Técnicas de gastrectomia vertical e modificado Roux-en-Y bypass gástrico em ratos

Resumo

Bariatric surgery is the most efficient way to reduce body weight and the deadly metabolic complications (diabetes, obesity, and dyslipidemia) frequently associated with morbid obesity. Mouse models of bariatric surgery represent a unique asset for deciphering molecular mechanisms behind the beneficial effects of these surgeries on diabetes, hypertension, and dyslipidemia.

Resumo

A obesidade é um problema de saúde pública, com uma prevalência de 4-28% para os homens e 6,2-36,5% para as mulheres na Europa (2003-2008). A obesidade mórbida é frequentemente associada a complicações metabólicas, como diabetes tipo 2, hipertensão e dislipidemia, reduzindo a expectativa de vida e qualidade. Na ausência de quaisquer tratamentos não invasivos eficazes, a cirurgia bariátrica é uma opção terapêutica valiosa para pacientes com obesidade mórbida (índice de massa corporal (IMC)> 40 kg / m ^2), levando a longo prazo, sustentado perda de peso e melhorias em complicações metabólicas . No entanto, os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à sustentação dos efeitos benéficos da cirurgia bariátrica não são ainda totalmente compreendidas. Devido às inúmeras linhagens geneticamente modificados disponíveis, o modelo de rato é o modelo animal mais conveniente para explorar os mecanismos moleculares por trás dos efeitos benéficos pleiotrópicos das cirurgias bariátricas. Aqui, detalhou o healthc otimizadasão métodos e protocolos cirúrgicos em ratos para as duas cirurgias bariátricas mais utilizados: a gastrectomia vertical e do bypass gástrico Roux-en-Y modificada. Decifrar os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos de cirurgias bariátricas oferece a promessa de identificação de novos alvos terapêuticos.

Introdução

A pandemia mundial de obesidade e diabetes é devastador em termos de gravidade. Mais de dois mil milhões de adultos em todo o mundo (30% da população) estão com sobrepeso (IMC> 25 kg / m ²⁾ ou obesidade (IMC> 30 kg / m ^{2) 1.} Isto pode vir junto com complicações metabólicas, tais como diabetes tipo 2, hipertensão, dislipidemia e, levando a um aumento da morbidade e mortalidade. A obesidade aumenta o mortalidade geral e a prevalência de câncer ^2. Devido à falta de quaisquer tratamentos eficazes não invasivos, cirurgia bariátrica representa a única opção que pode conduzir a longo prazo, a perda de peso sustentada ^{3, 4.} Um número de diferentes métodos cirúrgicos foram desenvolvidos, mas a gastrectomia vertical (SG) e de bypass gástrico Roux-en-Y (RYGB) são os dois procedimentos mais comumente utilizados na prática clínica. Durante o procedimento de SG, 80% do volume inicial do estômago estáremovido; Assim, esta técnica é uma das cirurgias restritivas que melhora a saciedade. O BGYR é uma das técnicas de acordos e de má absorção. Durante BGYR, uma pequena bolsa gástrica (1-2% do volume gástrico total) é criado e o intestino é rearranjado em uma forma de Y, o que retarda a digestão e a absorção de nutrientes. Estas duas técnicas levar a reduções significativas de peso corporal e melhorias gerais na comorbidades frequentemente associados (por exemplo, hipertensão, diabetes tipo 2 e dislipidemia) ^3, com uma maior eficiência visto em RYGB. No entanto, os mecanismos moleculares por trás dos efeitos benéficos pleiotrópicos das cirurgias bariátricas muitas vezes não são completamente elucidados. Devido às inúmeras linhagens geneticamente modificados disponíveis, um modelo do rato é o modelo animal mais conveniente para explorar esses mecanismos moleculares.

No entanto, os procedimentos bariátricos são difíceis de se adaptar diretamente para modelos animais de pequeno porte e requirE High destreza cirúrgica. Enquanto SG pode ser facilmente realizado em roedores com uma muito boa taxa de sobrevivência, RYGB é letal em camundongos devido a obstruções intestinais graves ^5. Diferentes técnicas RYGB modificados têm sido propostos para combater este problema, nomeadamente a oesojejunostomy ^5. Aqui, apresentamos uma outra alternativa: o gastrojejunostomy sem excisão estômago. Este BGYR modificado reproduz a maioria dos efeitos benéficos observados em seres humanos (isto é, uma redução de peso de corpo significativa e uma melhoria na glucose e lípidos homeostase).

Este manuscrito visa resumir e discutir os detalhes técnicos e experimentais de SG e RYGB em camundongos e facilitar estes procedimentos com a ajuda de vídeos. Um destaque específico será feita em relação a otimização dos protocolos de cuidados de saúde pré-operatórias e pós-operatórias que permitem a redução das deficiências de vitaminas e ferro.

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Protocolo

Animal e habitação: Obter ratos 8 semanas de idade C57BL / 6 do sexo masculino. Às 10 semanas de idade, dê o acesso gratuito camundongos C57BL / 6 para a água e uma dieta rica em gordura (DIO dieta: 35% kcal de gordura, 25,8% caseína, 1,30% AIN mineral, 1,30% de vitaminas, fosfato bicálcico 1,70%, 0,7 carbonato% de cálcio, 2,10% citrato de potássio, 0,026% de bitartrato de colina, 8,9% de sacarose, 0,384% de cistina, 6,5% de celulose, 31,7% de banha, óleo de soja 3,3%, e 16,29% de maltodextrina) para oito (SG) ou 14 (BGYR) semanas antes das cirurgias bariátricas. Para promover o ganho de peso, dar a ratinhos dedicada à cirurgia BGYR (Sham & BGYR) de água contendo 20% de frutose (w / v) em adição à dieta rica em gordura.

Declaração de Ética: Todos os passos protocolo descrito a seguir seguir as orientações do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Pays de la Loire sob o número de aprovação 01.953,01.

1. Geral pré-operatória Preparação

1. Jejuar ratos durante 6 h antes da cirurgia. gel diet alimentos foi dada 3 dias antes da cirurgia e exclusivamente um dia antes da cirurgia. Induzir a anestesia em uma câmara com 5% de isoflurano (0,4 L / min) e O ₂ (dioxigénio; 0,4 L / min). Realizar um teste toe-pitada para confirmar que a anestesia é eficaz. Administrar analgésicos (0,1 mg / kg de buprenorfina), antibióticos (10 mg / kg marbofloxacine), e pró-cinética (de 1 mg / kg de cloridrato de metoclopramida) por meio de injecções subcutâneas.
2. Alocar uma área de trabalho específica para procedimentos cirúrgicos (distantes dos fãs de tráfego laboratório e ventilação). Limpar a área cirúrgica com desinfetantes de superfície dura dedicados. Coloque uma almofada de aquecimento na área de espaço de trabalho para manter homeothermy mouse durante a cirurgia. Aplique uma underpad limpo, absorvente sobre a almofada de aquecimento.
3. Raspar o abdômen do esterno às pelve usando um barbeador elétrico. Enrole o abdômen do mouse no esterilizados de plástico envoltório (Figuras 1A e 2A) e coloque o mouse na posição supina sobre o aquecimento pde Anúncios.
4. Aplicar vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. Colocar o rato dentro do cone de nariz e manter a anestesia com isoflurano a 2% (0,4 L / min) e O ₂ (0,4 L / min).
5. Antes de iniciar a cirurgia, colocar um avental estéril exame, uma tampa esfrega descartável, uma máscara e luvas estéreis. Abrir um pacote de autoclavada contendo uma esterilizados set instrumento cirúrgico, que é exigido para todas as etapas da cirurgia. Cortar uma janela no filme plástico esterilizado e desinfectar a pele com 2 soluções Iodopovidona sucessivas.

2. gastrectomia vertical: Procedimento Cirúrgico

1. Laparotomia mediana (Figura 1B)
   1. Sob um microscópio binocular e com um bisturi, executar uma incisão na linha média a partir do esterno até ao meio do abdómen para abrir a cavidade abdominal (não danificar os músculos abdominais). Proteger a pele com uma compressa esterilizada embebida em solução salina C 37 °.
2. Exposição do estômago (Figura 1C)
   1. Gentilmente mobilizar o estômago usando cotonetes de algodão umedecido. Livre o estômago de suas laterais estreitas anexos de tecido conjuntivo usando cotonetes humedecidos ou micro tesoura.
   2. Gentilmente, externalizar o estômago totalmente e coloque um colágeno hemostática comprimir atrás do estômago. Sutura do piloro e vasos esófago ao longo da grande curvatura do estômago com 8,0 suturas não absorvíveis para evitar futuro hemorragia (Figura 1D e E). Nota: o uso Hemostat pode induzir dano tecidual, certifique-se apenas para usá-lo em tecido que pretendem ser ressecado.
3. Ressecção da região cardíaca do estômago (fundo)
   1. Executar uma gastrotomia na linha anatômica presente entre a região pilórica (corpus) e na região cardíaca do estômago (fundo) (Figura 1F).
   2. Retire os alimentos residual com 2 zaragatoas de algodão humedecido em relação uns aoslado do estômago. Utilizando micro-tesoura, cortar o estômago ao longo da fronteira entre o fundo do útero e o corpo do estômago (Figura 1G).
   3. Pressione uma colágeno hemostática comprimir por 2 min em caso de hemorragia grave. Fechar a abertura do estômago com 8,0 suturas não absorvíveis a partir da junção gastro-esofágico para o fim da incisão (Figura 1H).
4. Ressecção da região pilórica do estômago (corpus)
   1. Conclua a ressecção do estômago ao longo da curvatura maior, de modo a remover aproximadamente 80% do estômago (Figura 1I). Padronizar a largura do SG a 3 mm. Pressione uma colágeno hemostática comprimir por 2 min em caso de hemorragia grave.
   2. Fechar a abertura da região pilórica do estômago com 8,0 sutura não absorvível (Figura 1J). Agite-2 cotonetes de algodão humedecido no sentido de cada lado do estômago para assegurar que a sutura é à prova de fugas.
   3. Completo com 8,0 suturas não absorvíveis em caso de vazamento. Retirar as compressas de colagénio hemostáticos e devolver o estômago para a cavidade abdominal. Deixar um colágeno hemostática comprimir contra a sutura.
5. fechamento abdominal
   1. Feche a camada muscular da parede abdominal com 5,0 suturas não-absorvíveis (Figura 1K). Reduzir a anestesia através da redução da concentração de isoflurano a 1%. Feche a pele usando 5,0 suturas não-absorvíveis (Figura 1D).

3. Roux-en-Y bypass gástrico: Procedimento Cirúrgico

1. laparotomia mediana
   1. Sob um microscópio binocular e com um bisturi, executar uma incisão na linha média a partir do esterno até ao meio do abdómen para abrir a cavidade abdominal (não danificar os músculos abdominais). Proteger a pele com uma compressa estéril embebida com uma solução salina a 37 ° C (Figura 2B).
2. Membro biliopancreática e tubo alimentar
   1. Externalizar o intestino (Figura 2C). Medida 8 cm a partir do piloro e executar duas ligaduras do intestino com 5,0 suturas não absorvíveis (Figura 2D).
   2. Cortar o intestino entre as duas ligaduras (Figura 2E). Coloque o membro proximal das duas extremidades no quadrante superior esquerdo do abdome. Nota: Isto será utilizado como o tubo alimentar (Figura 2F).
   3. Coloque a parte distal do membro de as duas extremidades de frente para o tubo alimentar 6 cm abaixo do membro proximal (Figura 2F).
      NOTA: Este valor será usado como o membro biliar.
3. Jejuno-jejunostomia
   1. Cortar tanto o membro proximal e o loop intestino utilizando micro tesouras e fazer duas incisões antimesentéricas do mesmo comprimento (Figura 2G e 2H).
   2. Executar lado a lado anastomose com dois 8,0suturas não absorvíveis. Realização da anastomose lado dorsal primeiro (Figura 2I), seguido pela anastomose lado ventral (Figura 2J).
   3. Delicadamente rolar 2 compressas de algodão umedecidos para com cada lado da anastomose para garantir que a sutura é à prova de fugas. Completo com 8,0 suturas não absorvíveis em caso de vazamento.
4. Gastro-jejunostomia
   1. Gentilmente mobilizar o estômago usando cotonetes humedecidos. Livre o estômago de suas laterais estreitas anexos de tecido conjuntivo usando cotonetes humedecidos ou micro tesoura.
   2. Gentilmente, externalizar o estômago totalmente, colocando um colágeno hemostática re-absorvível comprimir atrás do estômago. Realizar uma ligadura do piloro usando uma sutura 5.0 não absorvível passado através do omento usando micro pinça curva (Figura 2K e 2L).
   3. Cortar o lado ventral do estômago, a 1,5 cm do piloro, e parte distal do membroutilizando micro-tesoura, criando duas incisões do mesmo comprimento (Figura 2M).
   4. Execute anastomose lado-a-lado com dois 8,0 suturas não absorvíveis. Comece com a anastomose lado dorsal (Figura 2 N) e, em seguida, executar a anastomose lado ventral (Figura 2O). Delicadamente rolar 2 compressas de algodão embebido em direção cada lado da anastomose para garantir que a sutura é à prova de fugas. Completo com 8,0 suturas não absorvíveis em caso de vazamento.
5. fechamento abdominal
   1. Feche a camada muscular da parede abdominal utilizando 5,0 suturas não-absorvíveis (Figura 2P). Reduzir a anestesia através da redução da concentração de isoflurano a 1%. Fechar a pele usando 5,0 suturas não absorvíveis (Figura 2q) .Administer 25 ml / kg de solução salina quente através de injecção subcutânea.

4. Geral Cuidados no pós-operatório

1. pare de isofluranoe continuar com um fluxo de _O2 de 0,8 L / min até que o mouse é totalmente acordado. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele recupera o controle motor, indicado pela partida animal para mover ao redor da gaiola e ser capaz de ficar de pé e caminhar sem cair.
2. Colocar o rato (apenas um rato por gaiola) em uma incubadora sob condições de temperatura de 30 ° C durante 5 dias.
3. Manter o ferro (0,5 mg / kg / dia; injecção subcutânea) e vitamina (800 mg / 180 mL em água) a suplementação em ratinhos BGYR até ao final do protocolo.
4. Retornar o livre acesso à dieta gel alimentar (dieta com gel alto teor de gordura: 10% de banha, açúcar líquido de 10%, 57% de água) durante 5 dias após a cirurgia. Reintroduzir uma dieta sólida 3 dias após a cirurgia.
5. Subcutaneamente injectar buprenorfina (0,1 mg / kg, duas vezes por dia, desde o dia 0 até ao dia 3 após a cirurgia), meloxicam (1 mg / kg, a partir de dia 0 até ao dia 3 após a cirurgia), metoclopramida (1 mg / kg, do dia 0 ao 5 dias após a cirurgia), e marbofloxacine (10 mg / kg, a partir de dia 0 até ao dia 3 afte cirurgia R).

Avaliação pós-operatória 5. Metabolic Parâmetros

1. Medição da ingestão de alimentos
   1. Permitir que os ratos a recuperar durante uma semana após a cirurgia. Casa a ratinhos um por gaiola. Medir a quantidade de dieta sólida colocado na gaiola. Peso os restantes 24 alimentos h mais tarde. Repita este passo enquanto for necessário.
2. Teste de tolerância oral à glicose
   1. Jejuar ratos durante 6 h antes do bolus oral. Colher uma gota de sangue da ponta da cauda e aplicá-lo sobre uma tira de glucose inserido num glucometer para determinar o tempo de valor de glicose no sangue 0.
   2. Administrar um bolus por via oral de uma solução de D-glicose a 20% (2 g / kg). Medir os níveis de glicose no sangue aos 15, 30, 60 e 120 min após gavagem.
3. Análise de nível de hemoglobina
   1. Usando um sistema de hematologia, medir 20 mL de sangue fresco para provar o nível de hemoglobina.

"> 6. Eutanásia

1. Anestesiar os ratos por via intraperitoneal uma solução de injecção de xilazina / cetamina (10/80 mg / kg). Realizar uma luxação cervical. Verifique a eutanásia completa, garantindo que o coração não está batendo eo reflexo de piscar globo ocular está perdido.

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Resultados

Condições Gerais

O tempo cirúrgico médio para o procedimento de SG foi de 49,3 ± 1,5 min. Removemos 62,8 ± 5,0 mg do estômago, o que representa cerca de 80% por cento do estômago. Sem ratos morreram durante a cirurgia ou durante os sete dias seguintes. Um rato (7,1%) morreram no ^dia pós-operatório de 11 devido a uma obstrução gástrica causada por um bezoar.

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Discussão

Para superar a crescente epidemia de obesidade, os primeiros procedimentos de cirurgia bariátrica surgiu na década de 1960 nos Estados Unidos. Desde então, o número de procedimentos realizados anualmente no mundo ainda aumentar, e hoje, estas técnicas representam a melhor opção terapêutica para o tratamento da obesidade mórbida ^6. Entre os procedimentos desenvolvidos, SG e RYGB são os dois métodos mais populares usados na prática clínica ^4. modelos animais, no...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
High Fat diet	DIO diet	Safe
Isoflurane	Forane	Baxter
Buprenorphin	Buprecare	Animalcare
Marbofloxacine	Marbocyl	Vetoquinol
Ammonium iron citrate, vitamins PP-B12	Fercobsang	Vetoquinol
Vitamins A-D3-E-K-B	Vita Rongeur	Virbac
NaCl 0.9%	NaCl 0,9%
Povidone solution	Betadine Scrub	Betadine
Povidone solution	Betadine Solution	Betadine
Carboptol 980 NF	Ocrygel	TVM
Name	References	Company	Comments
Sutures
Prolene®	8.0, 6,5 mm	Ethicon
Prolene®	5.0, 13 mm	Ethicon
Name	References	Company	Comments
Surgical equipments
Scissors		FST
Needle holder	Olsen-Hegar	FST
Micro scissors	Vannas	FST
Micro forceps	Graefe	FST
Micro forceps curved	Graefe	FST
Curved micro needle holder	Castroviejo	FST
Hemostatic collagen compress	Pangen	Urgo
Absorbent underpads		VWR
Name	References	Company	Comments
Specific equipments
Hematology system	Hemavet 950FS	Hemavet
Glucose strips and glucometer	One touch Verio	Life scan
Stereo microscope	MZ6	Leica