быть в 4 раза выше у пациентов с ожирением или сахарным диабетом 2-го типа, что приводит к увеличению риска рецидивирующей инфекции ИМП (rUTI), сепсиса, почечного фиброза от пиелонефрита и дисфункции мочевого пузыря. ^{6 , 7 , 8} ГрызунМодели играют важную роль в изучении ИМП, поскольку современные антибактериальные терапии производят устойчивый профилактический ответ только в подгруппе пациентов с ИМП. Для улучшения клинического ухода за УТИ основными задачами являются понимание механизма rUTI и его патофизиологических процессов от острой инфекции до воспаления до фиброза, а также влияния сахарного диабета 2-го типа.

Целью улучшения моделей на животных является разработка методов, позволяющих более точно оценивать прогрессирование заболевания и терапевтические вмешательства. Было применено несколько различных подходов для индукции пиелонефрита у крыс и / или мышей для изучения патофизиологии повреждения почек, влияния лечения антибиотиками и других аспектов естественного течения ИМВП. Общим подходом к созданию ретроградной ИМП является трансуретральная катетеризация. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> Этот метод вводит бактерии через уретру в мочевой пузырь анестезированных животных. Хотя этот метод близко имитирует пиелонефрит человека, фактическая частота и величина инфекции пиелонефрита могут быть сильно варьируемыми из-за множества факторов, включая отсутствие спонтанного мочеточникового рефлюкса или мочеиспускания во время или сразу после инокуляции. ¹¹ В результате, экспериментальная изменчивость в индукции восходящий пиелонефрит инфекции может ограничить полезность этой модели для изучения инфекции почек, а также терапевтические стратегии.

В этом отчете описывается модель хирургического пиелонефрита, где E. coli непосредственно вводится в почки крысы. Несмотря на то, что эта модель крысы является инвазивной, количество E. coli, доставляемое в почку, можно эффективно контролировать, обеспечивая надежную инфекцию почек и воспаление. ¹⁴ В рамках этой процедуры мы также описываемКак эти индуцированные почечные инфекции могут контролироваться продольно с помощью магнитно-резонансной томографии in vivo (МРТ).

протокол

Все исследования на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Комитета по институциональному контролю и использованию животных (IACUC) в Университете Case Western Reserve. Продолжительность хирургической процедуры, описанной ниже, составляет приблизительно 45-60 мин. Сама процедура МРТ составляет приблизительно 15 минут для каждой временной точки.

1. Анестезия

1. Анестезируйте крысу в изофлурановой камере, установленной на 2% изофлуране, смешанном с кислородом, для облегчения обработки животных и сдержанности перед введением инъекционной анестезии внутрибрюшинно.
2. Через 3-5 минут воздействия изофлюрана убедитесь, что животное анестезировано и не имеет никакого ответа на пинч.
3. Дальнейшая седативная крыса с внутрибрюшинной инъекцией смеси ксилазина и кетамина: 75 мг / кг кетамина / 10 мг / кг ксилазина. При выполнении внутрибрюшинных инъекций оттягивайте иглу, чтобы убедиться, что части кишечника или других жизненно важных органов не были проколоты.
4. яNject 2 мг / кг бупивакаина подкожно в месте разреза, чтобы обеспечить местное облегчение боли.

2. Подготовка хирургической зоны

1. Стерилизовать хирургические инструменты и материалы, прежде чем они будут использоваться для хирургии, и выложить на хирургическую подушку для стерильности. Большинство инструментов и расходных материалов можно автоклавировать и повторно использовать.
2. Используйте стерильные перчатки для всех хирургических процедур.
3. Используйте электрическую бритву, чтобы побрить мех с правой стороны животного. Бритье животного от нижней части грудной клетки до верхней части задней ноги обеспечивает большую область без волос для разреза.
4. Поместите животное на стерильную хирургическую подушку, чтобы изолировать дезинфицированную область от окружающих областей.
5. Скраб кожи с дезинфицирующим средством, таким как повидон йод или бетадин. Начните очистку в центре хирургического участка и перемещайтесь наружу круговым способом. Повторяйте по крайней мере три раза с новой вытиранием повидона йода или бетадина.
6. Скраб хирургического сайта с 70% спиртовых мазков, пока кожа не станет прозрачной, так как йод может быть токсичным, если он поглощается.

3. Хирургическая процедура

1. Поддерживайте эту процедуру в асептических условиях.
2. Поместите обезболивающее животное на теплый нагревательный слой в левом боковом разрезе с правым боком, обращенным вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Следует соблюдать осторожность, чтобы поддерживать температуру тела основного тела животного при 35-37 ° C для предотвращения гипотермии. Этот нагревательный слой также следует стерилизовать по мере необходимости для поддержания асептических условий.
3. Почувствуйте грудную клетку и сделайте небольшой правый дорзальный забрюшинный разрез на 2-3 см, используя лезвие скальпеля стерильного размера 10, начиная с нижней части грудной клетки.
4. Поместите стерильную марлю в продольном направлении вдоль каждой стороны разреза.
5. Отсеките подкожную ткань, жир и мышцы, чтобы визуализировать и получить доступ к брюшной полости. Используйте ножницы Mayo с изогнутыми лопастями, чтобы обеспечить более глубокое проникновениеРацион в рану и разрезать толстые ткани.
6. Как только печень будет хорошо видна и доступна, используйте тупые щипцы, чтобы отвести печень вверх.
7. Используя другую пару тупых щипцов в другой руке, выставляйте правую почку, чтобы она сидела прямо за брюшной полостью.
8. Используйте указательный палец и большой палец левой руки, чтобы удерживать почку в нужном положении. С правой стороны медленно и неуклонно вводить 0,1 мл раствора UTI89 E. coli (концентрация между 1 × 10 ⁸ -1 × 10 ⁹ ) из стерильного шприца в почечную лоханку (которая появляется как белый пузырь) ¹⁵ .
   ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовьте бактериальный титр, как описано в ссылке ¹⁵ .
9. Поместите полоску абсорбируемого гемостата поверх иглы, чтобы предотвратить отток инокулята в брюшину. Медленно вытащите иглу из почечной лоханки.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Следует соблюдать осторожность, чтобы не прокалывать или не инфицировать окружающие ткани, что приводит к заражению вне мишениИ / или осложнений.
10. Используйте более крупный шприц для тщательного полоскания почки с нормальным физиологическим раствором перед тем, как поместить его обратно в брюшную полость.

4. Швы

Примечание. Шов, который будет зарыт в тканях, должен быть 4-0 неабсорбируемыми плетеными швами. Абсорбируемые или моноволоконные швы могут использоваться для поверхностей тела.

1. Поместите швы равномерно и как можно ближе к краю ткани, чтобы предотвратить обструкцию кровотока; Обычно не более 0,3 см от края.
2. Возьмитесь за кожу и слегка поверните ее, используя пару тонких зубчатых щипцов, и поверните держатель иглы в пронатанное положение, готовясь к прошивке кожи.
3. Проведите иглу через всю толщину кожи, заставив запястье вращать иглу и пропустить ее через кожу.
4. Повторите этот процесс для края кожи, ближайшего к человеку, выполняющему процедуру.
5. затянутьШвов достаточно, чтобы противостоять краям ткани. Любой более жесткий будет препятствовать кровоснабжению, медленному заживлению ран и может привести к исчезновению.
6. Закрепите шов, используя квадратные узлы, как если бы это был простой прерывистый шов, за исключением того, что разрезали только короткую нить, оставляя около 3-4 мм хвост.
7. После того, как первый шов был завязан, приготовьте второй шов примерно на 3 мм от первого и продолжайте работу шовного материала.
8. Как только конец разреза будет достигнут, полностью не протащите последний шов. Вместо этого используйте петлю, которая удерживается здесь с держателем иглы в виде короткой нити, чтобы завязать дистальный конец шовной крышки.
9. Используя инструменты, закрепите шов, используя квадратные узлы. Это приводит к тому, что 3 нити торчат из завершенного узла на дистальном конце.

5. Восстановление животных

1. Внедрить 2,1 мг / кг йохимбина внутрибрюшинно после операции для отмены анестезии.Ожидается, что после операции через 3-5 часов полностью восстановится после хирургической процедуры.
2. Держите животное на нагревательной подушке (во избежание гипотермии) и впитывающих мягких постельных принадлежностях после операции.
3. Обеспечьте регидратацию пероральными или парентеральными жидкостями, пока они не смогут вернуться к нормальному питанию (в течение 24 часов). Внесите приблизительно 0,6 мл нормального физиологического раствора в брюшную полость сразу после операции, чтобы ограничить эффект дегидратации.
4. Обеспечьте анальгезию, как описано в утвержденном IACUC протоколе по уходу за животными и использованию. Внесите 5 мг / кг carprofen подкожно для лечения боли.
5. Регулярно контролируйте надрезы для набухания, экссудации, боли или исчезновения.

6. Проверка с помощью магнитно-резонансной томографии

1. Проведение я п Vivo экспериментов МРТ на высоких полевую МРТ сканеров небольших животных.
2. Вызвать анестезию с 3% изофлураном в кислороде и разместить животное с правой почкой в ​​изоцентре в МРТ-сканере и соответствующим образомЕли радиочастотную катушку. Обеспечьте животных 1-2% изофлурановой анестезией непрерывно во время процедуры визуализации с помощью носекона.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для изображений МРТ in vivo, показанных на рисунке 1 , использовалась объемная обмотка крысы (внутренний диаметр = 72 мм).
3. Используйте систему контроля и контроля животных, чтобы поддерживать скорость дыхания каждого животного (40-60 вдохов / мин) и температуру тела ядра (35 ± 1 ° C).
4. Используйте мультиреакцию с множественным эхо-эхо-повторением MRI для получения изображений с высоким разрешением, осевых T2-взвешенных изображений как инфицированных, так и контрольных почек. Типичными параметрами получения МРТ являются время повторения = 5000 мс, время эха = 40 мс, толщина среза = 2,0 мм, пространственное разрешение в плоскости = 200 мкм, 3 средних сигнала и время захвата 8 мин.

Результаты

Медицинские методы визуализации дают возможность неинвазивно оценивать ИМП и терапевтическую эффективность. Поэтому МРТ использовалась для подтверждения индукции острой инфекции после инъекции 1-2 × 10 ⁷ UTI89 E. coli и для визуализации изменений в почках до и по...

Обсуждение

Восходящий острый пиелонефрит у грызунов (т.е. мышей и крыс) может быть получен путем трансуретральной катетеризации. ^{16 , 17 , 18} Этот метод трансуретральной инфекции выгоден тем, что он неинвазивный и имитирует патофизиологию челове...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR