Determinar la frecuencia inhibidora óptima para las células cancerosas Usando Tumor Tratamiento Fields (TTFields)

Resumen

Los campos de tratamiento tumoral (TTFields) son una modalidad eficaz de tratamiento antitumoral administrada mediante la aplicación continua y no invasiva de campos eléctricos alternados de baja intensidad e intermedia. La aplicación de TTFields a líneas celulares usando un sistema de aplicación in vitro TTFields permite la determinación de la frecuencia óptima que conduce a la reducción más alta en el recuento celular.

Resumen

Tumor Tratamiento Fields (TTFields) son una modalidad de tratamiento eficaz entregado a través de la aplicación continua, no invasiva de baja intensidad (1-3 V / cm), campos eléctricos alternos en la gama de frecuencias de varios cientos de kHz. El estudio de TTFields en cultivo de tejidos se lleva a cabo utilizando los TTFields en el sistema de aplicación vitro, que permite la aplicación de campos eléctricos de diferentes frecuencias e intensidades a platos de cerámica de Petri con una constante dieléctrica alta (Ɛ> 5,000). líneas de células cancerosas chapados en cubreobjetos en la parte inferior de los platos de cerámica de Petri se someten a TTFields entregados en dos direcciones ortogonales en varias frecuencias para facilitar las pruebas de resultado del tratamiento, tales como los recuentos de células y ensayos clonogénicos. Los resultados presentados en este informe demuestran que la frecuencia óptima de los TTFields con respecto tanto a los recuentos de células y ensayos clonogénicos es 200 kHz tanto para células de ovario y de glioma.

Introducción

Los campos tratamiento de tumores (TTFields) son una modalidad anti-mitótico para el tratamiento de glioblastoma multiforme y potencialmente otros tipos de cáncer. Los campos se entregan a través de la aplicación continua de baja intensidad (1-3 V / cm), de frecuencia intermedia (100-500 kHz), campos eléctricos alternos a la región del tumor ^{1, 2.} Aplicación TTFields in vitro e in vivo ha demostrado inhibir tanto el crecimiento de diversas líneas de células cancerosas y la progresión de los tumores en varios modelos animales de tumores ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} ensayos clínicos piloto y estudios aleatorios más grandes en pacientes con tumores sólidos, incluyendo glioblastoma y el cáncer de pulmón de células no pequeñas, tienen demonstCalificó la seguridad y la eficacia de la aplicación TTFields continua ^{8 , 9 , 10} . Se encontró que la eficacia de los TTFields era: (1) dependiente de la frecuencia, con frecuencias óptimas específicas que conducían a la reducción más alta en los recuentos celulares de líneas celulares de diferentes orígenes ^{1 , 2 , 4 , 5 , 6 , 7} ; (2) dependiente de la intensidad del campo eléctrico, con un umbral mínimo de actividad de alrededor de 1 V / cm y intensidades más potentes ^{1 , 2 , 7 , 11} ; (3) aumentado cuando la duración del tratamiento era más larga ⁵ ; Y (4) mayor cuando se aplicaron 2 TTFields direccionales perpendicularmente a cada unoEr, en comparación con los campos eléctricos aplicados desde una sola dirección ¹ . Basado en los hallazgos anteriores, los TTFields pueden aplicarse a pacientes durante largos períodos de tiempo utilizando 2 conjuntos de conjuntos de transductores localizados en la piel de los pacientes para maximizar las intensidades del campo eléctrico en el lecho tumoral ^{12 , 13} .

El estudio de los efectos de TTFields sobre células cancerosas in vitro proporciona actualmente la única manera de determinar la frecuencia óptima para aplicar a un tipo de tumor específico. La prueba de la frecuencia óptima requiere un dispositivo que permita la aplicación de diferentes frecuencias en el rango de 100-500 kHz ya intensidades de hasta 3 V / cm de raíz media cuadrada (RMS) al cultivo celular. Como la aplicación de TTFields produce calor, el sistema de aplicación requiere la capacidad de disipar el calor excesivo manteniendo un control estricto sobre la temperatura.

Varios dispositivos fuerone desarrollado a lo largo de los años para permitir la aplicación TTFields a cultivos de células ^{1, 2, 5, 14, 15, 16.} En todos estos dispositivos, los electrodos utilizados fueron aisladas con el fin de evitar las salvedades implicados con el uso de electrodos conductores, como el intercambio de electrones en la superficie del electrodo y la liberación de iones metálicos tóxicos en el medio ^1. La principal diferencia entre los diversos sistemas de aplicación TTFields evaluados es el tipo de aislamiento electrodo utilizado, ya sea con electrodos hechos de hilos metálicos aislados con una película delgada de aislante ^{2, 14, 15, 16} o con un material de alta constante dieléctrica (por ejemplo, magnesio plomo titanat niobato de plomoe (PMN-PT)) ^6. Mientras que los electrodos de alambre aislado ofrecen una solución relativamente simple y rentable para la aplicación TTFields, a menudo son limitados por el alto voltaje requerido para conseguir intensidades de campo eléctrico efectivo por encima del umbral 1 V / cm y por la superficie disponible para el chapado de células, como la distancia entre los electrodos es relativamente pequeño. Los sistemas basados ​​en electrodos aislados utilizando un material de alta constante dieléctrica requieren capacidades de diseño y fabricación especiales, sin embargo, que no requieren alta tensión y pueden ofrecer un área más grande para el crecimiento celular entre los electrodos.

El sistema de aplicación TTFields in vitro utilizado en este trabajo pertenece a la última clase de sistemas, con la unidad de base que es una placa de Petri (plato TTFields, véase la Figura 1) compuesto de alta constante dieléctrica de cerámica (es decir, PMN-PT). Dos pares de electrodos se imprimen perpendicularmente sobre la Wal exteriorls de un plato TTFields para permitir la aplicación de campos eléctricos de 2 direcciones. Los electrodos están conectados a un generador de forma de onda sinusoidal y un amplificador, que permiten la aplicación TTFields en la gama de frecuencias de 50-500 kHz. Con el fin de disipar el exceso de calor, los platos TTFields se mantienen dentro de un incubador refrigerado, con el medio de control de temperatura realizó utilizando la vigilancia constante de la temperatura del plato y ajustes a la tensión aplicada por el sistema. En la práctica, el establecimiento de la incubadora a una temperatura más baja daría lugar a intensidades de campo eléctrico más altos, ya que el sistema aumenta la tensión hasta que se alcanza la temperatura objetivo dentro del plato. La diferencia entre la temperatura dentro del plato y la temperatura de la incubadora puede conducir a una cierta evaporación, en función de los gradientes de temperatura; Por lo tanto, el medio de cultivo tiene que ser reemplazado cada 24 h para mantener condiciones de crecimiento adecuadas.

El protocolo a continuacióndescribe el procedimiento experimental para optimizar la aplicación de las frecuencias TTFields a las células cancerosas de manera que una reducción máxima de recuento de células y una reducción en el potencial de las células supervivientes para formar colonias se consiguen.

Protocolo

1. TTFields Sistema de Aplicación In Vitro - Placa Base y Mantenimiento del Plato

1. Enjuague los platos y las cubiertas del plato con agua corriente del grifo. A continuación, enjuagar con agua desionizada y secar al aire con la cara hacia abajo.
2. Si se ha añadido un agente quimioterapéutico / fármaco a los platos en un experimento anterior, se llena cada plato con una solución de detergente ligero al 5% y se deja durante la noche.
   1. Enjuague bien los platos con agua corriente del grifo para evitar cualquier rastro de detergente dentro del plato. Enjuague los platos y las cubiertas del plato con agua desionizada y enfríe con el aire hacia abajo.
3. Inserte los platos limpios y secos con sus cubiertas en bolsas de esterilización. Sellar y colocar las bolsas en un autoclave, con los platos boca abajo. Autoclave durante 30 minutos a no más de 121 ° C.
4. Ajustar el autoclave en un programa seco, abrir parcialmente la puerta del autoclave y secar los platos durante 30 min.
5. Limpie la placa base con un paño ligeramente humedecido con etanol al 70%.

Configuración 2. Experimento

Nota: Todos los equipos y materiales utilizados en este protocolo se describen en la Lista de materiales. Todos los pasos siguientes se deben realizar dentro de una cabina de flujo laminar, mientras que se mantienen las condiciones estériles.

1. Preparar TTFields limpios y estériles platos y cubiertas, como se describe en la sección 1. limpie la placa de base con un paño ligeramente humedecido con 70% de etanol.
2. Instalar los platos TTFields con las cubiertas sobre la placa base presionando suavemente hacia abajo en el plato y girando en sentido horario en alrededor de 5 mm hasta el borde de las cerraduras de plato en los tres pasadores en la placa base. Colocar un cubreobjetos de 22 mm estéril (plástico o vidrio tratado) en la parte inferior de cada plato.
3. Preparar la suspensión de células en medio de crecimiento completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco para U-87 MG y F98; RPMI para A2780 y OVCAR-3; suplementado como se describe en Lista de materiales).
   NOTA: La CEconcentraciones ll dependen de la duración tipos de células y experimento, el crecimiento celular confluente -90% 80% no debe ser superado por el final del experimento.
   PRECAUCIÓN: Las líneas celulares humanas pueden representar un riesgo biológico y deben ser manejados con las medidas de seguridad apropiadas.
4. Coloque 200 l de suspensión de células (por lo general 5,000-20,000 células en 200 l para un experimento de 72-h, dependiendo del tiempo de duplicación) como una gota en el centro de cada cubreobjetos y cubrir con las tapas de los recipientes.
5. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ hasta que las células se adhieren; una noche de incubación es posible en esta etapa.
6. Aspirar los fluidos de la gota utilizando una pipeta de 200 o 1000-l.
7. pipetear suavemente 2 ml de medio de crecimiento completo para llenar cada plato. Utilice una punta estéril para pipeta y suavemente toque en los bordes cubreobjetos para liberar las burbujas de aire atrapadas de vez en cuando bajo la diapositiva.
8. Cubra los platos con sus tapas y los colocan inside un incubador de _CO2 a 37 ° C hasta el inicio del tratamiento TTFields.

3. Aplicación TTFields

1. Transferir las placas de base con los platos TTFields unidos a un refrigerado CO ₂ incubadora.
   NOTA: In vitro aplicación TTFields generará calor; Por lo tanto, se requiere una incubadora refrigerada para compensar el calentamiento de los platos. Más altas intensidades TTFields producirán más calor y requieren temperaturas ambiente inferior incubadora (véase la Tabla 1). Clínicamente TTFields pertinentes intensidades se consiguen cuando la temperatura de la incubadora para su aplicación TTFields está en el intervalo de 18-30 ° C.
2. Conectar el conector del cable de la hembra plana a la placa base. Conmutar el generador de campos TTF sucesivamente.
3. Iniciar los campos TTF en el software de sistema de aplicación in vitro y seleccionar la configuración del experimento.
   1. Definir un nuevo experimento. Escriba el nombre de la experiment y el propietario experimento en la interfaz de usuario del software en la pantalla del ordenador. Ajustar la frecuencia y la temperatura objetivo para cada placa plato o base.
4. Iniciar la aplicación TTFields uso del software.
5. Verificar que todos los platos están conectados correctamente y aparecen de color azul claro en el monitor. Si un plato es un círculo con un marco rojo (lo que significa que no está conectado correctamente), presione suavemente hacia abajo y gire lentamente hacia atrás y adelante hasta que los contactos se restauran y el plato aparece de color azul claro.
6. Dejar los TTFields en el sistema de aplicación vitro que se ejecutan durante un máximo de 24 h.
7. Si el experimento llega a su punto final, detener el experimento haciendo clic en el botón FIN Experimento en el software y vaya al paso 5. En caso contrario, haga clic en el experimento PAUSA.
8. Desconectar el conector del cable plano de la placa base. Retire la placa base con los platos de la incubadora en una cabina de flujo laminar.
9. Vuelva a colocar el medio en todo el platoes cada 24 h y devolver la placa de base a la incubadora refrigerada. Conectar la placa base al generador usando el cable plano. Continuar con el experimento haciendo clic en el botón CONTINUAR.

4. Muestras de Control

Nota: Se cultivan las células de control en condiciones similares a las células tratadas con TTFields, con exclusión de aplicación TTFields.

1. muestras de control de placa con la misma suspensión y en una superficie similar utilizado para el recubrimiento de muestras tratadas con TTFields.
2. Coloque platos de control en un incubador de _CO2 a 37 ° C.
3. Reemplazar el medio en los platos cada 24 h para que coincida con las condiciones de medio plato tratados con TTFields.

Fin 5. Experimento

1. Después de hacer clic en Experimento FIN, esperar a que el software para recuperar todos los registros del sistema y para guardar los registros en la computadora.
2. Utilice el botón Reports para revisar la temperatura, corriente y resistencia registro files de cada placa de base para comprobar que todos los platos fueron tratados de acuerdo con el plan experimental.
   NOTA: Todos los informes y registros se guardan en el equipo después del final del experimento y pueden ser revisados en cualquier momento.
3. Desconectar el generador de campos TTF.
4. Desconectar el cable plano de la placa base y retirar de la incubadora.
5. Para quitar un plato de cerámica, presione hacia abajo y girar el plato en sentido antihorario para desbloquearlo de la placa base.
6. Tomar los platos en una cabina de flujo laminar y asépticamente retirar los cubreobjetos. Transferirlos a estériles placas de Petri que contienen solución salina medio fresco o tamponada con fosfato (PBS) para continuar la inspección y evaluación.

6. Evaluación del efecto de los campos TTF

NOTA: efectos TTFields' se pueden determinar de varias maneras. Utilice uno o más de los métodos siguientes para comparar las células tratadas con las células control no tratadas:

1. Conteo de células
   1. Eliminar el medio / PBS de cada plato que contiene cubreobjetos.
   2. Añadir 0,5 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a cada placa y se incuba durante un máximo de 10 min (es decir, hasta que las células comienzan a desprenderse de la superficie de cubreobjetos) a 37 ° C en una incubadora de CO _2.
   3. Añadir 0,5 ml de medio de crecimiento completo para neutralizar la tripsina y volver a suspender las células pipeteando suavemente arriba y abajo.
   4. Contar las células utilizando cualquier técnica de recuento de células estándar que es compatible con contando concentraciones de células bajos (es decir, alrededor de 20 000 células / ml).
2. ensayo clonogénico
   1. Placa de un número similar de células (100-500 células por placa) de cada plato en nuevos, placas de Petri estériles o placas de 6 pocillos que contenían 2 ml de medio de crecimiento completo fresco.
   2. Incubar en una incubadora de _CO2 a 37 ° C durante 1-3 semanas (dependiendo de las propiedades de cada línea celular) hasta que las colonias que constan de ~ 50 se forman células. Evaluar la célulanúmero por colonia por microscopía de luz.
   3. Retirar el medio y aclarar con PBS.
   4. Retire el PBS y añadir metanol enfriado con hielo (1 ml). Incubar a -20 ° C durante 10 min o más.
   5. Eliminar el metanol.
   6. Añadir solución de cristal violeta (0,1% w / v en 25% v / v de metanol en agua) y se incuba durante 20 min.
      PRECAUCIÓN: Cristal violeta es un carcinógeno potencial; utilizar guantes mientras se trabaja con cristal violeta.
   7. Retire el cristal violeta, se lava 3 veces con agua desionizada y se seca al aire.
   8. Contar las colonias formadas en cada plato.

Resultados

Los resultados después de la aplicación de TTFields al escanear diferentes frecuencias pueden cuantificarse basándose en ensayos diferentes, tales como recuentos celulares, ensayos colorimétricos, ensayos clonogénicos y exámenes sobre los cambios en el número de células invasoras usando una cámara Boyden situada dentro de un TTFields especial de pared alta Plato de cultivo celular. Una planificación experimental cuidadosa basada en tiempos de duplicación de células predeterminados permitirá que las células alcancen el número máximo de eventos mitóticos durante la duración del tratamiento, maximizando así los resultados del tratamiento.

La Figura 2 ilustra un resultado de exploración de frecuencia típico para un recuento de células promedio ( es decir, el número de células) y el ensayo clonogénico de A2780 ( es decir, células de cáncer de ovario humano, Figura 2A ) ⁷ y F-98 ( es decir, células de glioma de rata;"> Figura 2B) ¹ trata con dos TTFields direccionales (gama de frecuencia: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm, y temperatura de la incubadora:. 18 ° C) Los resultados demuestran una reducción significativa en los recuentos de células en todas las frecuencias aplica , con la reducción máxima a 200 kHz para todas las líneas celulares ensayadas (ANOVA de una vía con comparación múltiple). la frecuencia óptima conduce a la mayor reducción en el potencial clonogénico fue el mismo para ambas células A2780 y F98 (Figuras 2B y C) . el coeficiente de correlación de Pearson entre el número de células y el efecto clonogénico en cada frecuencia era 0,967 (p = 0,002) y 0,755 (p = 0,083) para A2780 y F98, respectivamente.

La Figura 3 demuestra un resultado de barrido de frecuencia para el conteo de células promedio para OVCAR-3 (es decir, células de cáncer de ovario humano; figura 3A) y U-87 MG (es decir, células de glioma humano; Figura 3B) células tratadas con dos direcciones de TTFields a diferentes intensidades (RMS: 1.7, 1.3, y 1.0 V / cm, respectivamente, y temperatura de la incubadora: 18 ° C, 24 ° C, y 28 ° C, respectivamente). Los resultados demuestran que mientras que todavía hay una reducción significativa en OVCAR-3 recuento de células después del tratamiento con TTFields 1,3-V / cm (temperatura de la incubadora: 24 ° C), el efecto es relativamente pequeño en comparación con los resultados obtenidos cuando las células fueron tratadas con 1,7 V / cm (temperatura de la incubadora: 18 ° C). las células U-87 MG tratados con TTFields 1,0-V / cm (temperatura de la incubadora: 28 ° C) también demuestran una tendencia similar en la reducción del número de células como cuando se tratan con 1,7 V / cm, sin embargo, el efecto no fue significativo a intensidades inferiores .

figurE 1 . Los platos TTFields se instalaron en una unidad de placa de base y se conectaron al cable de control TTFields plano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Las exploraciones de frecuencia para la determinación de la frecuencia inhibitoria TTFields óptima para las células (A) A2780 y (B) F98. Las células se trataron durante 72 h con TTFields de diferentes frecuencias (1,7 V / cm y 100-500 kHz). El efecto del tratamiento con TTFields se estimó utilizando el recuento celular y los ensayos clonogénicos. La flecha indica la frecuencia óptima. Los resultados representan promedios ± DE basados ​​en al menos 6 repeticiones para cada frecuencia ensayada. ( C ) Imágenes representativas del clonogénico s urvival de células A2780 después del tratamiento TTFields a varias frecuencias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Exploraciones de frecuencia para la determinación de la frecuencia inhibidora TTFields óptimas para (A) OVCAR-3 y (b) U-87 células de Mg. Las células fueron tratadas durante 72 h con TTFields de diferentes frecuencias (100-500 kHz) e intensidades (OVCAR-3: 1,3 y 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 y 1,7 V / cm). El efecto del tratamiento con campos TTF se estimó mediante el recuento de células. La flecha indica la frecuencia óptima. Los resultados representan las medias ± SD a base de al menos 6 repeticiones en cada frecuencia de prueba.pg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Incubadora temperatura ambiente	TTFields esperados intensidades
(DO)	(RMS V / cm)
18	1.62
19	1.55
20	1.48
21	1.41
22	1.33
23	1.26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0.97
28	0.9
29	0.83
30	0,76

Tabla 1. Incubadora temperatura ambiente y espera intensidades TTFields dentro del plato TTFields.

Discusión

TTFields son una modalidad anti-tumor emergente basado en la aplicación continua de campos eléctricos alternos correctamente sintonizado ^{1, 2, 8, 9, 10, 17.} Maximizar la eficacia anti-tumoral es un resultado deseable para todas las modalidades de tratamiento. Por lo tanto, la "lucha" por cada por ciento adicional de la inhibición del crecimiento de células cancerosas puede tener un efecto significativo en el resultado clínico a largo plazo para los pacientes. Esto es debido a la naturaleza continua requerida de aplicación TTFields y el efecto acumulativo resultante. Maximizar la aplicación TTFields puede lograrse de varias maneras: (1) el aumento de la intensidad del campo eléctrico ^{1, 7,} (2) la duración del tratamiento alargamiento ^5, (3) la búsqueda de la combinati más eficazcon otras modalidades de tratamiento ^{18, 19,} y (4) que define la frecuencia óptima ^{1, 2, 4, 6, 7.} Maximizar la intensidad de campo eléctrico en el sitio del tumor se consigue mediante la optimización de la localización de las matrices en la piel del paciente; esto permite la entrega de la intensidad de campo máxima en el tumor basado en la anatomía individual del paciente ^20. Alargar la duración del tratamiento se basa principalmente en el cumplimiento del paciente con el tratamiento (durante al menos 18 h por día) ^17. Encontrar la combinación adecuada con otras terapias y determinar la frecuencia óptima depende en gran medida los resultados in vitro, ya que no hay marcadores validados para los resultados del tratamiento TTFields están disponibles actualmente. En este trabajo, hemos esbozado la p experimentalPROCEDIMIENTOS necesarios para determinar la frecuencia óptima TTFields para líneas de células cancerosas que utilizan el sistema TTFields in vitro aplicación. Los métodos descritos aquí pueden usarse potencialmente para detectar la combinación de otras modalidades de tratamiento del cáncer (por ejemplo, agentes de quimioterapia o irradiación) con TTFields y para determinar la frecuencia óptima para la administración TTFields para cada tratamiento combinado específico.

En línea con las publicaciones anteriores, los resultados mostrados aquí demuestran que la frecuencia óptima para el tratamiento tanto de células de glioma y células de cáncer de ovario es 200 kHz ^{1, 7.} En este trabajo, hemos demostrado por primera vez que la frecuencia óptima TTFields para reducir el potencial clonogénico se asocia con la frecuencia que conduce al efecto máximo citotóxica. Los métodos utilizados en este trabajo para cuantificar los efectos de los campos TTF (es decir, citotóxicos y clonogénico) unare sólo dos de muchos ensayos de punto final estándar posibles para evaluar los resultados del tratamiento. pruebas de resultado de tratamiento adicionales incluyen: (1) de fijación, tinción y montaje de los cubreobjetos en los que se sembraron las células en un microscopio para la visualización de las estructuras intracelulares; (2) la realización de ensayos de extractos de proteínas y ARN, ya sea desde los platos TTFields sí mismos o después de transferir el cubreobjetos a un nuevo plato desechable; y (3) tripsinización células teñidas para citometría de flujo análisis.

la planificación cuidadosa experimental tendrá un impacto en los resultados del tratamiento después de la entrega de los campos TTF. Los pasos clave incluyen asegurar que la proliferación de células durante todo el experimento no conduce al crecimiento excesivo y el uso de la intensidad de campo eléctrico apropiado, como intensidades que son demasiado altos cuando se aplica a las líneas celulares sensibles resultará en demasiado pocas células para los ensayos requeridos para determinar la frecuencia óptima. Por el contrario, los campos TTF aplica a intensidades muy bajasEn las líneas celulares menos sensibles resultará en pequeños efectos que pueden ser enmascarados por la variación inherente. Los registros de tratamiento deben ser examinados para obtener información valiosa sobre la estabilidad de temperatura, corrientes eléctricas y resistencia para cada plato a lo largo del experimento. El reemplazo de platos defectuosos al inicio del tratamiento y la exclusión de los datos de un plato que no cumplía los parámetros de tratamiento deseables minimizarán la variabilidad entre las repeticiones.

En resumen, los TTFields son una modalidad de tratamiento anticancerígeno emergente que ya ha demostrado eficacia y seguridad en situaciones clínicas ^{8 , 9 , 10} . El ensayo de TTFields en un ajuste in vitro utilizando los protocolos descritos aquí puede permitir la optimización de los parámetros de tratamiento TTFields en el entorno clínico y puede ampliar nuestra comprensión del mecanismo de acción subyacente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
inovitro system and software	Novocure	ITG1000 and IBP1000	Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.
Sterilization bags	Westfield medical	24882
Plastic cover slides	Thermo Scientific (NUNC)	174977	Pre treated and sterilized
Glass cover slides	Thermo Scientific (Menzel-Gläser)	CB00220RA1	Sterilize if necessary
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Biological Industries (Israel)	01-055-1A	Warm in 37 °C water bath before use
RPMI 1640	Gibco	21875-034	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries (Israel)	04-007-1A	Warm in 37 °C water bath before use
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
Pen/Strep (10,000 U/mL Penicillin, 10,000 µg/mL Streptomycin)	Gibco	15140-122
Sodium Pyruvate solution 100 mM	Biological Industries (Israel)	03-042-1B
Hepes buffer 1 M	Biological Industries (Israel)	03-025-1B
Insuline solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries (Israel)	03-050-1B	Warm in 37 °C water bath before use
Methanol	Merck	1.06009.2511	Cool to -20 °C in the freezer before use
Crystal violet	Sigma-Aldrich	120M1445	Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.
Light detergent	Alcononx	242985	Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions.
PBS	Biological Industries (Israel)	02-023-1A	Without calcium and magnesium
A2780	ECACC	93112519	Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12 mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2 mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insulin (10 µg/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2 mM).
refrigirated CO2 incubator	CARON	7404-10-3
Laminar flow cabinet	ADS Laminair	Bio12 and VSM12