Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

Resumen

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Resumen

Mesenquimales del estroma células madre / (MSC) son una gran promesa en la bioingeniería y la medicina regenerativa. MSCs se pueden aislar a partir de múltiples tejidos adultos a través de su fuerte adherencia a plástico de cultivo tisular y luego se expandieron adicionalmente in vitro, más comúnmente usando suero bovino fetal (FBS). Desde FBS puede causar MSCs para ser inmunogénico, su presencia en los cultivos de MSC limita las aplicaciones clínicas y experimentales de las células. (XF) medios libres de xeno Por lo tanto, los estudios que emplean definidos químicamente para cultivos de MSC son extremadamente valiosos. Muchos de los efectos beneficiosos de las MSC se han atribuido a su capacidad para regular la inflamación y la inmunidad, principalmente a través de la secreción de factores inmunomoduladores tales como necrosis tumoral gen del factor estimulada 6 (TSG6) y la prostaglandina E2 (PGE2). Sin embargo, las MSC requieren activación para producir estos factores y dado que el efecto de las MSC es a menudo transitoria, un gran interés ha surgido para descubrir maneras de pre-activación de las células prior a su uso, eliminando así el tiempo de retraso para la activación in vivo. Aquí presentamos los protocolos de activar de manera eficiente o MSC principales en tres dimensiones (3D) de las culturas XF en condiciones definidas químicamente y administrar estos MSC pre-activadas in vivo. Específicamente, primero se describen los métodos para generar MSC esférica micro-tejidos o "esferoides 'en gotas colgantes usando medio XF y demostrar cómo las esferas y el medio acondicionado (CM) se pueden cosechar para diversas aplicaciones. En segundo lugar, describimos pantallas de la expresión génica y en ensayos funcionales in vitro para evaluar rápidamente el nivel de activación MSC en esferoides, haciendo hincapié en el potencial anti-inflamatorio y anti-cáncer de las células. En tercer lugar, se describe un nuevo método para inyectar esferoides MSC intactas en la cavidad peritoneal del ratón para ensayos de eficacia in vivo. En general, los protocolos en este documento superar los principales retos de la obtención de las MSC pre-activadas bajo con XF químicamente definidocondiciones y proporcionan un sistema flexible para administrar esferoides MSC para las terapias.

Introducción

Mesenquimales madre / células del estroma (MSC) han mostrado un gran potencial para los diversos enfoques de medicina regenerativa. MSCs fueron aislados inicialmente como un componente del estroma de médula ósea, pero desde entonces se han obtenido a partir de numerosos otros tejidos adultos, incluyendo el tejido adiposo ^{1, 2, 3.} Curiosamente, el método de aislamiento principal abarca la notable propiedad de MSCs se adhiera firmemente en plástico de cultivo de tejidos en presencia de suero bovino fetal (FBS). Si bien esta técnica de aislamiento tradicional permite la expansión fácil y rápida de las MSC en dos dimensiones-cultivo (2D), que también es muy artificial y no tiene en cuenta importancia del medio ambiente nativo en tres dimensiones (3D) que conduce a la pérdida potencial de importante características celular ^{4, 5 , 6.} Por lo tanto, el estudio de las MSC en cultivos 3D, queson más fisiológica que los cultivos tradicionales en 2D, ha surgido en búsqueda de características MSC "perdidos / parcial". Por otra parte, un gran interés ha aumentado para identificar condiciones (XF) libre de xeno químicamente definido para el cultivo de MSC y activación, y de este modo hacer que las células sean más susceptibles para aplicaciones clínicas.

Muchos estudios se han publicados que demuestran la cultura 3D de MSCs tanto en biomateriales y como agregados esféricos o esferoides. MSC en biomateriales fueron diseñados inicialmente para los enfoques de ingeniería de tejidos para reemplazar tejidos dañados con andamios sembrado de células, mientras que no se observaron cultivos de esferoides de MSC como una manera de entender el comportamiento de MSC in vivo después de la administración de las células para terapias en ensayos preclínicos o clínicos ^{4, 5, 7.} Curiosamente, MSC formar esferoides espontáneamente cuando no está permitido adherencia al plástico de cultivo de tejidos^{8, 9, 10.} Tradicionalmente, la agregación de células fue facilitado por métodos matraz de agitación o técnicas de superposición líquidos, métodos utilizados inicialmente en la biología del cáncer en los esfuerzos para tratar de imitar el microambiente tumoral. Más recientemente, métodos adicionales han surgido que demuestran la agregación de células en placas de cultivo pre-recubierto con productos químicos específicos para evitar que la célula-a-plástico de adhesión ^{4, 5, 6.} Uno de los métodos más simples y más económicos para generar esferoides MSC es a la cultura en gotas colgantes, una técnica que a menudo se utiliza para producir cuerpos embrioides a partir de células madre embrionarias. Con colgando técnica de cultivo gota, adherencia de las células al plástico de cultivo de tejidos se evita mediante la suspensión de las células en una gota de medio en la parte inferior de una tapa de placa de cultivo de tejido y permitiendo que la gravedad para facilitar AGGREG célulaación en el ápice de la gota. El tamaño esferoide puede ser manipulado fácilmente por el cambio de la concentración de células o el volumen de la gota, haciendo culturas gota colgante especialmente fácil de controlar.

Los primeros estudios sobre la cultura 3D de MSCs demostraron diferencias radicales en las características de las células en 3D en comparación con sus contrapartes 2D ^{6, 8, 9.} Al mismo tiempo, los informes demostraron que los efectos beneficiosos de las MSC in vivo se basó en su capacidad de activarse por señales micro-ambientales y, en respuesta, para producir anti-inflamatorio e inmunomodulador factores de ^11. Curiosamente, muchos de estos factores, tales como la prostaglandina E2 (PGE2), tumor necrosis gen del factor estimulada 6 (TSG6), y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se produjeron en cantidades mucho mayores por esferoides MSC que MSCs 2D tradicionales allanando el camino para el idea deutilizando cultivos 3D para activar las células ^{8, 12, 13.} Por otra parte, la activación de genes en cultivos 3D apareció recapitular mecanismos, al menos en parte, de la activación de células después de la inyección en ratones ^12. Mediante la activación de las MSC antes de su uso en los experimentos, los efectos de las células podrían ser prolongados y más prominente como el efecto MSC tradicional in vivo a menudo se retrasa y transitorios, y puede ser descrito como "golpear y correr". Durante los últimos años, los estudios funcionales importantes utilizando esferoides MSC han demostrado que pueden suprimir las respuestas inflamatorias y modular la inmunidad in vivo al influir en las células efectoras, tales como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, y células T que hacen esferoides una forma atractiva de MSCs imprimados ^{2 , 3.} Además, la producción de moléculas anti-cáncer, tales como interleukin-24 (IL-24) y la necrosis tumoral relacionado con el factor inductor de apoptosis ligando (TRAIL), se incrementan en cultivos 3D de las MSC en relación con monocapa MSCs, un fenómeno que podría ser explotado para terapias contra el cáncer dirigidas ^{8, 10, 14.}

A medida que la cultura tradicional de MSC requiere no sólo el uso de plástico de cultivo de tejidos, sino también de FBS, otro obstáculo para hacer esferoides MSC más favorable para el uso clínico se tuvieron que superar. Para hacer frente a este obstáculo, que recientemente mostró la formación de esferoides de MSC en condiciones específicas XF definidos químicamente y estableció que los esferoides MSC resultantes se activan para producir las mismas moléculas contra el cáncer anti-inflamatorio y como los esferoides generados en condiciones con FBS al ^14. En este caso, estos resultados se presentan en varios protocolos detallados que demuestran la generación de MSC pre-activadas en cultivos 3D usando XFmedios de comunicación. Además, los protocolos se presentan que describen formas eficaces para evaluar los niveles de activación de las MSCs en cuanto a sus efectos antiinflamatorios, inmunomoduladores y anti-cáncer de efectos, junto con un método práctico para entregar los esferoides intactas en ratones.

Protocolo

1. Aislamiento de MSC y Expansión

1. Obtener MSC principios de paso desde el Centro para la preparación y distribución de células madre adultas ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ viales como congelados. Alternativamente, aislar las MSC de aspirados de médula ósea después de un protocolo de rutina ¹⁴ y conservar los viales como congelados.
2. Preparar medio de cultivo completo (CCM), que es mínimo alfa medio esencial (aMEM) suplementado con prima de 15 a 20% seleccionar FBS, 2 mM L-glutamina y 1x de penicilina-estreptomicina. Esterilizar el medio por filtración.
3. Colocar 30 ml de CCM en una placa de cultivo celular 150 mm y se incuba la placa durante 30 min a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO _2.
4. Incubar el vial congelado que contiene aproximadamente 10 ⁶ MSCs para 2 min en un baño de agua C 37 °.
5. Transferir el contenido del vial a la placa de cultivo utilizando una pipeta serológica de 5 ml y lavar el vial varias veces con 1-2 ml CCM de la antena para capturar las células residuales. Coloque la noche a la mañana plato en una incubadora apropiada.
6. lavar cuidadosamente la cultura dos veces con solución salina tamponada con fosfato temperatura ambiente (PBS) y separar las MSC con 3 ml de solución de pre-calentado 0,25% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). El desapego por lo general tarda aproximadamente 3-4 minutos en la incubadora.
7. Neutralizar la tripsina en el plato con 6 ml CCM pre-calentado a 37 ° C y la transferencia de la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml. Combinar con lavados de PBS para maximizar el rendimiento celular.
8. Centrifugar las células (450 xg) durante 10 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
9. Vuelva a suspender las células en un pequeño volumen de CCM y contar las células viables utilizando un hemocitómetro y azul de tripano.
10. Sembrar un número apropiado de placas de 150 mm a 100 células / cm ² en 30 ml de CCM cálida e incubar los cultivos hasta que aproximadamente el 70-80% de confluencia, normalmente de 7 días con medio cambia cada 2-3 días y 24-48 h antes de la cosecha.
11. Recoger las células como anteriormente con tripsina / EDTA y se combinan todas las células en un solo tubo cónico con el medio apropiado. Centrifugar de nuevo y volver a suspender las células en un pequeño volumen del mismo medio para el recuento de células. Utilice CCM estándar (que contiene FBS) o diversas formulaciones de medios XF disponibles en el mercado, aquí se hace referencia como XF medio-1 (XFM-1) y XF medio-2 (XFM-2), con y sin albúmina de suero humano (HSA, 13 mg / ml) la suplementación.

2. Preparación de esferoides Activado MSC en 3-D gota colgante cultivos bajo condiciones XF

1. Para generar esferoides de aproximadamente 25.000 células, diluir las MSCs cosechadas en CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, o XFM-2 + HSA (13 mg / ml) a 714 células / l.
2. Pipetear 35 l / gotas de las células sobrela parte inferior de una cultura invertida tapa de la placa 150 mm. Varias gotas pueden ser fácilmente pipeta usando una pipeta multicanal.
   NOTA: Si se desean esferoides más grandes o más pequeños, cambiar la concentración de células o el volumen de la gota (25-45 l) de manera apropiada.
3. Transferir 20 ml de PBS temperatura ambiente en la base del plato y en un movimiento continuo y constante voltear la tapa, que contiene las gotas, de modo que los ápices de la gota se enfrentan hacia abajo. Coloque la tapa cuidadosamente sobre la base de la placa de cultivo.
4. Se pasa la placa en la incubadora durante 3 días sin perturbarla para permitir el montaje de la esfera apropiada.
5. Después de 72 horas, comenzará la cosecha esferoide retirando la tapa con cuidado y se invierte para que las gotas, una vez más, la cara hacia arriba.
6. Ángulo de la tapa de aproximadamente 10-20 ° y empujar las gotas, que contienen los esferoides, al borde de la placa de utilizar una grúa móvil.
7. La transferencia de las esferas y medio en un tubo cónico de 15 ml con un tubo de 1.000 lTTE. Uso temperatura ambiente PBS y la pipeta con la misma punta para lavar la placa y asegurar la recuperación máxima de esferoides.
8. Para los ensayos de PCR en tiempo real (protocolo 3), centrifugar la suspensión esfera a 450 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Lavar los esferoides con PBS y repetir los dos pasos de centrifugación y aspiración. Para la entrega en animales (protocolo 8), permiten que las esferas se asienten en el fondo del tubo (~ 3-4 min), sin centrifugación.

3.-PCR en tiempo real de los marcadores inflamatorios y anti-anti-cáncer

1. Utilice el kit de extracción de ARN con columnas homogeneizador y DNasa libre de RNasa Set para aislar ADN libre de ARN total a partir de las MSC en monocapa (Protocolo 1) y esferoides MSC (Protocolo 2) que se lavaron con PBS y se centrifugó.
2. Lyse al menos 100.000 MSCs monocapa y 20 esferoides de cada condición en distintos tubos de 15 ml cónicos con tampón RLT que contiene β-mercaptoetanol (1: 100).
3. Transfer los lisados ​​bien mezclados en tubos de 1,5 ml sin RNasa y colocar en un congelador (-80 ° C) durante al menos 3 horas para ayudar en la lisis esferoide.
4. Descongelar los lisados ​​de células en hielo y agitar brevemente, y siga las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN total de mamíferos disponibles comercialmente.
5. Cuantificar y evaluar la calidad del ARN aislado utilizando un espectrofotómetro.
6. Utilice el kit de cDNA de transcripción inversa o equivalente de acuerdo alta capacidad con las instrucciones del fabricante para generar ADNc para PCR en tiempo real.
7. Colocar las muestras de ADNc, cebadores de PCR diseñados comercialmente en tiempo real / sondas (ensayos de expresión génica) y PCR Master Mix en hielo. Utilizar imprimaciones / sondas para GAPDH (control), PTGS2 (COX-2, anti-inflamatorio), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflamatorio), TRAIL (contra el cáncer), e IL-24 (contra el cáncer).
8. Preparar en tiempo real las reacciones de PCR según las instrucciones del fabricante para la expresión génica Ensayos y rápida UniveRsaI Master Mix.
9. Siga las directrices para el instrumento en tiempo real PCR para generar los documentos de experimentación y la realización de la carrera.
10. Analizar los datos utilizando el método ΔΔC _T mediante el cálculo de los cambios relativos (cantidad relativa, RQ) en la expresión génica utilizando GAPDH como los MSCs de control y de monocapa endógenos como una línea de base ^{8, 14.}

4. Recolección de CM para ensayos de inmunomoduladora y anti-cáncer de Potencial

1. Cosechar los esferoides y CM como se describió anteriormente en un tubo cónico de 15 ml, de utilizar una grúa móvil y una pipeta, sin embargo, no se lava las tapas de los recipientes con PBS ya que esto va a diluir el CM.
2. Centrifugar a 450 xg durante 5 min a temperatura ambiente, recoger cuidadosamente el sobrenadante libre de células con una pipeta, y transferir el sobrenadante a tubos de 1,5 ml.
3. Se centrifuga a 10.000 xg durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, recoger cuidadosamente el clCM arified con una pipeta, y transferir el CM en nuevos tubos de 1,5 ml para el almacenamiento en un congelador (-80 ° C). Preparar alícuotas de la CM antes de la congelación cuando se utiliza por múltiples ensayos.
   NOTA: Antes de realizar ensayos de aguas abajo, la concentración de PGE2, un buen indicador del potencial antiinflamatorio de CM, se puede determinar utilizando un kit de ELISA comercial según las instrucciones del fabricante. Concentración TSG6 se puede determinar usando un protocolo publicado ^14.

5. macrófagos Ensayo para evaluar el potencial antiinflamatorio del MSC-CM

1. Preparar medio de macrófagos, que consiste en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene L-alanil-L-glutamina y complementado con 10% prima seleccionar FBS y 1x de penicilina-estreptomicina. Filtros de esterilizar el medio.
2. Obtener un vial congelado de aproximadamente 10 ⁶ J774 macrófagos de ratón y se incuba el vial durante 2 min en un baño de agua C 37 °.
3. Transferir el contenido del vial en un tubo cónico de 15 ml, añadir 9 ml de medio de macrófagos, y centrifugar durante 5 minutos a 200-300 xg ya temperatura ambiente.
4. Aspirar el sobrenadante, suspender los macrófagos en 1 ml de medio de macrófagos, y transferir los macrófagos en un 150 mm placa de Petri que contiene 30 ml de medio de macrófagos.
5. Cambiar el medio cada 2 días y se incuban las células en la incubadora hasta que aproximadamente el 70-80% de confluencia.
   NOTA: Los macrófagos no se adhieren firmemente a la placa de Petri, por lo tanto se debe tener cuidado de no perder las células con cambio de medio.
6. Cosecha de los macrófagos mediante la pulverización del medio de macrófagos en las células con una pipeta. Transferencia de las células en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar durante 5 min a 200 a 300 xg y la temperatura ambiente.
7. Aspirar el sobrenadante y suspender las células en un pequeño volumen de medio de macrófagos para el recuento de células con un hemocitómetro. Ajustar la concentración de 200.000 células / ml con macrófagos míDium.
8. Para iniciar la puesta a punto para el ensayo de macrófagos, añadir 480 l de medio de macrófagos en pocillos de una placa de 12 pocillos.
9. Añadir 20 l de medio de macrófagos en los pocillos de control no estimulados y 20 l de no acondicionado o medio MSC-acondicionado, preparado anteriormente, en los pozos experimentales. Mezclar el medio en los pocillos golpeando suavemente la placa.
10. Transferir 500 l de la suspensión celular de macrófagos a los pocillos de control no estimulados macrófagos.
11. Estimular los macrófagos restantes con adición de 1: 500 a 1: 1000 de 0,1 mg / ml de lipopolisacárido (LPS) y se incuba 5-10 min a temperatura ambiente.
12. Transferir 500 l de los macrófagos estimulados en los pocillos con medio no acondicionado o MSC acondicionado. Mezclar los pozos, colocándola de forma constante la placa varias veces.
13. Colocar la placa en una incubadora durante 16-18 horas.
14. Se recoge el medio acondicionado de macrófagos y centrifugar a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
15. Transferirel sobrenadante a tubos nuevos y ensayo de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y (IL-10) contenido interleucina-10 por kits comerciales de ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante.

6. Splenocyte Ensayo para evaluar el potencial inmunomodulador de esferoide-CM

1. Preparar medio de esplenocitos completa, que consiste en Rosewell Parque Memorial Institute (RPMI) -1640 medio suplementado con inactivado por calor 10% de FBS, 1x penicilina-estreptomicina, y 2-mercaptoetanol. Filtros de esterilizar el medio.
2. Bazos cosecha de ratones machos sacrificados-BALB / C a través de una incisión preparada en el lado izquierdo del abdomen sobre el bazo, aproximadamente a medio camino entre la patas delanteras y traseras ^14. Transferir el bazo a un filtro de células de 70 m para aislar los esplenocitos ^14.
3. Aislar los esplenocitos / linfocitos empujando los bazos a través del filtro de 70 micras en una placa de Petri estéril using del caucho blando / extremo de plástico de un émbolo de una jeringa de ¹⁴ ml 2-3. Utilice un movimiento circular de molienda para disociar los bazos.
4. Lavar el filtro de células varias veces con PBS frío y transferir las células de la placa de Petri en un tubo cónico de 50 ml. Llenar el tubo con PBS frío y se centrifuga (500 x g) a 4 ° C durante 10 min.
5. Aspirar el sobrenadante y borrar las células de los eritrocitos por incubación con 5-10 ml de solución de lisis de glóbulos rojos (por bazo) durante 5-10 minutos.
6. Detener la lisis mediante la adición de PBS frío al tubo y centrifugar durante 5-10 min a 500 x g y a 4 ° C.
7. Suspender las células aisladas en medio de esplenocitos completa, se filtra a través de un colador de 40 micras, y contar las células usando un hemocitómetro. Añadir medio de esplenocitos a la suspensión celular para lograr una concentración final de células de 10 ⁶ células / ml
   NOTA: Esta técnica produce típicamente aproximadamente 3 x 10 ⁷ esplenocitos por bazo de ratón.
8. Estimular el número apropiado de esplenocitos con 2 mg de anticuerpo / ml anti-CD3e de 5 min.
   NOTA: La cantidad de esplenocitos requiere depende del número de condiciones experimentales según lo determinado por el investigador (véase el paso 6.9). Para cada muestra experimental / pocillo, se requieren 10 ⁶ esplenocitos.
9. Transferencia 10 ⁶ esplenocitos (estimulado o no estimulado) en pocillos de una placa de 12 pocillos y añadir no acondicionado (controles) o MSC-CM en los pocillos a una dilución final de 1: 10-1: 20.
10. Se recoge el CM de esplenocitos después de 24 horas y se centrifuga a 500 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
11. Transferir el sobrenadante a nuevos tubos y ensayo para interferón gamma (IFN-γ) contenido por kit ELISA comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.

7. Ensayo de cáncer de próstata para evaluar el potencial anti-cáncer de esferoide-CM

1. Preparar medio completo de crecimiento RPMI que es medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB, 1x penicilina-estreptomicina.
2. Obtener un vial congelado de células de cáncer de próstata LNCaP y se incuba el vial durante 2 min en un baño de agua a 37 ° C.
3. Transferir el contenido del frasco en una placa de cultivo que contiene 30 ml de medio de cultivo RPMI completo usando una pipeta motorizada y una pipeta serológica de 5 ml. Lavar los vial varias veces con el medio de la placa y se coloca el plato en la incubadora.
4. Justo antes de que las células alcanzan la confluencia, se lava el cultivo dos veces con PBS temperatura ambiente y separar las células LNCaP con 3 ml de solución de tripsina / EDTA pre-calentado 0,25%.
5. Neutralizar la tripsina en el plato con el medio completo de crecimiento RPMI y transferir las células junto con los lavados en un tubo cónico de 50 ml.
6. Centrifugar las células a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante.
7. Volver a suspender las células en pequeño volumen de medio completo de crecimiento RPMI y contar las células cancerosas usando un hemocitómetro.
8. Transferencia de células LNCaP en una placa de 96 pocillos a 5.000 células / pocillo en 120 l de medio de crecimiento RPMI completo que contenía 25% de los no acondicionado o esferoide-CM. Incubar en la incubadora durante 72 hr.
9. Para llevar a cabo un ensayo de crecimiento celular usando un kit de ensayo de proliferación celular, aspirar el medio de los pozos y la transferencia de la placa en un congelador (-80 ° C) durante al menos 3 h.
   1. Descongelar la placa y lisar las células de cada pocillo mediante la adición de 100 l de reactivo de lisis celular que contiene NaCl 180 mM, EDTA 1 mM, y 0,2 mg / ml de RNasa A.
   2. Para obtener una curva estándar, cantidades conocidas de lisar las células LNCaP tal como se describe anteriormente.
   3. Después de 1 hora, añadir 100 l de tampón de lisis celular 1x que contiene 1: 100 dilución de reactivo de ensayo de proliferación celular y medir la fluorescencia en cada pocillo para determinar la cantidad de células.

8. intraperitoneal de entrega de esferoides Intactos

1. Preparar las MSC esferoides como se describió anteriormente (protocolo 2) y resuspender tél Esferas en solución estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) suplementado con 0,2-0,5% de HSA para mantener las condiciones XF. HSA en la solución ayuda a evitar la adhesión esfera al plástico durante la inyección.
2. Transferencia 40-120 esferoides en tubos de 15 ml cónicos y se lavan las células mediante la adición de 6 ml de HBSS / HSA a los tubos. Permitir 3-4 min para las esferas que descienden. Preparar un tubo cónico independiente de esferoides para cada animal. Además, se preparan tubos adicionales de esferoides para los ensayos de determinación de la retención de esferoides (véase 8.18 más adelante) y la producción de factores terapéuticos después de la transferencia (véase 8.19 más adelante) si se desea.
3. Aspirar el sobrenadante, superponer los esferoides con 100-200 l de HBSS estéril suplementado con 0,2-0,5% de HSA, y colocar los tubos en hielo.
4. Brevemente anestesiar los animales con 2% de isoflurano en oxígeno al 100% hasta la desaparición de reflejo de pinch-dedo del pie durante aproximadamente 2 min en la cámara de inducción.
5. Colocar el animal en el interior del armario de BSL-2, Aspe dorsalct abajo (lado ventral hacia arriba), con el flujo continuo de la mezcla de isoflurano / oxígeno 1,5% a través de un cono de nariz.
6. Limpiar la parte inferior del abdomen del ratón con un alcohol antiséptico como el 70%.
7. Retire la tapa de la 20 G intravenosa (iv) de catéter y realizar la inyección intraperitoneal con el conjunto de catéter-estilete. Utilice una mano para sostener la piel del ratón y otra para realizar la inyección. Localizar el punto de la inyección aproximadamente en el centro de una línea artificial que conecta un área conjunta y genital rodilla flexionada con la punta de la aguja apuntando hacia la línea media.
   NOTA: El conjunto de catéter-estilete tiene una resistencia más alta que una aguja normal, por lo tanto, la atención tiene que ser tomado como no inyectar la aguja demasiado profunda en el abdomen, lo que podría provocar lesiones a los órganos internos. La penetración de la piel y luego membrana peritoneal músculos / se puede sentir durante la colocación del catéter.
8. Retire con cuidado el estilete de metal / aguja del conjunto de catéter-estilete. Check el estilete de la sangre, la orina y las heces y lo descarta. Blood en la aguja de punción indica de órgano (s) interna.
9. Mantenga el catéter de plástico en una posición vertical durante las inyecciones para permitir el flujo de fluido.
10. Confirmar la colocación apropiada del catéter de plástico por inyección de aproximadamente 100 l de HBSS estéril / HSA a través del catéter utilizando una pipeta con una punta de 100 a 200 l. Coloque el extremo de la punta de la pipeta en el interior del adaptador de jeringa catéter de formación de un sello hermético. inyectar lentamente el fluido dentro de la cavidad peritoneal.
    NOTA: El líquido en un catéter colocado correctamente fluirá libremente dentro de la cavidad peritoneal con solamente ajustes menores del catéter. La colocación incorrecta del catéter (subcutánea o intra-intestinal, o si la punta de la aguja heridos órganos peritoneales como el riñón) aumentará la resistencia y reducir el flujo. colocación subcutánea dará lugar a una formación de una "burbuja" obvio debajo de la piel.
11. recoger tél MSC esferoides, preparados de 100 a 200 l de HBSS / HSA (etapa 8.3), usando una punta de pipeta 200 l, y la transferencia de todo el volumen de las esferas (40-120 esferas) en la cavidad peritoneal a través del catéter como se describe anteriormente.
12. Lavar el tubo que contiene esferas con 100 l de HBSS / HSA utilizando la misma punta como anteriormente para recoger cualquier esferoides residuales e inyectarlos en la cavidad peritoneal.
13. (Opcional) Inyectar una 100 l adicionales de HBSS / HSA en la cavidad peritoneal para lavar el catéter.
14. Coloque la almohadilla de gasa empapada en antiséptico sobre el catéter y retirar lentamente el catéter de la cavidad peritoneal y lo descarta.
15. masajear suavemente la cavidad peritoneal con los dedos para asegurar una distribución uniforme de los esferoides.
16. Deje que el animal se recupere bajo una estrecha supervisión y controle si tiene sangrado en el lugar de la inyección.
17. Inspeccionar el catéter y el tubo de 15 ml de las esferoides restantes. Es normal observar algunas esferas de lacatéter / tubo.
    NOTA: La técnica descrita para la entrega esferoide MSC se puede adoptar para su uso en animales normales o en una variedad de modelos de lesión. Esta técnica se ha utilizado con éxito para inyectar esferoides en la lesión corneal ratón y modelos de endotoxemia, así como en un modelo de peritonitis inducida por zymosan ^8.
18. Para cuantificar el número de esferoides retenidas (opcional), utilice un número de células kit de cuantificación / reactivo basado en el ADN. Mantenga el catéter usado sobre el tubo 15 ml y dispensar vigorosamente HBSS / HSA a través del catéter para forzar cualquier esferas restantes de nuevo en el tubo de 15 ml.
    1. Centrifugar el tubo de 15 ml a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Transferir el tubo que contiene el sedimento esferoide en un congelador (-80 ° C) durante al menos 3 h.
    2. Descongelar el tubo y la lisis de las esferas mediante la adición de 500 l de reactivo de lisis celular que contiene NaCl 180 mM, EDTA 1 mM, y 0,2 mg / ml de RNasa A.
    3. Para un control, freeze y lisar una cantidad conocida de esferoides (preferiblemente equivalente al número de esferoides preparados para una sola inyección) como se describe anteriormente.
    4. Después de 1 hr, la transferencia de 100 l de lisado celular, por duplicado, en una microplaca de 96 pocillos y añadir a cada pocillo 100 l de tampón de lisis celular 1x que contenía una dilución 1:50 de reactivo de ensayo de proliferación celular del kit. Después de 10 min, se mide la fluorescencia en cada pocillo para determinar el número de esferas que no se inyecta mediante la comparación de la muestra experimental (s) con la muestra de control.
19. Evaluar el nivel de activación de esferoides preparados para inyección (opcional) mediante la medición de la concentración de PGE2 y TSG6 producido por esferas transferidos. Transferencia 40-120 esferas a través del catéter, como se describe anteriormente, en una placa de 12 pocillos o 6 pocillos que contiene 1 o 2 ml aMEM suplementado con 2% de FBS y 1x penicilina / estreptomicina. Colocar las placas en la incubadora durante 6 horas.
    1. Pasar el medio delos pocillos después de 6 h en 1,5 o tubos de 15 ml y centrifugar los tubos a 450 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Transferir el sobrenadante libre de células en tubos de 1,5 ml frescos utilizando una pipeta y se centrifuga a 10.000 xg durante 5 a 10 min a temperatura ambiente.
    3. Transferir el CM clarificado (sobrenadante) en nuevos tubos de 1,5 ml y el ensayo para la concentración de PGE2 (buen indicador del potencial antiinflamatorio de CM) usando un kit de ELISA comercial según las instrucciones del fabricante. Concentración TSG6 se puede determinar usando un protocolo publicado ^14.

Resultados

En el presente trabajo, se emplearon cultivos que cuelgan de gota compactos para generar micro-tejidos esféricos o esferoides '' de MSC activa en condiciones XF. La hoja de ruta de investigación en la Figura 1 muestra que las MSC se les anima a la auto-ensamblan para formar esferoides cuando se suspenden en cuelgan gotas durante 72 horas, después de lo cual los esferoides, o el CM cargados de factores terapéuticos esfera derivados, se pueden recoger y potenci...

Discusión

El MSC óptima para su uso en algunas aplicaciones de investigación y clínicos debe ser altamente activa para maximizar su beneficio, y preferentemente prepara en condiciones XF definidos químicamente para reducir al mínimo la entrega de antígenos potenciales a partir de los componentes del medio xenogénicos tales como FBS. En los protocolos descritos aquí, hemos demostrado a los métodos 1) activar las MSC en cultivo 3D mediante la formación de esferoides, 2) lograr la activación 3D de las MSC en condiciones X...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling