JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Аннотация

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), весьма перспективны в биоинженерии и регенеративной медицины. MSCs может быть выделен из нескольких взрослых тканей с помощью их сильной присоединения к тканевой культуры , пластика , а затем дополнительно расширен в лабораторных условиях , наиболее часто с использованием фетальной бычьей сыворотки (FBS). Поскольку ФБС может вызвать MSCs стать иммуногенными, его присутствие в MSC культур ограничивает как клинические и экспериментальные применения клеток. Таким образом, исследования с использованием определенного химического Зенона бесплатно (XF) среды для MSC культур являются чрезвычайно ценными. Многие полезные эффекты ПКЦ, были отнесены к их способности регулировать воспаление и иммунитет, главным образом, за счет секреции иммуномодулирующих факторов, таких как фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и простагландин Е2 (ПГЕ2). Тем не менее, MSCs требует активации, чтобы произвести эти факторы и так как действие MSCs часто преходящи, большой интерес возник, чтобы обнаружить способы предварительной активации клеток PrioR для их использования, таким образом , исключая время задержки для активации в естественных условиях. Здесь мы представляем протоколы для эффективного включения или простых MSCs в трехмерных (3D) культур при химически определенных условиях и XF управлять этими предварительно активированная MSCs в естественных условиях. В частности, мы сначала опишем методы для создания сферической MSC микро-ткани или «сфероидов» в висячей капли с использованием среды и XF демонстрируют, как сферы и кондиционированной среды (CM) могут быть собраны для различных областей применения. Во- вторых, мы опишем экраны экспрессии генов и в пробирке функциональные тесты для быстрой оценки уровня активации MSC в сфероидов, подчеркивая противовоспалительное и противораковое потенциал клеток. В- третьих, мы опишем метод романа впрыснуть неповрежденные MSC сфероидов в брюшную полость мыши для естественных условиях тестирования эффективности в. В целом, протоколы в данном документе преодолеть основные проблемы получения предварительно активированного MSCs под химически определенной XF Conвиям и обеспечивают гибкую систему для администрирования MSC сфероиды для лечения.

Введение

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), показали большой потенциал для различных регенеративных подходов медицины. МСК были первоначально выделены в виде стромального компонента костного мозга , но с тех пор были получены от многих других тканях взрослого организма, в том числе жировой ткани 1, 2, 3. Интересно отметить, что основной способ изоляции включает замечательное свойство ПКЦ, чтобы плотно прилипать на тканевой культуры, пластика в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Хотя этот традиционный метод выделения позволяет легко и быстрое расширение MSCs в двумерной (2D) культуры, это также очень искусственным и не принимает во внимание значение нативной трехмерной (3D) окружающей среды , ведущие к потенциальной потере важных клеточных характеристик 4, 5 , 6. Таким образом, изучение MSCs в 3D культур, которыйявляются более физиологичным, чем традиционные 2D культур, возникла в поисках «потерянных / заниженных" MSC характеристик. Кроме того, большой интерес поднялся, чтобы идентифицировать Xeno свободных (XF) химически определенные условия для MSC культуры и активации, и таким образом сделать клетки более податливыми для клинического применения.

Многие исследования были опубликованы демонстрации 3D культуры ПКЦ как в биоматериалов и в виде сферических агрегатов или сфероидов. MSCs в биоматериалов первоначально были разработаны для тканевой инженерии подходы для замены поврежденных тканей с сотовыми посеяны каркасах, в то время как сфероида культуры MSCs рассматривались как способ понять поведение MSC в естественных условиях после введения клеток для терапии в доклинических или клинических испытаний 4, 5, 7. Интересно, что MSCs форма сфероидов спонтанно, когда присоединение к культуре ткани пластика не допускается8, 9, 10. Традиционно агрегация клеток облегчается с помощью методов колбах центрифужных или жидких методов наложения, методы, используемые первоначально в биологии рака в усилиях, чтобы попытаться имитировать микроокружение опухоли. В последнее время , дополнительные методы всплыли , которые демонстрируют агрегацию клеток в культуральные чашки , предварительно покрытые конкретными химическими веществами , чтобы предотвратить клетки к пластический адгезии 4, 5, 6. Один из самых простых и экономичных методов для генерации MSC сфероидов к культуре их в висячей капли, метод, который часто используется для получения эмбриональных телец из эмбриональных стволовых клеток. С свисающими технику культуры, прилипание клеток к культуре ткани пластика предотвращается путем суспендирования клеток в капле среды на нижней стороне ткани культуры блюдо крышкой и позволяя тяжести, чтобы облегчить клеточную AGGREGвания в вершине капли. Размер сфероид можно легко манипулировать с помощью изменения концентрации клеток или объема капли, что делает свисающими культур особенно легко контролировать.

В ранних исследованиях на 3D культуры ПКЦ продемонстрировали радикальные различия в характеристиках клеток в 3D по сравнению с их аналогами 2D 6, 8, 9. В то же время, отчеты показали , что благотворное воздействие MSCs в естественных условиях полагались на их способности активируются с помощью микро-сигналы окружающей среды и, в ответ, чтобы произвести противовоспалительное и иммуномодулирующее факторы 11. Интересно отметить, что многие из этих факторов, таких как простагландин Е2 (PGE2), фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и фактор роста гепатоцитов (HGF) были произведены в гораздо больших количествах MSC сфероидов, чем традиционные 2D MSCs прокладывают путь для Идеяс использованием 3D культур , чтобы активировать клетки 8, 12, 13. Кроме того, активация генов в 3D культурах появились перепросматривать механизмы, по крайней мере частично, активации клеток после инъекции в мышей 12. При активации MSCs до их использования в экспериментах эффекты клеток может быть продлен и более заметным , как традиционный MSC эффект в естественных условиях часто задерживается и переходных процессов , и может быть описана как "хит и запустить". В течение последних нескольких лет, важные функциональные исследования с использованием MSC сфероиды, показали , что они могут подавлять воспалительные реакции и модулирования иммунитета в естественных условиях, оказывая влияние на эффекторные клетки , такие как макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и Т - клеток , что делает сфероидов привлекательной формой загрунтованных ПКЦ ; 2 , 3. Кроме того, производство молекул противораковых, таких как Interleukin-24 (ИЛ-24) и фактор некроза опухолей , связанных с апоптозиндуцирующая лиганд (TRAIL), увеличены в 3D культурах ПКЦ по отношению к монослойный MSCs, явление , которое может быть использовано для целенаправленной терапии рака 8, 10, 14.

В соответствии с требованием не только использование тканевой культуры пластика, но и FBS традиционная культура MSC, еще одно препятствие, чтобы сделать MSC сфероиды более пригодным для клинического применения было необходимо преодолеть. Для решения этого препятствия, мы недавно показали образование MSC сфероидов при определенных химически определенных условиях и XF установлено , что в результате MSC сфероиды были активированы для получения тех же молекул противовоспалительными и противораковыми как сфероидов , генерируемых в условиях с FBS 14. Здесь эти результаты представлены в нескольких детальных протоколов, которые демонстрируют генерацию предварительно активированных MSCs в 3D культур с использованием XFСМИ. Кроме того, протоколы представлены, которые описывают эффективные способы оценки уровней активация MSCs в отношении их противовоспалительными, иммуномодулирующими и противораковым действием, вместе с практическим способом доставить неповрежденные сфероидов в мышей.

протокол

1. MSC Выделение и расширения

  1. Получение ранних прохождение MSCs из Центра для подготовки и распространения взрослых стволовых клеток ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~HEAD=pobj~~number=plural ) 15 , как замороженные флаконы. В качестве альтернативы, изолировать MSCs из аспирата костного мозга после рутинной 14 -й протокол и хранить в виде замороженных ампул.
  2. Подготовка полной культуральной среде (МКД), который является минимальным необходимым среда альфа (αMEM) с добавлением 15-20% премией выбрать FBS, 2 мМ L-глутамина, и 1x пенициллина-стрептомицина. Стерилизация среды путем фильтрации.
  3. Поместите 30 мл ССМ в 150 мм для культивирования клеток чашку для и инкубировать блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
  4. Выдержите замороженный флакон , содержащий приблизительно 10 6 MSCs в течение 2 мин в C водяной бане при 37 °.
  5. Перенести содержимое флакона в чашку для культивирования с использованием 5 мл серологической пипеткой и сполоснуть флакон несколько раз с 1-2 мл ССМ от тарелки, чтобы захватить остаточные клетки. Поместите блюдо на ночь в соответствующем инкубаторе.
  6. Тщательно промывать культуру дважды при комнатной температуре фосфатном буферном солевом растворе (PBS) и отсоединить MSCs 3 мл подогретого / этилендиаминтетрауксусной кислоты раствор 0,25% трипсина (ЭДТА). Отрыв обычно занимает приблизительно 3-4 мин в инкубаторе.
  7. Нейтрализовать трипсина в чашке с 6 мл CCM предварительно нагревают до 37 ° С и передачи клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку. Совместимый с промывками PBS для максимального выхода клеток.
  8. Центрифуга клетки (450 XG) в течение 10 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант.
  9. Повторное приостановить клетки в малом объеме СКК и подсчета жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра и трипановым синим.
  10. Seed соответствующее количество 150 - мм чашек при 100 клеток / см 2 в 30 мл теплого КМС и не инкубировать культуры приблизительно до 70-80% сплошности, обычно 7 дней со среды меняется каждые 2-3 дня и 24-48 ч до сбора урожая.
  11. Сбора клеток, как описано выше с трипсин / ЭДТА и объединить все клетки в одну коническую трубку с соответствующей средой. Центрифуга снова и повторно приостанавливать клетки в малом объеме той же среды для кровяных клеток. Используйте стандартный CCM (содержащий FBS) или различные имеющиеся в продаже XF медиа-композиций, здесь называют XF средней-1 (XFM-1) и XF средней-2 (XFM-2), так и без человеческого сывороточного альбумина (ЧСА, 13 мг / мл) добавки.

2. Получение активированного MSC сфероидов в 3-D висячие культур для Drop под XF Условия

  1. Для создания сфероиды приблизительно 25000 клеток, разбавить заготовленные MSCs в текущем СКК, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 мг / мл), XFM-2, или XFM-2 + HSA (13 мг / мл) в 714 клетках / мкл.
  2. Пипетка 35 мкл / капли клеток наизнанка перевернутой культуры блюдо крышкой 150 мм. Несколько капель можно легко пипеткой с помощью многоканальной пипетки.
    Примечание: Если большие или меньшие сфероидов желательно, изменять концентрацию клеток или объема капли (25-45 мкл) соответствующим образом.
  3. Перенесите 20 мл воды комнатной температуры PBS в основание тарелки и в одном непрерывном и устойчивом движении перевернуть крышку, содержащую капли, так что Вершины падение лицом вниз. Поместите крышку осторожно на основании чашки для культивирования.
  4. Передача блюдо в инкубаторе в течение 3-х дней, не нарушая его, чтобы обеспечить соответствующую сборку сферы.
  5. Через 72 ч, начинают урожай сфероид осторожно удалить крышку и переворачивая ее так, чтобы капли, еще раз, лицом вверх.
  6. Угол крышка примерно 10-20 ° и раздвинуть капли, содержащие сфероидов, к краю пластины с помощью мобильного подъемника.
  7. Перенесите сферы и среды в коническую пробирку на 15 мл с 1000 мкл трубыTTE. Использование комнатной температуры PBS и пипетку с тем же наконечником, чтобы вымыть плиту и обеспечить максимальное восстановление сфероидов.
  8. Для ПЦР в реальном времени анализов (протокол 3), центрифугировать сферы суспензии при 450 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант. Вымойте сфероиды с PBS и повторить как центрифугирование и аспирационных шаги. Для доставки в животных (протокол 8), позволяют сферы осесть в нижней части трубки (~ 3-4 мин) без центрифугирования.

3. ПЦР в реальном времени противовоспалительных и противораковых маркеров

  1. С помощью набора для экстракции РНК с гомогенизаторов колоннами и РНКазы ДНКазы Набор для выделения ДНК-свободной тотальной РНК из однослойных ПКЦ (Протокол 1) и MSC сфероиды (Протокол 2), которые были промыты с PBS и подвергали центрифугированию.
  2. Лизируйте по крайней мере, 100000 монослой МСК и 20 сфероидов из каждого условия в отдельных 15 мл конические пробирки с RLT буфером, содержащим бета-меркаптоэтанола (1: 100).
  3. Трансфер тщательно перемешанную смесь лизатов в 1,5 мл РНКазы пробирки и помещают в морозильную камеру (-80 ° C) в течение по меньшей мере 3 ч, чтобы помочь в сфероида лизиса.
  4. Оттепель клеточных лизатов на льду, вихрем кратко, и следовать инструкциям производителя для выделения РНК с использованием коммерчески доступного набора для выделения общей РНК млекопитающих.
  5. Количественно и оценить качество выделенной РНК с использованием спектрофотометра.
  6. Использование большой емкости кДНК с обратной транскрипцией Kit или эквивалент в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы генерировать кДНК для ПЦР в реальном времени.
  7. Поместите образцы кДНК, коммерчески разработанный ПЦР в реальном времени праймеров / зондов (экспрессии генов АНАЛИЗЫ) и PCR Master Mix на льду. С помощью праймеров / зондов для GAPDH (контроль), PTGS2 (ЦОГ-2, оказывает противовоспалительное), TNFAIP6 (TSG6, противовоспалительное), TRAIL (противораковый), и IL-24 (анти-рак).
  8. Подготовка ПЦР в реальном времени реакции в соответствии с инструкциями изготовителя для экспрессии генов Assays и Fast Universal Master Mix.
  9. Следуйте инструкциям для ПЦР в реальном времени инструмент для генерирования эксперимента документов и выполнение прогона.
  10. Анализ данных с помощью метода ΔΔC T путем расчета относительных изменений (относительное количество, RQ) в экспрессии генов с использованием GAPDH в качестве эндогенного контроля и однослойных MSCs в качестве базовой линии 8, 14.

4. Сбор КМ для анализами иммуномодулирующее и противораковых потенциал

  1. Заготавливают сфероидов и СМ, ​​как описано выше, в 15 мл коническую трубку, используя подъемное приспособление клеток и пипетку, однако, не мыть тарелки с крышками PBS, как это будет разбавлять CM.
  2. Центрифуга при 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, необходимо тщательно собрать бесклеточной надосадочной жидкости с помощью пипетки, и переносят надосадочную жидкость в 1,5 мл пробирки.
  3. Центрифуга при 10000 х г в течение 5-10 мин при комнатной температуре, осторожно собирают ХЛarified СМ с пипеткой, и передавать КМ в новые 1,5 мл пробирки для хранения в морозильной камере (-80 ° С). Готовят аликвот СМ перед замораживанием при использовании его для нескольких анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением анализов вниз по течению, концентрация ПГЕ2, хороший показатель противовоспалительного потенциала КМ, может быть определена с использованием коммерческого набора для ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрация TSG6 может быть определена с использованием опубликованного протокола 14.

5. Анализ Макрофаг для оценки противовоспалительного потенциала МСЦ-CM

  1. Готовят макрофага среду, которая состоит из модифицированной среде Дульбекко Eagle (DMEM), содержащей L-аланил-L-глутамина и дополненной 10% FBS премии выбрать и 1x пенициллин-стрептомицина. Фильтр-стерилизовать среду.
  2. Получение замороженного флакона приблизительно 10 6 J774 макрофагами мыши и инкубировать пробирку в течение 2 мин в C водяной бане при 37 °.
  3. Перенести содержимое флакона в 15 мл коническую пробирку, добавляют 9 мл макрофагального среды и центрифуге в течение 5 мин при 200-300 XG и при комнатной температуре.
  4. Аспирируйте супернатант, приостановить макрофаги в 1 мл макрофагального среды, а также передавать макрофаги в 150 мм чашку Петри, содержащую 30 мл макрофагального среды.
  5. Изменение среды каждые 2 дня и не инкубировать клетки в инкубаторе до примерно 70-80% сплошности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: макрофаги действительно плотно не прилипает к чашке Петри, таким образом, следует позаботиться о том, чтобы не потерять клеток со средним изменением.
  6. Урожай макрофаги путем распыления макрофага среды на клетки с пипеткой. Перенести клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируют в течение 5 мин при температуре 200-300 XG и комнатной температуре.
  7. Аспирируйте супернатант и суспендирования клеток в небольшом объеме макрофагальной среды для подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте концентрацию до 200000 клеток / мл с макрофагальной мнеDIUM.
  8. Для запуска настройки для анализа макрофагами, добавьте 480 мкл среды макрофагами в лунки 12-луночного планшета.
  9. Добавьте 20 мкл среды в макрофаг нестимулированных контрольных лунок и 20 мкл некондиционного или ЦКМ-кондиционированной среды, полученный выше, в экспериментальных скважинах. Смешайте среду в лунки, нажав на пластину.
  10. Передача 500 мкл суспензии клеток макрофагов к нестимулированных контрольных макрофаг скважин.
  11. Стимулируют оставшиеся макрофаги с добавлением 1: 500-1: 1000 из расчета 0,1 мг / мл липополисахарида (LPS) и инкубировать 5-10 мин при комнатной температуре.
  12. Передача 500 мкл стимулированных макрофагов в лунки с некондиционированной или MSC-кондиционированной среды. Смешайте скважин постепенно раскачивать пластину несколько раз.
  13. Перенести пластину в инкубаторе в течение 16-18 часов.
  14. Урожай макрофагами-кондиционированной среды и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
  15. Переводсупернатант в новые пробирки и анализа для фактора некроза опухоли-альфа (TNF-alpha) и интерлейкина-10 (IL-10) контента с помощью коммерческих наборов ELISA следующим инструкциям изготовителя.

6. Анализ спленоцитов для оценки иммуномодулирующих Потенциал сфероида-CM

  1. Подготовьте полный спленоцитов среду, состоящую из Института Rosewell Park Memorial (RPMI) -1640 среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS, 1x пенициллина-стрептомицина и 2-меркаптоэтанола. Фильтр-стерилизовать среду.
  2. Урожай Селезенки из умерщвлены-самцов мышей линии BALB / C через разрез , полученного на левой стороне живота над селезенкой, примерно на полпути между передней и задней ноги 14. Передача селезенку на ячейки фильтра 70 мкм , чтобы изолировать спленоцитов 14.
  3. Изолировать спленоцитов / лимфоциты, нажав селезенке через сетчатый фильтр 70 мкм в стерильную чашку Петри USINг мягкая резина / пластик конец плунжера из 2-3 мл шприца 14. Используйте шлифовальную круговое движение, чтобы отделить селезенку.
  4. Вымойте клеточный фильтр несколько раз холодным PBS и переносят клетки из чашек Петри в 50 мл коническую пробирку. Заполните трубку с холодным PBS и центрифугировать (500 XG) при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
  5. Аспирируйте супернатант и очистить клетки от эритроцитов путем инкубации с 5-10 мл красного раствора для лизиса клеток крови (в селезенке) в течение 5-10 мин.
  6. Остановить лизис путем добавления холодной PBS в пробирку и центрифугируют в течение 5-10 мин при 500g и при температуре 4 ° С.
  7. Приостановка Выделенные клетки в полной среде спленоцитов, фильтруют через сетчатый фильтр 40 мкм, и подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Добавить спленоцитов среду к клеточной суспензии , чтобы достичь конечной концентрации клеток 10 6 клеток / мл
    Примечание: Этот метод обычно дает приблизительно 3 × 10 7 спленоцитов за селезенки мыши.
  8. Стимулировать соответствующее количество спленоцитов с 2 мкг / мл анти-CD3e антитела в течение 5 мин.
    Примечание: Количество спленоцитов требуется, зависит от числа экспериментальных условий, определяемых исследователем (этап 6.9). Для каждого экспериментального образца / лунку, 10 6 спленоцитов требуется.
  9. Передача 10 6 спленоцитов (стимулируется или не стимулируется) в лунки 12-луночного планшета и добавить некондиционных (контроль) или MSC-CM в лунки при окончательном разведении 1: 10-1: 20.
  10. Урожай спленоцитов см после 24 ч и центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  11. Передача супернатант в новые пробирки и анализа для гамма-интерферона (IFN-gamma) содержание коммерческой ELISA набор, следуя инструкциям изготовителя.

7. Рак простаты анализа для оценки потенциала противораковой сфероида-CM

  1. Готовят полную ростовую среду RPMI, который среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, 1x пенициллина-стрептомицина.
  2. Получение замороженного пузырек LNCaP клеток рака простаты и инкубировать флакон в течение 2 мин в водяной бане при 37 ° C.
  3. Перенести содержимое флакона в культуральную чашку, содержащую 30 мл полной среды RPMI роста с использованием моторизованного дозаторов и 5 мл серологической пипеткой. Сполоснуть флакон несколько раз со средой из тарелки и поместить блюдо в инкубатор.
  4. Непосредственно перед клетки достигают слитности, мыть культуру дважды при комнатной температуре PBS и отделить LNCaP клеток с 3 мл подогретого 0,25% раствора трипсина / ЭДТА.
  5. Нейтрализовать трипсина в чашке с полной средой RPMI роста и переносят клетки вместе с промывками в коническую пробирку на 50 мл.
  6. Центрифуга клетки при 450 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант.
  7. Повторное приостановить клетки в небольшом объеме полной среды роста RPMI и подсчета раковых клеток с помощью гемоцитометра.
    8. Передача LNCaP клеток в блюдо 96-луночного в количестве 5000 клеток / лунку в 120 мкл полной среды роста RPMI, содержащей 25% некондиционированной или сфероида-CM. Инкубируют в термостате в течение 72 ч.
  8. Для проведения анализа роста клеток с использованием набора для анализа пролиферации клеток, аспирата среды из скважин и передачи пластины в морозильную камеру (-80 ° С) в течение по крайней мере 3 ч.
    1. Разморозить пластины и лизиса клеток в каждую лунку путем добавления 100 мкл клеточного лизиса, содержащего реагент мМ NaCl, 180, 1 мМ ЭДТА и 0,2 мг / мл РНКазы А.
    2. Для получения стандартной кривой, лизируют известные количества клеток LNCaP, как описано выше.
    3. Через 1 ч добавляют 100 мкл 1х буфера для лизиса клеток, содержащего 1: 100 разбавление реагента анализа клеточной пролиферации и измеряют флуоресценцию в каждую лунку, чтобы определить количество клеток.

8. Внутрибрюшинной Поставка Малонарушенных сфероидов

  1. Подготовьте сфероидами MSCs, как описано выше (протокол 2) и ресуспендируют тон сфер в стерильном Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с добавлением 0,2-0,5% HSA для поддержания условий XF. HSA в растворе помогает предотвратить сферы адгезии к пластмассе во время инъекции.
  2. Передача 40-120 сфероиды в 15 мл конические пробирки и промыть клетки путем добавления 6 мл HBSS / HSA к трубкам. Дайте 3-4 минуты для сферы спускаться вниз. Подготовьте независимую коническую трубку сфероидов для каждого животного. Кроме того, подготовить дополнительные трубки сфероидов для анализов, определяющих сохранение сфероида (см ниже 8.18) и производство лечебных факторов после передачи (см ниже 8.19) при желании.
  3. Аспирируйте супернатант, наложение сфероидов с 100-200 мкл стерильной HBSS с добавкой 0,2-0,5% ЧСА, и помещают пробирки на лед.
  4. Кратко обезболить животных с 2% изофлуран в 100% кислорода до исчезновения пинч-носочной рефлекса в течение приблизительно 2 мин в индукционной камере.
  5. Поместите животное внутри BSL-2 кабинета, спинной AspeCt вниз (вентральной стороной вверх), с непрерывным потоком 1,5% смеси изофлуран / кислород через носовой конус.
  6. Очистите нижнюю часть живота мыши с антисептиком, например, как 70% спирта.
  7. Снимите колпачок 20 G внутривенной (IV) катетер и выполнить внутрибрюшинную инъекцию с узлом катетер-шпильках. Используйте одну руку, чтобы держать кожу мыши, а другой для выполнения инъекции. Найдите точку инъекции примерно в середине искусственной линии, соединяющей согнутом коленном суставе и область половых органов с кончик иглы направлен в сторону средней линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Узел катетер-шпилька имеет более высокое сопротивление, чем обычный иглы, поэтому уход должен быть принят, чтобы не вводить иглу слишком глубоко в брюшной полости, что может привести к травмам внутренних органов. Проникновение кожи, а затем мышцы / брюшину может ощущаться во время установки катетера.
  8. Аккуратно удалите металл шпилек / иглу из узла катетер-шпильках. ChecК стилет для крови, мочи и кала и отказаться от него. Кровь на игле указывает пункцию внутреннего органа (ов).
  9. Держа пластиковый катетер в вертикальном положении во время инъекции, чтобы обеспечить поток текучей среды.
  10. Подтвердите правильное размещение пластикового катетера путем введения приблизительно 100 мкл стерильного HBSS / HSA через катетер с помощью пипетки с наконечником 100-200 мкл. Поместите конец наконечника пипетки внутри переходника катетера шприца, образующей герметичное уплотнение. Медленно впрыскивать жидкость внутрь брюшной полости.
    Примечание: Жидкость в правильном положении катетера циркулирует свободно внутри полости брюшины лишь незначительные корректировки катетера. Неправильное размещение катетера (подкожного или внутри-кишечное, или если кончик иглы ранения перитонеальных органов, таких как почки) будет увеличивать сопротивление и уменьшить поток. Подкожный размещение приведет к формированию очевидного «пузыря» под кожей.
  11. Сбор тон MSC сфероиды, подготовленные в 100-200 мкл HBSS / HSA (этап 8.3), используя 200 мкл кончиком пипетки, и передавать весь объем сфер (40-120 сфер) в брюшную полость через катетер, как описано выше.
  12. Промыть пробирку, содержащую шары 100 мкл HBSS / HSA, используя тот же наконечник, что и выше, чтобы собирать любые остаточные сфероиды и их вводят в брюшную полость.
  13. (Необязательно) Вводить дополнительно 100 мкл HBSS / HSA в брюшную полость промывать катетер.
  14. Поместите марлевый тампон, пропитанный антисептическим через катетер и медленно удалить катетер из брюшной полости и отказаться от него.
  15. Осторожно массировать брюшную полость с пальцами, чтобы обеспечить равномерное распределение сфероидов.
  16. Пусть животное восстанавливаться под пристальным наблюдением и следить за кровотечение из места инъекции.
  17. Осмотрите катетер и 15 мл трубку для оставшихся сфероидов. Это нормально наблюдать несколько сфер вкатетер / трубку.
    Примечание: Описанная методика для MSC доставки сфероида могут быть приняты для использования в нормальных животных или в различных моделях травмы. Этот метод был успешно использован для введения сфероиды в клетках мышиной роговицы травмы и модели эндотоксикоза, а также в зимозаном модели перитонита 8.
  18. Для того, чтобы определить число сохраняемых сфероидов (факультативно), использовать ДНК на основе количества клеток количественного набора / реагента. Держите использованный катетер за 15 мл пробирку и энергично обойтись HBSS / HSA через катетер, чтобы заставить оставшихся сфер обратно в 15 мл пробирку.
    1. Центрифуга 15 мл трубки при 500g в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата супернатант. Передача трубки, содержащей сфероид осадок в морозильную камеру (-80 ° C) в течение по меньшей мере 3 ч.
    2. Разморозить трубу и лизировать сферы путем добавления 500 мкл клеточного лизиса, содержащего реагент мМ NaCl, 180, 1 мМ ЭДТА и 0,2 мг / мл РНКазы А.
    3. Для управления, FreЭз и лизируют известное количество сфероидов (предпочтительно эквивалентно количеству сфероидов, подготовленных для одной инъекции), как описано выше.
    4. Через 1 ч передать 100 мкл клеточного лизата, в двух экземплярах, в 96-луночный микропланшет и добавить в каждую лунку по 100 мкл 1х буфера для лизиса клеток, содержащего разведение 1:50 реагента анализа клеточной пролиферации из комплекта. Через 10 мин измеряют флуоресценцию в каждую лунку, чтобы определить количество сфер, которые не были впрыскивается путем сравнения экспериментального образца (ов) с контрольным образцом.
  19. Оценить уровень активации сфероидов подготовленных для инъекций (опционально) путем измерения концентрации ПГЕ2 и TSG6 производимого переданных сфер. Передача 40-120 сферы через катетер, как описано выше, в 12-луночный или 6-луночный планшет, содержащий 1 или 2 мл αMEM, дополненной 2% FBS и 1x пенициллина / стрептомицина. Место пластин в инкубаторе в течение 6 часов.
    1. Перенести среду излунки после 6 ч в 1,5 или 15 мл пробирки и центрифугируют пробирки при 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Перенести бесклеточной супернатант в свежую 1,5 мл пробирки с помощью пипетки и центрифуге при 10000 х г в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
    3. Перенести осветленной CM (надосадочную) в новые 1,5 мл пробирки и анализа для концентрации PGE2 (хороший показатель противовоспалительного потенциала см) с использованием коммерческого набора для ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрация TSG6 может быть определена с использованием опубликованного протокола 14.

Результаты

В текущей работе, свисающие культуры капли были использованы для создания компактных сферических микро-ткани или «сфероидов» активированных MSCs в условиях XF. Исследуемое дорожную карту на рисунке 1 видно , что MSCs рекомендуется самосборке в сфероидов при сусп?...

Обсуждение

Оптимальная MSC для использования в некоторых научно-исследовательских и клинических применений должны быть высоко активированы, чтобы максимизировать их выгоду, и предпочтительно получают в химически определенных условиях XF, чтобы минимизировать доставку потенциальных антигенов и?...

Раскрытие информации

The authors declare they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MEM-α (minimal essential medium alpha)ThermoFisher/Gibco12561049; 12561056; 12561072minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium selectAtlanta BiologicalsS11595; S11510; S11550; S11595-24component of complete culture media for all types of cells
L-glutamineThermoFisher/Gibco25030081; 25030149; 25030164component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/StreptomycinThermoFisher/Gibco15070063component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membraneMilliporeSigmaSCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11REmedia sterilization
150 mm cell culture dishNuncD8554 SIGMAcell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubatorThermo FisherModel 3110incubation of cultured cells
Early passage MCSsCenter for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & WhiteNApreparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bathVWR89501-468warming media to 37 °C
PipettesEppendorf492000904manual liquid handling
Pipete-AidDrummond Scientific Company4-000-300handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)Corning4487; 4101; 4251; 4490liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4ThermoFisher/Gibco10010023; 10010072; 10010031; 10010049cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solutionThermoFisher/Gibco25200056; 25200072; 25200114lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tubeCorning/BD Falcon352097cell centrifugation
50 ml conical tubeCorning/BD Falcon352098cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifugeEppendorf/Fisher ScientificModel 5810Rcell centrifugation
hemocytometerFisher Scientific26716cell counting
trypan blueSigma-AldrichT8154 SIGMAdead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)ThermoFisher/GibcoA1067501Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)Stem Cell Technologies5420Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)Gemini800-120Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)Sigma-AldrichA9731 SIGMAComponent of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini KitQiagen74104Total RNA extraction
QiashredderQiagen79654Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set Qiagen79254On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250 ALDRICHinhibition of RNAses in RLT buffer
VortexVWR97043-562mixing sample
SpectrophotometerBioradNARNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFisher/Applied Biosystems4368814transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression AssaysThermoFisher/Applied Biosystemsvariesprimer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master MixThermoFisher/Applied Biosystems4352042; 4364103; 4366073; 4367846master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)ABI PrizmNAreal-time PCR
1.5 ml centrifuge tubeEppendorf22364111cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezerThermo FisherModel Thermo Forma 8695sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA KitR&D SystemsKGE004Bestimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)ThermoFisher/Gibco10566-016; 10566-024;10566-032macrophage culture media
J774 mouse macrophagesATCCTIB-67mouse macrophage cell line
12-well plateCorning3513in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)Sigma-aldrichL4130in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kitR&D SystemsMTA00Bestimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kitR&D SystemsM1000Bestimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 mediumThermoFisher/Gibco11875-085splenocyte culture media
BALB/c miceThe Jackson Laboratory651in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade PurifiedeBioscience145-2C11in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer Corning352350Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)Affymetrix eBioscience00-4333removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kitR&D SystemsMIF 00estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells ATCCCRL-1740study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kitThermoFisherC7026cell number measurement based on DNA content
NaClSigma-AldrichS5150component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)ThermoFisherFERR1021calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase AQiagen19101RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate readerBMG TechnologyNAMicroplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol redThermoFisher/Gibco14175079resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
IsofluraneMWI Vet Supply502017Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gasPraxairNAFor use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinetThermo FisherModel 1385Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inchTerumoSR*FNP2025Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tipsEppendorfvariesliquid/cells handling

Ссылки

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  19. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  20. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  21. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  22. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  23. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  24. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  25. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1213DSpheroids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены