Técnicas de Manga Gástrica y modificación de Roux-en-Y bypass gástrico en ratones

Resumen

Bariatric surgery is the most efficient way to reduce body weight and the deadly metabolic complications (diabetes, obesity, and dyslipidemia) frequently associated with morbid obesity. Mouse models of bariatric surgery represent a unique asset for deciphering molecular mechanisms behind the beneficial effects of these surgeries on diabetes, hypertension, and dyslipidemia.

Resumen

La obesidad es un importante problema de salud pública, con una prevalencia de 4 a 28% para los hombres y 6.2 a 36.5% para las mujeres en Europa (de 2003 a 2008). La obesidad mórbida se asocia con frecuencia a complicaciones metabólicas, como la diabetes tipo 2, hipertensión y dislipidemia, la reducción de la esperanza de vida y la calidad. En la ausencia de tratamientos no invasivos eficaces, la cirugía bariátrica es una valiosa opción terapéutica para los pacientes con obesidad mórbida (índice de masa corporal (IMC)> 40 kg / m ^2), que conduce a largo plazo, la pérdida de peso y la mejora de las complicaciones metabólicas sostenida . Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que sostienen los efectos beneficiosos de la cirugía bariátrica aún no se entienden completamente. Debido a las numerosas cepas genéticamente modificadas disponibles, el modelo de ratón es el modelo animal más conveniente para explorar los mecanismos moleculares detrás de los efectos beneficiosos pleiotrópicos de la cirugía bariátrica. A continuación, detallamos la Healthc optimizadoson métodos y protocolos quirúrgicos en los ratones de los dos cirugías bariátricas más ampliamente utilizados: la manga gástrica y el bypass gástrico Roux-en-Y modificada. Descifrar los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos terapéuticos de la cirugía bariátrica ofrece la promesa de la identificación de nuevas dianas terapéuticas.

Introducción

La pandemia mundial de la obesidad y la diabetes es devastador en gravedad. Más de dos mil millones de adultos en todo el mundo (30% de la población) tienen sobrepeso (IMC> 25 kg / m ²⁾ u obesidad (IMC> 30 kg / m ^{2) 1.} Esto puede venir junto con las complicaciones metabólicas, como la diabetes tipo 2, hipertensión y dislipidemia, lo que lleva a un aumento de la morbilidad y la mortalidad. La obesidad aumenta la mortalidad global y la prevalencia de cáncer ^2. Debido a la falta de tratamientos no invasivos eficaces, la cirugía bariátrica representa la única opción que puede conducir a largo plazo, la pérdida de peso sostenida ^{3, 4.} Un número de diferentes métodos quirúrgicos se han desarrollado, pero la gastrectomía en manga (SG) y el bypass gástrico Roux-en-Y (BGYR) son los dos procedimientos más utilizados en la práctica clínica. Durante el procedimiento de SG, 80% del volumen inicial del estómago esremoto; Por lo tanto, esta técnica es una de las cirugías restrictivas que mejora la sensación de saciedad. El BGYR es una de las técnicas restrictivas-malabsorción. Durante DGYR, se crea una pequeña bolsa gástrica (1-2% del volumen gástrico total) y el intestino se reordena en una forma de Y, lo que retrasa la digestión y la absorción de nutrientes. Estas dos técnicas conducen a una reducción significativa del peso corporal y la mejora general de las comorbilidades asociadas con frecuencia (por ejemplo, la hipertensión, la diabetes tipo 2 y dislipidemia) ^3, con una mayor eficiencia se ve en DGYR. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de los efectos beneficiosos pleiotrópicos de las cirugías bariátricas a menudo no están completamente aclarada. Debido a las numerosas cepas genéticamente modificadas disponibles, un modelo de ratón es el modelo animal más conveniente para explorar estos mecanismos moleculares.

Sin embargo, los procedimientos bariátricos son difíciles de adaptar directamente a los pequeños modelos animales y requirE High destreza quirúrgica. Mientras SG se puede realizar fácilmente en roedores con una muy buena tasa de supervivencia, DGYR es letal en ratones debido a las obstrucciones intestinales graves ^5. Se han propuesto diferentes técnicas de BGYR modificados para contrarrestar este problema, en particular el oesojejunostomy ^5. A continuación, presentamos otra alternativa: la gastroyeyunostomía sin extirpación del estómago. Este DGYR modificado reproduce la mayor parte de los efectos beneficiosos observados en los seres humanos (es decir, una reducción de peso corporal significativa y una mejora de la glucosa y de lípidos homeostasis).

Este manuscrito tiene como objetivo resumir y discutir los detalles técnicos y experimentales de SG y DGYR en ratones y facilitar estos procedimientos con la ayuda de vídeos. Se hará un destacado específica con respecto a la optimización de los protocolos sanitarios preoperatorios y postoperatorios que permiten la reducción de las vitaminas y de hierro.

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Protocolo

Y alojamiento de animales: Obtener C57BL / 6 ratones machos de 8 semanas de edad. A las 10 semanas de edad, dar a los ratones C57BL / 6 libre acceso al agua y una dieta alta en grasas (DIO dieta: 35% kcal de la grasa, el 25,8% de caseína, 1,30% AIN mineral, 1,30% de vitaminas, 1,70% de fosfato dicálcico, 0,7 carbonato% de calcio, 2,10% citrato de potasio, 0,026% bitartrato de colina, un 8,9% de sacarosa, 0,384% cistina, 6,5% de celulosa, el 31,7% de manteca de cerdo, aceite de soja 3,3%, y 16.29% de maltodextrina) de 8 (SG) o 14 (BGYR) semanas antes de la cirugía bariátrica. Para promover el aumento de peso, dar a los ratones dedicada a la cirugía DGYR (farsa y DGYR) agua que contiene 20% de fructosa (w / v), además de la dieta alta en grasas.

Ética Declaración: Todos los pasos del protocolo se describen a continuación sigue las directrices del Comité de Ética de Experimentación Animal de Pays de la Loire bajo el número de homologación de 01.953,01.

1. Preparación preoperatoria general

1. Ayunar a los ratones durante 6 h antes de la cirugía. Gel diy se le dio comida de 3 días antes de la cirugía y exclusivamente un día antes de la cirugía. Inducir la anestesia en una cámara con 5% de isoflurano (0,4 L / min) y O ₂ (dioxígeno; 0,4 L / min). Realizar una prueba de dedo del pie-pellizco para confirmar que la anestesia es eficaz. Administrar analgésicos (0,1 mg / kg de buprenorfina), antibióticos (10 mg / kg marbofloxacine), y pro-cinética (1 mg / kg de metoclopramida) a través de inyecciones subcutáneas.
2. Asignar un área de trabajo específica para los procedimientos quirúrgicos (distantes de los fans de tráfico de laboratorio y de ventilación). Limpiar la zona quirúrgica con desinfectantes de superficies duras reservados. Coloque una almohadilla térmica en el área de espacio de trabajo para mantener homeotermia ratón durante la cirugía. Aplicar una almohadilla inferior absorbente y limpia sobre el cojín eléctrico.
3. Afeitarse el abdomen desde el esternón hasta la pelvis usando una máquina de afeitar eléctrica. Envolver el abdomen del ratón en una envoltura de plástico esterilizada (Figuras 1A y 2A) y colocar el puntero del ratón en la posición supina sobre el calentamiento panuncio.
4. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Coloque el ratón en el cono de la nariz y mantener la anestesia con isoflurano al 2% (0,4 L / min) y O ₂ (0,4 L / min).
5. Antes de comenzar la cirugía, se puso una bata estéril examen, una gorra batas desechables, mascarillas y guantes estériles. Abrir un paquete de autoclave que contiene un conjunto instrumento quirúrgico esterilizado, que se requiere para todos los pasos de la cirugía. Cortar una ventana en la envoltura de plástico esterilizada y desinfectar la piel con 2 soluciones sucesivas de povidona-yodo.

2. Manga Gástrica: Procedimiento quirúrgico

1. Laparotomía media (Figura 1B)
   1. Bajo un microscopio binocular y con un escalpelo, realizar una incisión en la línea media desde el esternón hasta la mitad del abdomen para abrir la cavidad abdominal (no dañar los músculos abdominales). Proteger la piel con una compresa estéril empapada con solución salina C 37 °.
2. La exposición del estómago (Figura 1C)
   1. movilizar suavemente el estómago utilizando hisopos de algodón humedecido. Liberar el estómago de sus laterales estrechos adjuntos tejido conectivo utilizando hisopos de algodón humedecidos o micro tijeras.
   2. Suavemente, externalizar el estómago completamente y colocar un colágeno hemostático comprimir detrás del estómago. Suturar el píloro y vasos esófago a lo largo de la curvatura mayor del estómago con 8,0 suturas no absorbibles para evitar futuras hemorragia (Figura 1D y E). Nota: El uso hemostático puede inducir daño tisular, asegúrese de utilizar solamente en los tejidos que tienen como objetivo ser resecados.
3. Resección de la región cardiaca del estómago (fondo)
   1. Realizar una gastrotomía en la línea anatómica presente entre la región pilórica (corpus) y la región cardiaca de estómago (fondo) (Figura 1F).
   2. Retire el alimento residual con 2 hisopos de algodón humedecidos hacia cada unolado del estómago. El uso de micro tijeras, corte el estómago a lo largo de la frontera entre el fundus y el corpus del estómago (Figura 1G).
   3. Presione un colágeno hemostático comprimir durante 2 minutos en caso de hemorragia grave. Cerrar la abertura del estómago con 8,0 suturas no absorbibles de la unión gastro-esofágico hasta el final de la incisión (Figura 1H).
4. La resección de la región pilórica del estómago (corpus)
   1. Completar la resección del estómago a lo largo de la curvatura mayor con el fin de eliminar aproximadamente 80% del estómago (Figura 1I). Estandarizar el ancho de la SG a 3 mm. Presione un colágeno hemostático comprimir durante 2 minutos en caso de hemorragia grave.
   2. Cerrar la abertura de la región pilórica del estómago con 8,0 sutura no absorbible (Figura 1J). rodar suavemente 2 hisopos de algodón humedecidos hacia cada lado del estómago para asegurar que la sutura es a prueba de fugas.
   3. Completar con 8,0 puntos de sutura no absorbibles en caso de fuga. Retire las compresas de colágeno hemostáticos y devolver el estómago a la cavidad abdominal. Deja un colágeno hemostático comprimir contra la sutura.
5. cierre abdominal
   1. Cierre la capa muscular de la pared abdominal con 5,0 suturas no absorbibles (Figura 1C). Reducir la anestesia mediante la reducción de la concentración de isoflurano al 1%. Cierre la piel con 5,0 suturas no absorbibles (Figura 1 l).

3. Roux-en-Y bypass gástrico: Procedimiento quirúrgico

1. laparotomía media
   1. Bajo un microscopio binocular y con un escalpelo, realizar una incisión en la línea media desde el esternón hasta la mitad del abdomen para abrir la cavidad abdominal (no dañar los músculos abdominales). Proteger la piel con una compresa estéril empapada con 37 ° C una solución salina (Figura 2B).
2. Asa biliopancreática y asa alimentaria
   1. Exteriorizar el intestino (Figura 2C). Medida 8 cm del píloro y realizar dos ligaduras del intestino con 5,0 suturas no absorbibles (Figura 2D).
   2. Cortar el intestino entre las dos ligaduras (Figura 2E). Coloque la extremidad proximal de los dos extremos en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Nota: Esto se utiliza como el asa alimentaria (Figura 2F).
   3. Coloque la extremidad distal de los dos extremos que se enfrenta el asa alimentaria 6 cm por debajo de la extremidad proximal (Figura 2F).
      NOTA: Este será utilizado como el miembro biliar.
3. Yeyuno-yeyunostomía
   1. Cortar tanto la extremidad proximal y el bucle de intestino utilizando micro tijeras y realizar dos incisiones antimesenteric de la misma longitud (Figura 2G y 2H).
   2. Realizar lado a lado anastomosis con dos 8,0Las suturas no absorbibles. Realizar la anastomosis lado dorsal primero (Figura 2I), seguida de la anastomosis lado ventral (Figura 2J).
   3. rodar suavemente 2 hisopos de algodón humedecidos hacia cada lado de la anastomosis para garantizar que la sutura es a prueba de fugas. Completar con 8,0 puntos de sutura no absorbibles en caso de fuga.
4. Gastro-yeyunostomía
   1. movilizar suavemente el estómago utilizando hisopos de algodón humedecidos. Liberar el estómago de sus laterales estrechos adjuntos tejido conectivo utilizando hisopos de algodón humedecidos o micro tijeras.
   2. Suavemente, exteriorizar el estómago completamente, la colocación de un re-absorbible colágeno hemostático comprimir detrás del estómago. Realizar una ligadura del píloro utilizando una sutura no absorbible 5.0 pasado a través del epiplón utilizando pinzas micro curvas (Figura 2K y 2L).
   3. Cortar tanto en el lado ventral del estómago, 1,5 cm desde el píloro, y la extremidad distalutilizando micro tijeras, creando dos incisiones de la misma longitud (Figura 2 M).
   4. Realizar la anastomosis de lado a lado con dos 8,0 suturas no absorbibles. Comience con la anastomosis lado dorsal (Figura 2 N), y luego realizar la anastomosis lado ventral (Figura 2O). rodar suavemente 2 hisopos de algodón humedecido hacia cada lado de la anastomosis para garantizar que la sutura es a prueba de fugas. Completar con 8,0 puntos de sutura no absorbibles en caso de fuga.
5. cierre abdominal
   1. Cierre la capa muscular de la pared abdominal usando 5,0 suturas no absorbibles (Figura 2P). Reducir la anestesia mediante la reducción de la concentración de isoflurano al 1%. Cierre la piel utilizando 5.0 suturas no absorbibles (Figura 2Q) .Administer 25 ml / kg de solución salina caliente a través de la inyección subcutánea.

4. general Cuidado posoperatorio

1. Deja de isofluranoy continuar con un flujo de _O2 de 0,8 l / min hasta que el ratón está totalmente despierto. No deje desatendido el ratón hasta que recupera el control motor, indicado por la partida de los animales a moverse alrededor de la jaula y ser capaz de ponerse de pie y caminar sin caerse.
2. Coloque el ratón (sólo un ratón por jaula) en una incubadora bajo condición de temperatura de 30 ° C durante 5 días.
3. Mantener hierro (0,5 mg / kg / día; inyección subcutánea) y vitamina (800 mg / 180 ml en agua) supplementations en los ratones DGYR hasta el final del protocolo.
4. Devolver el libre acceso a la dieta gel de alimentos (dieta con gel de alto contenido de grasa: 10% de manteca de cerdo, azúcar líquido al 10%, el 57% de agua) durante 5 días después de la cirugía. Reintroducir una dieta sólida de 3 días después de la cirugía.
5. Por vía subcutánea inyectar buprenorfina (0,1 mg / kg, dos veces al día, desde el día 0 al día 3 después de la cirugía), meloxicam (1 mg / kg, desde el día 0 al día 3 después de la cirugía), la metoclopramida (1 mg / kg, desde el día 0 a 5 días después de la cirugía), y marbofloxacine (10 mg / kg, desde el día 0 hasta el día 3 faet cirugía r).

5. La evaluación postoperatoria metabólico Parámetros

1. Medición de la ingesta de alimentos
   1. Permitir que los ratones se recuperen durante 1 semana después de la cirugía. Casa los ratones uno por jaula. Medir la cantidad de dieta sólida colocado en la jaula. El peso de los alimentos restantes 24 h más tarde. Repita este paso todo el tiempo necesario.
2. Test oral de tolerancia a la glucosa
   1. Ayunar a los ratones durante 6 horas antes del bolo oral. Cosecha de una gota de sangre de la punta de la cola y aplicarlo sobre una tira de glucosa insertado en un glucómetro para determinar el valor de glucosa en sangre 0 tiempo.
   2. Administrar un bolo oral de solución de D-glucosa 20% (2 g / kg). Medir los niveles de glucosa en sangre a los 15, 30, 60, y 120 minutos después de la alimentación forzada.
3. El análisis del nivel de hemoglobina
   1. El uso de un sistema de hematología, medir 20 l de sangre fresca para probar el nivel de hemoglobina.

"> 6. La eutanasia

1. Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal inyección de una solución de xilazina / quetamina (10/80 mg / kg). Realizar una dislocación cervical. Verificar la eutanasia completa, garantizando que el corazón no late y se pierde el reflejo de parpadeo globo ocular.

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Resultados

Condiciones generales

El tiempo operatorio para el procedimiento de SG fue de 49,3 ± 1,5 min. Hemos eliminado 62,8 ± 5,0 mg de estómago, lo que representa alrededor del 80% por ciento del estómago. Sin ratones murieron durante la cirugía o durante los siguientes siete días. Un ratón (7,1%) murieron en el 11 ^º día postoperatorio debido a una obstrucción gástrica causada por un bezoar.

...

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Discusión

Para superar la creciente epidemia de obesidad, los primeros procedimientos de cirugía bariátrica surgieron en la década de 1960 en los Estados Unidos. Desde entonces, el número de procedimientos realizados en todo el mundo cada año aún aumentar, y hoy en día, estas técnicas representan la mejor opción terapéutica para el tratamiento de la obesidad mórbida ^6. Entre los procedimientos desarrollados, SG y DGYR son los dos métodos más populares utilizados en la práctica clínica

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
High Fat diet	DIO diet	Safe
Isoflurane	Forane	Baxter
Buprenorphin	Buprecare	Animalcare
Marbofloxacine	Marbocyl	Vetoquinol
Ammonium iron citrate, vitamins PP-B12	Fercobsang	Vetoquinol
Vitamins A-D3-E-K-B	Vita Rongeur	Virbac
NaCl 0.9%	NaCl 0,9%
Povidone solution	Betadine Scrub	Betadine
Povidone solution	Betadine Solution	Betadine
Carboptol 980 NF	Ocrygel	TVM
Name	References	Company	Comments
Sutures
Prolene®	8.0, 6,5 mm	Ethicon
Prolene®	5.0, 13 mm	Ethicon
Name	References	Company	Comments
Surgical equipments
Scissors		FST
Needle holder	Olsen-Hegar	FST
Micro scissors	Vannas	FST
Micro forceps	Graefe	FST
Micro forceps curved	Graefe	FST
Curved micro needle holder	Castroviejo	FST
Hemostatic collagen compress	Pangen	Urgo
Absorbent underpads		VWR
Name	References	Company	Comments
Specific equipments
Hematology system	Hemavet 950FS	Hemavet
Glucose strips and glucometer	One touch Verio	Life scan
Stereo microscope	MZ6	Leica