Producción de eliminación rápida en hongos vía<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Resumen

Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.

Resumen

La deleción precisa de los genes de interés, dejando el resto del genoma sin cambios, proporciona el producto ideal para determinar la función de ese gen particular en el organismo vivo. En este protocolo se describe el método OSCAR de construcción de plásmidos de deleción precisa y rápida. OSCAR se basa en el sistema de clonación en el que se lleva a cabo una única reacción de recombinasa que contiene los flancos 5 'y 3' amplificados por PCR purificados del gen de interés y dos plásmidos, pA-Hyg OSCAR (el vector marcador) y pOSCAR vector). La confirmación del vector de deleción correctamente ensamblado se lleva a cabo por mapeo de digestión de restricción seguido por secuenciación. Agrobacterium tumefaciens se utiliza entonces para mediar la introducción de la construcción de deleción en esporas de hongos (denominado ATMT). Por último, se describe un ensayo de PCR para determinar si la construcción de deleción se integra mediante recombinación homóloga o no homóloga, indicando deleción de gen oEctópica, respectivamente. Este enfoque se ha utilizado con éxito para la deleción de numerosos genes en Verticillium dahliae y en Fusarium verticillioides entre otras especies.

Introducción

La disección genética es una poderosa metodología para determinar la importancia funcional de individuos o combinaciones de genes. Un enfoque estándar para comprender el papel de genes específicos es la producción de mutantes de un solo gen inalterados en cualquier otro gen. El enfoque más potente y menos potencialmente confuso es la supresión completa y precisa del marco de lectura abierto de un gen de interés (GOI ORF) sin dañar ninguna otra función génica.

Debido a que los enfoques de ligación estándar para la generación de plásmidos de deleción requieren múltiples etapas, el racional para OSCAR ¹ era producir un enfoque in vitro más rápido. La figura 1 representa el proceso de montaje en el enfoque de OSCAR. El método descrito aquí tiene la ventaja de combinar la construcción rápida de vectores individuales de deleción de genes en una única reacción de múltiples partes en combinación con el posterior transfo mediado por Agrobacterium tumefaciensRencia (ATMT). OSCAR es muy rápido y se compara bien con otras estrategias como el uso del ensamblaje Gibson en levadura ² . El método OSCAR se ha utilizado con éxito con varias especies de hongos Ascomycota. Estas especies incluyen: Fusarium verticillioides (inédito), Verticillium dahliae ³ , Setosphaeria turcica ⁴ , Metarhizium robertsii ⁵ , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum ⁶ , Pestalotiopsis microspora ⁷ , Colletotrichum higginsianum ⁸ y Dothistroma septosporum ⁹ y Sarocladium zeae (inédito) .

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el método que incluye diseño de cebador, amplificación por PCR de flanco, reacción de OSCAR BP, confirmación de estructura de construcción de deleción, transformaciónDe Agrobacterium con el constructo seguido de la transferencia basada en ATMT de la construcción de deleción en las células fúngicas y finalmente diferenciando mutantes de deleción de hongos de aquellos con construcciones de deleción ectopicamente integradas.

Protocolo

1. Diseño del cebador para la amplificación por PCR de los flancos génicos

1. Descargar a un archivo de procesamiento de texto la región genómica del gen de interés (GOI) incluyendo el marco de lectura abierto (ORF) y al menos 2 kb que flanquean el gen en cada lado de FungiDB u otro recurso de datos genómicos.
2. Resalte el ORF destinado a la deleción y los codones de inicio y fin de la etiqueta.
3. Identificar y resaltar ORFs adyacentes dentro de la secuencia descargada.
4. Utilice el extremo 5 'de 2 kb del ORF de GOI y la herramienta de diseño de cebadores (ver Lista de Materiales) para diseñar el par de cebadores de PCR O1 y O2 para generar un producto de tamaño mínimo de 1 kb. Tenga cuidado de no impactar los ORF adyacentes.
   1. Pegue el flanco de 2 kb 5 'en la ventana "Sequence Entry". Haga clic en "Mostrar parámetros personalizados" cuadro. Introduzca los siguientes parámetros de diseño personalizados: primer TM 58 (min), 60 (opt) y 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) y 60 (máximo); Tamaño del cebador 22 (min), 24 (opt) y 26(Máx.); Amplicón Tamaño 1250 (min), 1500 (opt) y 2000 (máximo).
   2. Elija el resultado que coloca el cebador inverso (O2) más cercano al ORF. Capture una captura de pantalla de los ensayos y copie y pegue las secuencias de primer en el documento de procesamiento de texto.
   3. Repita el proceso para el flanco 3 'para generar los cebadores O3 y O4, esta vez elija el resultado colocando el cebador directo (O3) más cercano al ORF objetivo.
5. Añadir sitios de unión apropiados a los extremos 5 'de los cebadores 1 a 4 (véase la Tabla 1 ).
6. También diseñe y ordene cebadores específicos de ORF que se utilizarán para confirmar la eliminación en la sección 4 a continuación. Los parámetros deben ser los mismos que en el paso 1.4.1, excepto el uso de Amplicon tamaño 500 (min), 750 (opt) y 1000 (máximo) de ajuste de la longitud de ORF si es necesario. Finalmente, para la confirmación de recombinantes homólogos, genere cebadores 5 'hacia fuera y 3' hacia fuera descubiertos fuera de los flancos dentro del cromosoma. Estos cebadores "fuera" se utilizarán conHigR (210) e hygF (850), respectivamente ( Fig. 2 ).
7. Primeros de pedido.

2. Producción de OSCAR Constructs

1. Utilizando una Taq de alta fidelidad, se realizan dos reacciones, una para los flancos 5 'y 3', usando cebadores (100 μM) O1 y O2 en una reacción y los cebadores O3 y O4 en la segunda. La mezcla de reacción contiene lo siguiente: 29,5 mu l de agua destilada estéril (SDW), 5 mu l de tampón de PCR 10x LA, 8 mu l de mezcla de dNTP 2,5 mM, 5 mu L de MgCl _ { ₂ } 25 mM, 1 mu l de plantilla (50 ng / (0,5 μl de Primer O3 y 0,5 μL de Primer O4 para el flanco 3 '). Las condiciones de reacción de uso son las siguientes: 94ºC durante 1 min, luego 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 min, luego pasos finales de 72 ° C durante 5 min y luego se mantienen indefinidamente a 10 ° C.
2. Ejecutar 0,8%Agarosa 1x electroforesis en gel TAE (40 mM Tris acetato pH 8,3, EDTA 1 mM) durante aproximadamente 125 Vh en un aparato de minigel estándar para determinar el tamaño del producto y la concentración relativa. Post mancha el gel con mancha de non-ethidium de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Visualice en un iluminador UV.
3. Si los productos de los flancos 5 'y 3' están en una concentración aproximadamente igual, combinarlos y utilizar un kit de columna de afinidad (o precipitación con PEG 90 μL de productos de PCR combinados, 240 μl de tampón TE pH 7,5, 160 μL de 30% de polietilenglicol PEG8000 30 mM MgCl ₂ ) para co-purificar los productos de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante. Si no son de igual concentración, combinar todo el producto de baja concentración con una cantidad estimada igual de producto de la reacción de rendimiento más alto.
4. Utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de ADN purificado.
5. Realizar la reacción de BP mezclando lo siguiente: 1 μl de 60 ng / μL de pOSCAR, 2 μl de 60 ng /ΜL de pA-Hyg-OSCAR, 1 μl de flancos combinados de 60 ng / μl, 1 μl de clonasa. Incubar durante 16 h a 25 ° C. Terminar la reacción añadiendo 0,5 μL de proteinasa K e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
6. Transformar alta competencia E. Coli . Tanto las células competentes comercialmente disponibles como las células competentes de DH5α CaCl2 hechas en casa se usaron satisfactoriamente como receptores como se describe en las instrucciones del fabricante. Placa de bajo contenido de sodio (0,5 g / L de NaCl) LB que contiene 100 μg / ml de espectinomicina (Spec).
7. Identificar la construcción correcta mediante la realización de minipreps de ADN ¹⁰ de las colonias generadas anteriormente. Realizar una doble digestión con Hin dIII y Kpn I de la siguiente manera: pipetear 5 μL de ADN, 2 U de cada enzima, 2 μl de tampón 10x apropiado con SDW hasta un volumen total de 20 μL. Esto libera el inserto (aproximadamente 4,5 kb con los flancos del gen de 1,5 kb) del vector (aproximadamente 7 kb) y corta cualquier sitio enFlancos que pueden dar tamaños de banda predecibles.
8. Secuencia ¹¹ seleccionan clones que muestran un patrón de bandas apropiado.

3. Agrobacterium tumefaciens Transformación mediada (ATMT) de los hongos

1. Transformar Agrobacterium tumefaciens cepa AGL1 con OSCAR deleción construir ¹² .
2. Transformar el hongo con AGL1 que contiene el plásmido de deleción GOI OSCAR. Para ello, realice los siguientes pasos:
   1. Preparar una suspensión de esporas fúngicas con agua estéril a 2 x 10 ⁶ esporas / mL. Cuantificar las esporas en un hemocitómetro o en un contador automático de células. Coloque 500 μl de esto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta configuración es para 4 placas de transformación.
   2. Utilizar un bucle desechable estéril azul para añadir una gota fácilmente visible (debe cubrir aproximadamente el 20% del diámetro del bucle) del plásmido de deleción que contiene AGL1 a partir del medio LB-Spec 100 de 2-3 días de edad (véase MPara la composición) que contienen las placas y mezclar en la suspensión de la espora. Vórtice hasta que las células bacterianas estén bien dispersas (aproximadamente 5 min de velocidad media).
   3. Pipetear 100 μl de la suspensión de conidia-Agro sobre el centro de un filtro de membrana de celulosa colocado en cada una de las cuatro placas de Petri de 6 cm que contienen el medio de co-cultivo ¹² .
   4. Separe la suspensión con perlas de vidrio estériles (aproximadamente 4) para cubrir toda la superficie del filtro de membrana. Alternativamente, esparcir la suspensión con una herramienta de esparcido tradicional. Deje que el filtro de membrana se seque en una campana durante aproximadamente 10 min, envuelva con una película de parafina. Repita los pasos 3.2.2 y 3.2.3 para configurar múltiples transformaciones.
   5. Incubar la placa durante 2 días a temperatura ambiente, invertida.
   6. Transferir el filtro de membrana a un medio de selección de Aspergillus de 6 cm que contiene higromicina B (Hyg) 150 μg / ml, cefotaxima 200 mM y 100 μg / mlMoxalactama. Incubar a temperatura ambiente durante 5-7 días antes de aislar Hyg colonias resistentes.
   7. Con palillos de dientes estériles, transfiera los transformantes putativos a placas de 6 cm de Agar de Dextrosa de Patata (PDA) que contienen 150 μg / mL de Hyg, 100 μg / mL de kanamicina.

4. Identificación de mutantes por PCR

1. Extraer el ADN para la PCR de transformantes por termólisis [ ^13] .
   1. Una vez que los transformantes forman colonias en el PDA de la etapa 3.2.7, utilice un palillo estéril para transferir una pequeña cantidad (2 mm x 2 mm) de micelio o células de levadura de la colonia a 100 μl de solución de lisis (fosfato sódico 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 5%) en un tubo de microcentrífuga.
   2. Incubar la mezcla a 85-90 ° C durante 20-30 min. Almacenar el extracto crudo que contiene ADN genómico a -20 ° C hasta su uso en el paso 4.2.
2. Llevar a cabo 4 reacciones de PCR por transformante, una cada dEtect recombinación homóloga de los flancos 5 'y 3', respectivamente, uno para el marcador seleccionable (higromicina fosfotransferasa en este caso) y uno para el GOI ORF.
   NOTA: En general, utilizamos Taq de baja fidelidad de bajo costo para estas reacciones. Las condiciones de reacción son las descritas en el paso 2.1 anterior y contienen SDW 20 μl, tampón Taq 10x 2,5 μl, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, Taq ¹⁴ casero, 0,5 μL, Primer A (100 μM) ) 0,5 mu L, Plantilla 0,5 mu l. Pueden utilizarse igualmente cantidades de cebadores de concentración más baja (10 μM).
3. Ejecutar un gel de agarosa ( por ejemplo, 0,8%) de los productos de PCR. Los mutantes de eliminación producirán la banda Hyg pero no un producto ORF. Los integrantes ectópicos mostrarán ambas bandas. El tipo salvaje producirá solamente la banda ORF.
4. Almacenar permanentemente mutantes de deleción (y un transformante ectópico o dos para los controles) para uso futuro.
   NOTA: El 15% de glicerol se utiliza para sRasgó nuestras cepas a largo plazo a -80 ° C.

Resultados

El método OSCAR, en una única reacción, genera un plásmido que contiene los flancos del gen diana que se ha de deletar rodeando el casete marcador seleccionable. La producción de construcciones de deleción usando OSCAR es muy eficiente. Sin embargo, el sistema puede producir construcciones parciales que contienen algunos pero no todos los tres fragmentos (los dos flancos del gen y el marcador seleccionable). Generalmente, la mayoría de los transformantes de E. coli contie...

Discusión

La construcción en un solo paso de los plásmidos preparados con recombinación de Agrobacterium (OSCAR) se ha empleado con éxito con un número cada vez mayor de hongos Ascomycota. El método también debe ser fácilmente aplicable a Basidiomycota y especies de otros phylas de hongos (con promotores apropiados que conducen genes marcadores seleccionables), suponiendo que la transformación mediada por Agrobacterium y la recombinación homóloga son posibles. Se han generado vectore...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
FungiDB			Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest	IDT		Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word			Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium			E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium			ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin			Fungal transformant selection
PDA medium	Acumedia	7149A	Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium			Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads	Genlantis	C400100	Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm)	Fisher	09-719-555	Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes			multiple preps
Petri plates (various)			Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR	Addgene	29640	Selectable marker vector
pOSCAR	Addgene	29639	Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells	Life Technologies	12297-016	BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells	Life Technologies	A10460	Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks			Colony streaking
Toothpicks			Colony picking
Microcentrifuge			Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge			Fungal spore collection
Dissecting microscope			Single spore isolation
Automated Cell Counter			Spore suspension calculation
Compound microscope			Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq	Takara Bio USA	RR002A	Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B	InvivoGen	ant-hg-5
Spectinomycin	Sigma	22189-32-8
Cefotaxime	TCI America	C2224
Kanamycin		11815032
Moxalactam	Sigma-Aldrich	43963
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104)
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Thermo Fisher Scientific	11789020	Used to assemble deletion construct in pOSAR