Production de deletion rapide dans les champignons via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transformation médiatisée des constructions de suppression OSCAR

Résumé

Les mutants de délétion de gène générés par recombinaison homologue sont l'étalon-or pour les études de fonction de gène. Le procédé OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) pour la génération rapide de constructions de suppression est décrit. La transformation fongique médiée par Agrobacterium suit. Enfin, une méthode de confirmation basée sur la PCR des délétions de gènes dans les transformants fongiques est présentée.

Résumé

La suppression précise des gènes d'intérêt, tout en laissant le reste du génome inchangé, constitue le produit idéal pour déterminer la fonction du gène particulier dans l'organisme vivant. Dans ce protocole, on décrit la méthode OSCAR de construction de plasmide de deletion précise et rapide. OSCAR s'appuie sur le système de clonage dans lequel une seule réaction de recombinase est réalisée contenant les flancs 5 'et 3' amplifiés par PCR du gène intéressant et deux plasmides, pA-Hyg OSCAR (le vecteur marqueur) et pOSCAR (l'assemblage vecteur). La confirmation du vecteur de suppression correctement assemblé s'effectue par une cartographie de la digestion par restriction suivie d'un séquençage. Agrobacterium tumefaciens est ensuite utilisé pour méditer l'introduction de la construction de deletion dans les spores fongiques (appelées ATMT). Enfin, un essai de PCR est décrit pour déterminer si la construction de deletion est intégrée par une recombinaison homologue ou non homologue, indiquant la suppression du gène ouIntégration ectopique, respectivement. Cette approche a été utilisée avec succès pour la suppression de nombreux gènes dans Verticillium dahliae et dans Fusarium verticillioides parmi d'autres espèces.

Introduction

La dissection génétique est une méthodologie puissante pour déterminer l'importance fonctionnelle de l'individu ou des combinaisons de gènes. Une approche standard pour comprendre le rôle des gènes spécifiques est la production de mutants géniques uniques inchangés dans tout autre gène. L'approche la plus puissante et la moins potentiellement confuse est la suppression complète et précise d'un cadre de lecture ouvert du gène d'intérêt (GOF ORF) sans endommager d'autres fonctions génétiques.

Parce que les approches de ligature standard pour la production de plasmides de suppression nécessitent des étapes multiples, le rationnel pour OSCAR ¹ était de produire une approche in vitro plus rapide. La figure 1 représente le processus d'assemblage dans l'approche OSCAR. La méthode décrite ici a l'avantage de combiner la construction rapide de vecteurs individuels de délétion de gène dans une seule réaction multipartite en combinaison avec un transfo médié ultérieur Agrobacterium tumefaciens(ATMT). OSCAR est très rapide et se compare bien avec d'autres stratégies telles que l'utilisation de l'assemblage de Gibson dans la levure ² . La méthode OSCAR a été utilisée avec succès avec plusieurs espèces de champignons d'Ascomycota. Ces espèces comprennent : Fusarium verticillioides (non publié), Verticillium dahliae ³ , Setosphaeria turcica ⁴ , Metarhizium robertsii ⁵ , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum ⁶ , Pestalotiopsis microspora ⁷ , Colletotrichum higginsianum ⁸ et Dothistroma septosporum ⁹ et Sarocladium zeae (non publié) .

Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour la méthode, y compris la conception de l'amorce, l'amplification par PCR du flanc, la réaction OSCAR BP, la confirmation de la structure de la construction de la suppression, la transformationIon d' Agrobacterium avec la construction suivie d'un transfert à base de ATM de la construction de deletion dans les cellules fongiques et finalement différenciant les mutants de deletion des champignons de ceux avec des constructions de suppression ectopiquement intégrées.

Protocole

1. Conception d'amorce pour l'amplification par PCR des flancs de gènes

1. Téléchargez dans un fichier de traitement de texte la région génomique du gène d'intérêt (GOI), y compris le cadre de lecture ouvert (ORF) et au moins 2 kb flanquant le gène de chaque côté de FungiDB ou d'autres ressources de données génomiques.
2. Mettez en surbrillance l'ORF destiné à la suppression et à l'amorçage des étiquettes et à l'arrêt des codons.
3. Identifiez et mettez en évidence les ORF adjacents dans la séquence téléchargée.
4. Utilisez l'extrémité de 5 kb de l'ORF GOI et l'outil de conception d'amorce (voir la liste des matériaux) pour concevoir la paroi d'amorce PCR O1 et O2 pour générer un produit de taille minimale de 1 kb. Veillez à ne pas toucher les ORF adjacents.
   1. Collez le flanc de 5 kb de 5 'dans la fenêtre "Entrée de séquence". Cliquez sur "Afficher les paramètres personnalisés". Entrez les paramètres de conception personnalisés suivants: amorce TM 58 (min), 60 (opt) et 62 (max); Primaire GC 40 (min), 50 (opt) et 60 (max); Primer Taille 22 (min), 24 (opt) et 26(Max.); Amplicon Taille 1250 (min), 1500 (opt) et 2000 (max.).
   2. Choisissez le résultat qui place l'amorce inverse (O2) la plus proche de l'ORF. Capturez une capture d'écran des tests et copiez et collez les séquences d'amorces dans le document de traitement de texte.
   3. Répétez le processus pour le flanc 3 'pour générer les amorces O3 et O4, choisissez cette fois le résultat en plaçant l'amorce directe (O3) la plus proche de l'ORF cible.
5. Ajoutez les sites attachés appropriés aux extrémités 5 'des amorces 1 à 4 (voir le tableau 1 ).
6. Également concevoir et commander des amorces spécifiques à ORF à utiliser pour la confirmation de suppression dans la section 4 ci-dessous. Les paramètres doivent être identiques à ceux de l'étape 1.4.1, sauf utiliser Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) et 1000 (max) pour la longueur de l'ORF si nécessaire. Enfin, pour la confirmation des recombinants homologues, générez des amorces 5 'et 3' trouvées juste en dehors des flancs dans le chromosome. Ces amorces "hors" seront utilisées avecHygR (210) et hygF (850), respectivement ( Fig. 2 ).
7. Commander les amorces.

2. Production de constructions OSCAR

1. En utilisant une Taq de haute fidélité , effectuez deux réactions, une pour les flancs 5 'et 3', en utilisant des amorces (100 μM) O1 et O2 dans une réaction et les amorces O3 et O4 dans la seconde. Le mélange réactionnel contient ce qui suit: 29,5 μL d'eau distillée stérile (SDW), 5 μL de tampon de PCR 10x LA, 8 μL de mélange de dNTP 2,5 mM, 5 μL de MgCl ₂ 25 mM, gabarit de 1 μL (50 ng / μL), 0,5 μL de hi- Taq de fidélité, 0,5 μL d'amorce O1 et 0,5 μL d'apprêt O2 pour un flan de 5 '(ou 0,5 μL d'amorce O3 et 0,5 μL d'amorce O4 pour le flanc 3') Les conditions de réaction d'utilisation sont les suivantes: 94 ° C pendant 1 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min, puis étapes finales de 72 ° C pendant 5 min, puis maintenez-le indéfiniment à 10 ° C.
2. Exécuter 0,8%Agarose 1x TAE (40 mM Tris acétate pH 8,3, 1 mM EDTA) électrophorèse sur gel pour environ 125 Vh dans un appareil minigel standard pour déterminer la taille du produit et la concentration relative. Postez le gel avec une tache non éthidique conformément aux instructions du fabricant. Visualiser sur un illuminateur UV.
3. Si les produits de flan de 5 'et 3' sont en même temps concentrés, combinez-les et utilisez un kit de colonne d'affinité (ou précipitation de PEG 90 μL de produits de PCR combinés, 240 μL de tampon TE pH 7,5, 160 μL de 30% de polyéthylèneglycol PEG8000 30 mM de MgCl ₂ ) pour co-purifier les produits de PCR selon le protocole du fabricant. Si elles ne sont pas de concentration égale, combiner tout un produit à faible concentration avec une quantité équivalente estimée de produit à partir de la réaction à rendement élevé.
4. Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la concentration d'ADN purifiée.
5. Effectuer la réaction BP en mélangeant ce qui suit: 1 μL de 60 ng / μL de pOSCAR, 2 μL de 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL de flancs combinés de 60 ng / μL, 1 μL de clonase. Incuber pendant 16 h à 25 ° C. Terminer la réaction en ajoutant 0,5 μL de protéinase K et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
6. Transformez la haute compétence E. Cellules coli . Les cellules compétentes disponibles dans le commerce et les cellules compétentes de DH5α CaCl ₂ fabriquées à la maison ont été utilisées avec succès en tant que destinataires comme décrit par les instructions du fabricant. Plaque sur faible teneur en sodium (0,5 g / L de NaCl) LB contenant 100 μg / mL de spectinomycine (Spec).
7. Identifiez la construction correcte en effectuant des minipreps d'ADN ¹⁰ des colonies générées ci-dessus. Effectuer une double digestion avec Hin dIII et Kpn I comme suit: pipeter 5 μL d'ADN, 2 U de chaque enzyme, 2 μL de tampon 10x approprié avec SDW à 20 μL de volume total. Cela libère l'insertion (environ 4,5 kb avec des flancs de gènes de 1,5 kb) du vecteur ( environ 7 kb) et coupe tous les sitesFlancs qui peuvent donner des tailles prévisibles de bande.
8. La séquence ¹¹ sélectionne des clones présentant un motif de bande approprié.

3. Agrobacterium tumefaciens Transformation médiatisée (ATMT) des champignons

1. Transformez la souche AGL1 d' Agrobacterium tumefaciens avec la construction de suppression OSCAR ¹² .
2. Transformer le champignon avec AGL1 contenant le plasmide de suppression GOI OSCAR. Pour ce faire, procédez comme suit:
   1. Préparez une suspension de spores fongiques avec de l'eau stérile à 2 x 10 ⁶ spores / mL. Quantifier les spores sur un hémocytomètre ou un compteur automatisé de cellules. Placez 500 μL dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Cette configuration est pour 4 plaques de transformation.
   2. Utilisez une boucle stérile stérile bleue pour ajouter une goutte facilement visible (devrait couvrir environ 20% du diamètre de la boucle) du plasmide de deletion contenant AGL1 à partir du milieu LB-Spec 100 de 2 à 3 jours (voir MListe des compositions pour la composition) contenant des plaques et mélanger dans la suspension de spores. Les cellules bactériennes de vortex jusqu'à la dispersion sont bien dispersées ( environ 5 min de vitesse moyenne).
   3. Pipetter 100 μL de la suspension Conidia-Agro sur le centre d'un filtre à membrane en cellulose placé sur chacune des quatre boîtes de Petri de 6 cm contenant du milieu de culture intermédiaire ¹² .
   4. Faites passer la suspension avec des billes de verre stériles (environ 4) pour recouvrir toute la surface du filtre à membrane. Alternativement, répartir la suspension à l'aide d'un outil d'épandage traditionnel. Laisser sécher le filtre à membrane dans un capot pendant environ 10 min, enrouler avec un film de paraffine. Répétez les étapes 3.2.2 et 3.2.3 pour configurer plusieurs transformations.
   5. Incuber la plaque pendant 2 jours à température ambiante, inversée.
   6. Transférer le filtre à membrane sur un milieu de sélection d' Aspergillus de 6 cm ¹² plaques contenant de l'hygromycine B (Hyg) 150 μg / mL, cefotaxime 200 mM et 100 μg / mLMoxalactam. Incuber à température ambiante pendant 5-7 jours avant d'isoler les colonies résistantes à l'Hyg.
   7. Avec des cure-dents stériles, transférez des transformants putatifs sur des plaques d'agarine de dextrose de pomme (PDA) de 6 cm contenant 150 ug / ml d'Hyg, 100 μg / ml de kanamycine.

4. Supprimer l'identification de mutant par PCR

1. Extraire l'ADN pour la PCR des transformants par thermolyse ¹³ .
   1. Une fois que les transformants forment des colonies sur le PDA à partir de l'étape 3.2.7, utiliser un cure-dent stérile pour transférer une petite quantité (2 mm x 2 mm) de cellules de mycélium ou de levure de la colonie en 100 μL de solution de lyse (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 5% de glycérol) dans un tube à microcentrifugeuse.
   2. Incuber le mélange à 85-90 ° C pendant 20 à 30 minutes. Conserver l'extrait brut contenant de l'ADN génomique à -20 ° C jusqu'à l'utilisation à l'étape 4.2.
2. Effectuer 4 réactions de PCR par transformant, chacune à dEtect recombinaison homologue des flancs 5 'et 3', respectivement, une pour le marqueur sélectionnable (hygromycine phosphotransférase dans ce cas) et une pour l'ORF GOI.
   REMARQUE: Nous utilisons généralement une Taq basse fidélité peu coûteuse pour ces réactions. Les conditions de réaction sont telles que décrites dans l'étape 2.1 ci-dessus et contiennent 20 μL SDW, tampon Taq 10x 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, Taq ¹⁴ fait maison, 0,5 μL, Primer A (100 uM) 0,5 μL, Primer B (100 uM ) 0,5 μL, modèle 0,5 μL. Les stocks d'amorces à concentration plus faible (10 μM) peuvent être utilisés également bien.
3. Exécuter un gel d'agarose ( p. Ex. 0,8%) des produits de PCR. Les mutants de deletion produiront la bande Hyg mais pas un produit ORF. Les intégrés ectopiques montreront les deux bandes. Le type sauvage ne produira que la bande ORF.
4. Conserver en permanence les mutants de suppression (et un transformant ectopique ou deux pour les contrôles) pour une utilisation future.
   REMARQUE: 15% de glycerol est utilisé pour sA détruit nos contraintes à long terme à -80 ° C.

Résultats

La méthode OSCAR, dans une seule réaction, génère un plasmide contenant les flancs du gène cible à supprimer entourant la cassette de marque sélectionnable. La production de constructions de suppression utilisant OSCAR est très efficace. Cependant, le système peut produire des constructions partielles contenant certains mais pas les trois fragments (les deux flancs de gènes et le marqueur sélectionnable). Généralement, la majorité des transformants de E. coli conti...

Discussion

La construction en une étape des plasmides prêts à l'emploi d'Agrobacterium-Recombination (OSCAR) a été utilisée avec succès avec un nombre toujours croissant de champignons d'Ascomycota. La méthode devrait également être facilement applicable aux Basidiomycota et aux espèces d'autres phylas fongiques (avec des promoteurs appropriés conduisant des gènes marqueurs sélectionnables), en supposant que la transformation médiée par Agrobacterium et la recombinaison ho...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
FungiDB			Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest	IDT		Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word			Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium			E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium			ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin			Fungal transformant selection
PDA medium	Acumedia	7149A	Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium			Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads	Genlantis	C400100	Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm)	Fisher	09-719-555	Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes			multiple preps
Petri plates (various)			Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR	Addgene	29640	Selectable marker vector
pOSCAR	Addgene	29639	Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells	Life Technologies	12297-016	BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells	Life Technologies	A10460	Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks			Colony streaking
Toothpicks			Colony picking
Microcentrifuge			Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge			Fungal spore collection
Dissecting microscope			Single spore isolation
Automated Cell Counter			Spore suspension calculation
Compound microscope			Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq	Takara Bio USA	RR002A	Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B	InvivoGen	ant-hg-5
Spectinomycin	Sigma	22189-32-8
Cefotaxime	TCI America	C2224
Kanamycin		11815032
Moxalactam	Sigma-Aldrich	43963
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104)
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Thermo Fisher Scientific	11789020	Used to assemble deletion construct in pOSAR