Determinare la frequenza inibitorio ottimale per le cellule cancerose del tumore Uso Trattare Fields (TTFields)

Riepilogo

Trattare tumorali Fields (TTFields) sono un efficace modalità di trattamento antitumorale consegnato tramite la continua applicazione non invasiva di bassa intensità, frequenza intermedia, campi elettrici alternati. Applicazione TTFields alle linee di cellule utilizzando un sistema in vitro domanda TTFields consente la determinazione della frequenza ottimale che porta alla maggiore riduzione del numero di cellule.

Abstract

Tumore Trattamento Fields (TTFields) sono un efficace modalità di trattamento forniti tramite la continua applicazione non invasiva di bassa intensità (1-3 V / cm), campi elettrici alternati nella gamma di frequenza di diverse centinaia di kHz. Lo studio di TTFields nella coltura del tessuto viene effettuata utilizzando i TTFields nel sistema di applicazione vitro, che consente l'applicazione di campi elettrici di diversa frequenze ed intensità ai piatti ceramici Petri con un'alta costante dielettrica (Ɛ> 5000). linee cellulari cancerose placcato su vetrini in fondo dei piatti ceramici Petri sono sottoposti a TTFields consegnati in due direzioni ortogonali alle varie frequenze per facilitare prove esito del trattamento, come i conteggi cellulari e prove clonogeniche. I risultati presentati in questo rapporto dimostrano che la frequenza ottimale delle TTFields rispetto a entrambi i fronti cellulari e prove clonogeniche è di 200 kHz per entrambe le celle ovariche e glioma.

Introduzione

I campi di trattamento tumorali (TTFields) sono una modalità anti-mitotica per il trattamento di glioblastoma multiforme e potenzialmente di altri tipi di cancro. I campi vengono erogati mediante l'applicazione continua di campi elettrici alternati a bassa intensità (1-3 V / cm), frequenze intermedie (100-500 kHz) alla regione del tumore ^{1 , 2} . L'applicazione di TTFields in vitro e in vivo ha dimostrato di inibire sia la crescita di varie linee cellulari cancerose sia la progressione dei tumori in diversi modelli tumorali animali ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . Studi clinici piloti e studi randomizzati su pazienti con tumori solidi, inclusi glioblastoma e cancro polmonare non a piccole cellule, hanno dimostratovalutato la sicurezza e l'efficacia di applicazione continua TTFields ^{8, 9, 10.} L'efficacia dei TTFields è risultata essere: (1) in funzione della frequenza, con specifiche frequenze ottimali portano alla massima riduzione dei conteggi delle cellule di linee cellulari di diversa origine ^{1, 2, 4, 5, 6, 7;} (2) campo elettrico di intensità-dipendente, con una soglia minima per l'attività a circa 1 V / cm e più potenti intensità superiori ^{1, 2, 7, 11;} (3) aumentata quando la durata del trattamento è stata più lunga ^5; e (4) maggiore quando sono stati applicati 2 TTFields direzionali perpendicolarmente tra OTHEr, rispetto ai campi elettrici applicati da una sola direzione ¹ . Sulla base dei risultati di cui sopra, TTFields può essere applicato ai pazienti per lunghe durate utilizzando 2 set di matrici di trasduttori localizzati sulla pelle dei pazienti per massimizzare le intensità di campo elettrico nel letto tumorale ^{12 , 13} .

Studiare gli effetti di TTFields sulle cellule cancerose in vitro attualmente fornisce l'unico modo per determinare la frequenza ottimale da applicare a un tipo specifico del tumore. Il test per la frequenza ottimale richiede un dispositivo che consente l'applicazione di diverse frequenze nell'intervallo 100-500 kHz ea intensità fino a 3 V / cm quadrato medio radicale (RMS) alla coltura cellulare. Poiché l'applicazione TTFields produce calore, il sistema di applicazione richiede la capacità di dissipare il calore eccessivo pur mantenendo un controllo stretto sulla temperatura.

Diversi dispositivi sono statie sviluppato negli anni per consentire l'applicazione TTFields per colture cellulari ^{1, 2, 5, 14, 15, 16.} In tutti questi dispositivi, gli elettrodi utilizzati sono stati isolati per evitare gli avvertimenti insiti nell'uso di elettrodi conduttivi, come lo scambio di elettroni sulla superficie dell'elettrodo e il rilascio di ioni metallici tossici nel mezzo ^1. La differenza principale tra i vari sistemi applicativi TTFields testati è il tipo di isolamento elettrodo utilizzato, sia con elettrodi in fili metallici isolati con un film sottile di isolante ^{2, 14, 15, 16,} oppure con un materiale ad alta costante dielettrica (per esempio, piombo magnesio niobato piombo titanate (PMN-PT)) ^6. Mentre gli elettrodi conduttori isolati offrono una soluzione relativamente semplice e conveniente per applicazioni TTFields, sono spesso limitati dalla alta tensione necessaria per ottenere efficaci intensità di campo elettrico sopra la soglia / 1 V cm e dalla superficie disponibile per la placcatura cellule, come la distanza tra gli elettrodi è relativamente piccolo. I sistemi basati su elettrodi isolati con un materiale ad alta costante dielettrica richiedono capacità di progettazione e di fabbricazione speciali, ma non richiedono alta tensione e può offrire una superficie maggiore per la crescita cellulare tra gli elettrodi.

Il sistema in vitro applicazione TTFields utilizzato in questo lavoro appartiene a quest'ultima classe di sistemi, con l'unità centrale essendo una piastra di Petri (piatto TTFields, vedi Figura 1), composta alta costante dielettrica ceramica (cioè, PMN-PT). Due coppie di elettrodi sono stampati perpendicolarmente sul wal esternols di un piatto TTFields per consentire l'applicazione di campi elettrici da 2 direzioni. Gli elettrodi sono collegati ad un generatore di forma d'onda sinusoidale ed un amplificatore, che consentono di applicazione TTFields nella gamma di frequenza di 50-500 kHz. Per dissipare il calore eccessivo, i piatti TTFields sono mantenute all'interno di un incubatore refrigerato, con il controllo della temperatura media effettuata utilizzando costante monitoraggio della temperatura piatto e regolazioni alla tensione applicata dal sistema. In pratica, impostando l'incubatore a una temperatura più bassa porterebbe a maggiori intensità di campo elettrico, come il sistema aumenta la tensione fino al raggiungimento della temperatura desiderata all'interno del piatto. La differenza tra la temperatura all'interno del piatto e la temperatura dell'incubatrice può portare a qualche evaporazione, a seconda delle gradienti di temperatura; quindi, il terreno di coltura deve essere sostituito ogni 24 ore per mantenere condizioni di crescita adeguate.

Il protocollo di seguitoDescrive la procedura sperimentale per ottimizzare l'applicazione delle frequenze TTFields alle cellule cancerose in modo da ottenere una riduzione massima del numero di cellule e una riduzione del potenziale delle cellule sopravviventi a formare colonie.

Protocollo

1. TTFields sistema in vitro Applicazione - piastra di base e di manutenzione del piatto

1. Lavare piatti e coperchi piatto sotto acqua corrente. Quindi risciacquare con acqua deionizzata e asciugare faccia in giù.
2. Se un agente chemioterapico / farmaco è stato aggiunto a piatti in un esperimento preliminare, riempire ciascun piatto con una leggera soluzione detergente 5% e lasciare per una notte.
   1. Lavare le stoviglie accuratamente sotto acqua corrente per evitare eventuali tracce di detergente all'interno del piatto. Lavare i piatti e piatto copre con acqua deionizzata e faccia asciugare giù.
3. Inserire i piatti puliti e asciutti con le loro coperture in sacchetti di sterilizzazione. Sigillare e posizionare i sacchetti in autoclave, con i piatti a faccia in giù. Autoclave per 30 minuti a non superiore a 121 ° C.
4. Impostare l'autoclave su un programma asciutto, parzialmente aprire la porta autoclave, e asciugare le stoviglie per 30 min.
5. Pulire la piastra di base con un panno leggermente inumidito con etanolo al 70%.

Setup 2. Esperimento

NOTA: Tutte le attrezzature ed i materiali utilizzati in questo protocollo sono descritti nella Lista dei materiali. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguite all'interno di una cappa a flusso laminare mentre condizioni sterili vengono mantenute.

1. Preparare TTFields pulito e sterile piatti e coperchi, come descritto nella sezione 1. Pulire la piastra di base con un panno leggermente inumidito con etanolo al 70%.
2. Installare i piatti TTFields con i coperchi sulla piastra di base premendo delicatamente sul piatto e ruotando in senso orario di circa 5 mm, fino al bordo delle serrature piatto sui tre perni sulla piastra di base. Posizionare una sterile 22 mm coprioggetto (plastica trattata o vetro) sul fondo di ogni piatto.
3. Preparare la sospensione di cellule in mezzo di crescita completo (modificata mezzo di Dulbecco Eagle U-87 MG e F98; RPMI per A2780 e OVCAR-3; integrato come descritto nella Lista dei materiali).
   NOTA: il cell concentrazioni dipendono dal tipi cellulari e sperimentare durata, 80% di crescita delle cellule confluenti -90% non dovrebbe essere superata dalla fine dell'esperimento.
   ATTENZIONE: linee cellulari umane possono rappresentare un pericolo biologico e deve essere maneggiato con le opportune misure di sicurezza.
4. Posizionare 200 ml di sospensione cellulare (solitamente 5,000-20,000 cellule in 200 microlitri per un esperimento di 72 ore, a seconda del tempo di raddoppio) come una goccia nel centro di ogni vetrino e coprire con i coperchi piatto.
5. Incubare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ finché le cellule aderiscono; una notte di incubazione è possibile in questa fase.
6. Aspirare i fluidi dal menu con una pipetta 200- o da 1.000 ml.
7. Pipettare delicatamente 2 mL di terreno di coltura completo per riempire ogni piatto. Utilizzare una punta sterile per pipetta e dolcemente toccare sui bordi coprioggetto per rilasciare le bolle d'aria occasionalmente catturati sotto la diapositiva.
8. Coprire i piatti con i loro coperchi e metterli inside un incubatore CO ₂ a 37 ° C fino all'inizio del trattamento TTFields.

3. Applicazione TTFields

1. Trasferire le piastre di base con i piatti allegate TTFields ad un refrigerato CO ₂ incubatore.
   NOTA: In vitro applicazione TTFields genera calore; pertanto, un incubatore refrigerato è necessaria per compensare il riscaldamento dei piatti. Maggiori TTFields intensità produrranno più calore e richiederanno inferiore incubatore temperatura ambiente (vedi Tabella 1). Clinicamente rilevanti TTFields intensità si ottengono quando la temperatura incubatore per applicazione TTFields è nell'intervallo di 18-30 ° C.
2. Collegare il connettore del cavo femmina piatto alla piastra di base. Passare il generatore TTFields su.
3. Avviare i TTFields nel software di sistema di applicazione vitro e selezionare le impostazioni dell'esperimento.
   1. Definire un nuovo esperimento. Digitare il nome del experiment e il proprietario esperimento nell'interfaccia utente del software sullo schermo del computer. Regolare la frequenza e temperatura obiettivo per ciascuna piastra piatto o di base.
4. Avviare l'applicazione TTFields utilizzando il software.
5. Verificare che tutti i piatti sono collegati correttamente e appaiono luce blu sul monitor. Se un piatto è cerchiato con una cornice rossa (cioè non è collegato correttamente), premere leggermente e ruotare lentamente avanti e indietro finché i contatti vengono ripristinate e il piatto appare azzurro.
6. Lasciare le TTFields nel sistema di applicazione vitro in esecuzione per un massimo di 24 ore.
7. Se l'esperimento raggiunge il suo punto finale, interrompere l'esperimento facendo clic sul pulsante di ESPERIMENTO END nel software e passare al punto 5. In caso contrario, cliccare su esperimento PAUSE.
8. Scollegare il connettore del cavo piatto dalla piastra di base. Rimuovere la piastra di base con i piatti dal termostato in una cappa a flusso laminare.
9. Sostituire il mezzo in ciascuno piattoes ogni 24 ore e tornare la piastra di base per l'incubatore refrigerato. Collegare la piastra base al generatore tramite il cavo piatto. Continuare l'esperimento facendo clic sul pulsante CONTINUA.

4. I campioni di controllo

Nota: Crescere le cellule di controllo in condizioni simili alle cellule TTFields-trattati, ad esclusione dell'applicazione TTFields.

1. campioni di controllo piatto con la stessa sospensione e su una superficie simile utilizzato per la placcatura di campioni TTFields trattati.
2. Posizionare piatti di controllo in un incubatore CO ₂ a 37 ° C.
3. Sostituire il mezzo nei piatti ogni 24 ore per corrispondere alle condizioni medie piatto TTFields trattati.

5. Esperimento End

1. Dopo aver cliccato su di fine dell'esperimento, attendere che il software per recuperare tutti i record dal sistema e di salvare gli atti al computer.
2. Utilizzare il pulsante REPORT di rivedere la temperatura, la corrente, e resistenza log files di ciascuna piastra di base per verificare che tutti i piatti sono stati trattati secondo il piano sperimentale.
   NOTA: Tutte le relazioni ei registri sono salvati sul computer dopo la fine dell'esperimento e possono essere rivisti in qualsiasi momento.
3. Spegnere il generatore TTFields.
4. Scollegare il cavo piatto dalla piastra di base e rimuovere dal termostato.
5. Per rimuovere un piatto di ceramica, premere e ruotare il piatto in senso antiorario per sbloccarlo dalla piastra di base.
6. Prendete i piatti in una cappa a flusso laminare e rimuovere in maniera asettica i coprioggetti. Trasferirli allo sterile piastre Petri contenenti salina mezzo fresco o tamponata con fosfato (PBS) per ulteriori controllo e valutazione.

6. Valutazione degli effetti di TTFields

NOTA: Gli effetti TTFields' può essere determinato in diversi modi. Utilizzare uno o più dei seguenti metodi per confrontare cellule trattate alle cellule di controllo non trattate:

1. conta delle cellule
   1. Rimuovere il mezzo / PBS per ogni piatto coprioggetto contenenti.
   2. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina / EDTA per ogni piatto e incubare fino a 10 min (cioè, fino a quando le cellule iniziano a staccarsi dalla superficie coprioggetto) a 37 ° C in un incubatore CO _2.
   3. Aggiungere 0,5 ml di mezzo di crescita completa per neutralizzare la tripsina e risospendere le cellule pipettando gentilmente su e giù.
   4. Contare le cellule utilizzando qualsiasi tecnica conta cellulare standard che è compatibile con il conteggio basse concentrazioni di cellule (ad esempio, circa 20.000 cellule / ml).
2. clonogenica
   1. Placcare un numero simile di cellule (100-500 cellule per piastra) da ogni piatto su nuove, piastre di Petri sterili o 6 pozzetti contenenti 2 ml di terreno di coltura completo fresco.
   2. Incubare in un incubatore CO ₂ a 37 ° C per 1-3 settimane (a seconda delle caratteristiche di ciascuna linea cellulare) fino colonie compresi di ~ 50 cellule sono formate. Valutare la cellanumero per colonia al microscopio ottico.
   3. Rimuovere il supporto e lavare con PBS.
   4. Rimuovere il PBS e aggiungere metanolo ghiacciato (1 mL). Incubare a -20 ° C per 10 minuti o più.
   5. Rimuovere il metanolo.
   6. Aggiungere la soluzione al cristalvioletto (0.1% w / v in 25% v / v di metanolo in acqua) e incubare per 20 min.
      ATTENZIONE: cristallo viola è un potenziale cancerogeno; utilizzare guanti durante il lavoro con cristalvioletto.
   7. Rimuovere il cristalvioletto, lavare 3 volte con acqua deionizzata e asciugare all'aria.
   8. Contare le colonie formate in ogni piatto.

Risultati

Risultati dopo applicazione TTFields durante la scansione diverse frequenze possono essere quantificati in base a diversi dosaggi, come i conteggi delle cellule, saggi colorimetrici, prove clonogeniche, ed esami sulle variazioni nel numero di cellule che invadono utilizzando una camera di Boyden collocato all'interno di un apposito TTFields alta parete coltura cellulare piatto. Pianificazione accurata sperimentazione, basata sui tempi di cella raddoppio predeterminati consentirà alle cellule di raggiungere il numero massimo di eventi mitotici durante la durata del trattamento, massimizzando così i risultati del trattamento.

La figura 2 illustra un esito tipica scansione di frequenza per un conta cellulare media (cioè numero di cellule) e clonogenica di A2780 (cioè, le cellule tumorali ovariche umane; la figura 2A) ⁷ e F-98 (cioè, cellule di glioma di ratto;"> Figura 2B) ¹ trattato con due TTFields direzionali (gamma di frequenza: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm e temperatura incubatrice: 18 ° C) .I risultati mostrano una significativa riduzione dei conteggi delle cellule a tutte le frequenze applicate , Con la riduzione massima a 200 kHz per tutte le linee cellulari testate (ANOVA a senso unico con confronto multiplo) La frequenza ottimale che porta alla più alta riduzione del potenziale clonogenico era la stessa per le cellule A2780 e F98 ( figure 2B e C ) Il coefficiente di correlazione di Pearson tra il numero di cellule e l'effetto clonogenico ad ogni frequenza era rispettivamente di 0.967 (p = 0.002) e 0.755 (p = 0.083) rispettivamente per A2780 e F98.

La figura 3 mostra un esito di scansione di frequenza per il conteggio medio delle cellule per OVCAR-3 ( ovvero cellule tumorali ovariche umane, Figura 3A ) e U-87 MG (cioè, cellule di glioma umano; Figura 3B), le cellule trattate con due direzioni di TTFields a diverse intensità (RMS: 1.7, 1.3 e 1.0 V / cm, rispettivamente e temperatura dell'incubatrice: 18 ° C, 24 ° C e 28 ° C, rispettivamente). I risultati dimostrano che, mentre v'è ancora una significativa riduzione della conta di cellule OVCAR-3 dopo il trattamento con / cm TTFields 1.3-V (temperatura dell'incubatrice: 24 ° C), l'effetto è relativamente piccolo rispetto ai risultati ottenuti quando sono stati trattati cellule con V / cm 1,7 (temperatura dell'incubatrice: 18 ° C). cellule U-87 MG trattati con / cm TTFields 1,0-V (temperatura dell'incubatrice: 28 ° C) anche dimostrare una tendenza simile nella riduzione del numero di cellule, come quando vengono trattati con 1,7 V / cm, ma l'effetto non era significativo a bassa intensità .

figure 1. Piatti TTFields stati installati su un'unità di piastra di base e collegati al cavo di controllo TTFields piatto. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Scansioni di frequenza per la determinazione della frequenza ottimale TTFields inibitoria per le cellule (A) A2780 e (B) F98. Le cellule sono state trattate per 72 ore con TTFields di frequenze diverse (1,7 V / cm e 100-500 kHz). L'effetto del trattamento è stato stimato utilizzando TTFields numero di celle e prove clonogeniche. La freccia indica la frequenza ottimale. I risultati rappresentano medie ± SD sulla base di almeno 6 repliche per ogni frequenza testate. (C) Immagini rappresentative della s clonogenica Urvival delle cellule A2780 dopo il trattamento TTFields a varie frequenze. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Scansioni di frequenza per la determinazione della frequenza inibitoria ottimale di TTFields per le cellule (A) OVCAR-3 e (B) U-87 MG. Le cellule sono state trattate per 72 h con TTFields di diverse frequenze (100-500 kHz) e intensità (OVCAR-3: 1,3 e 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 e 1,7 V / cm). L'effetto del trattamento con TTFields è stato stimato utilizzando i conteggi delle cellule. La freccia indica la frequenza ottimale. I risultati rappresentano le medie ± SD basate su almeno 6 repliche in ogni frequenza testata.pg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Incubatore temperatura ambiente	Attesi TTFields intensità
(° C)	(RMS V / cm)
18	1.62
19	1.55
20	1.48
21	1.41
22	1.33
23	1.26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0.97
28	0.9
29	0.83
30	0.76

Tabella 1. Temperatura ambiente incubatore e intensità TTFields previste all'interno del piatto TTFields.

Discussione

TTFields sono una modalità antitumorale emergente basata sulla applicazione continua di sintonizzata alternati campi elettrici ^{1, 2, 8, 9, 10, 17.} Massimizzando l'efficacia anti-tumorale è un risultato auspicabile per tutte le modalità di trattamento. Così, "combattere" per ogni cento aggiuntivo di inibizione della crescita delle cellule cancerose può avere un effetto significativo sul risultato clinico a lungo termine per i pazienti. Questo è a causa della natura continua richiesta di applicazione TTFields e l'effetto cumulativo risultante. Massimizzando applicazione TTFields può essere realizzato in diversi modi: (1) aumentare l'intensità del campo elettrico ^{1, 7,} (2) durata del trattamento allungamento ^5, (3) trovare il Combinati più efficaceavanti con altre modalità di trattamento ^{18, 19,} e (4) definente la frequenza ottimale ^{1, 2, 4, 6, 7.} Massimizzare l'intensità di campo elettrico nella sede del tumore è ottenuta ottimizzando la posizione delle matrici sulla pelle del paziente; questo permette di erogare dell'intensità del campo massimo al tumore sulla base dell'anatomia individuale del paziente ^20. Allungando la durata del trattamento si basa principalmente sulla compliance del paziente al trattamento (per almeno 18 ore al giorno) ^17. Trovare la giusta combinazione con altre terapie e determinare la frequenza ottimale si basa fortemente su risultati in vitro, come marcatori convalidati per i risultati del trattamento TTFields sono attualmente disponibili. In questo lavoro, abbiamo delineato il p sperimentaleROCEDURE necessari per determinare la frequenza ottimale TTFields per linee cellulari cancerose utilizzando il sistema in vitro applicazione TTFields. I metodi qui descritti possono essere sfruttati per schermare la combinazione di altre modalità di trattamento del cancro (per esempio, agenti chemioterapici o irraggiamento) con TTFields e per determinare la frequenza ottimale per la somministrazione TTFields per ogni trattamento combinato specifico.

In linea con le pubblicazioni precedenti, i risultati mostrati qui dimostrano che la frequenza ottimale per il trattamento sia delle cellule di glioma e cellule tumorali ovariche è 200 kHz ^{1, 7.} In questo lavoro, abbiamo dimostrato per la prima volta che la frequenza ottimale TTFields per ridurre il potenziale clonogenico è associato con la frequenza che porta al massimo effetto citotossico. I metodi utilizzati in questo lavoro per quantificare gli effetti di TTFields (cioè, citotossici e clonogeniche) unre solo due delle molte possibili dosaggi endpoint standard per valutare i risultati del trattamento. Ulteriori prove outcome trattamento comprendono: (1) di fissaggio, colorazione e montaggio dei vetrini sui quali le cellule sono piastrate su un microscopio per la visualizzazione delle strutture intracellulari; (2) eseguendo saggi di estratti proteici e RNA, sia dai piatti TTFields stessi o dopo il trasferimento il vetrino in un piatto monouso; e (3) trypsinizing cellule colorate per analisi citofluorimetrica.

pianificazione sperimentale Un'attenta avrà un impatto i risultati del trattamento dopo la consegna di TTFields. Le fasi principali includono garantire che la proliferazione cellulare durante l'esperimento non porta alla proliferazione e usando l'intensità del campo elettrico del caso, le intensità troppo elevati quando applicata alle linee cellulari sensibili comporterà troppo poche cellule per i saggi necessari per determinare la frequenza ottimale. Viceversa, TTFields applicato a bassissima intensitàsu linee cellulari meno sensibili comporterà piccoli effetti che può mascherare variazioni intrinseche. I registri di trattamento devono essere esaminati per preziose informazioni stabilità di temperatura, correnti elettriche, e resistenza per ogni piatto tutto l'esperimento. Sostituzione piatti difettosi all'inizio del trattamento e escludendo i dati da un piatto che non soddisfa i parametri di trattamento auspicabile minimizzare la variabilità tra le repliche.

In sintesi, TTFields sono una modalità di trattamento antitumorale emergente che ha già dimostrato efficacia e la sicurezza in ambito clinico ^{8, 9, 10.} TTFields prova in un ambiente in vitro utilizzando i protocolli descritti qui possono consentire l'ottimizzazione dei parametri di trattamento TTFields in ambito clinico e possono ampliare la nostra comprensione del meccanismo sottostante di azione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
inovitro system and software	Novocure	ITG1000 and IBP1000	Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.
Sterilization bags	Westfield medical	24882
Plastic cover slides	Thermo Scientific (NUNC)	174977	Pre treated and sterilized
Glass cover slides	Thermo Scientific (Menzel-Gläser)	CB00220RA1	Sterilize if necessary
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Biological Industries (Israel)	01-055-1A	Warm in 37 °C water bath before use
RPMI 1640	Gibco	21875-034	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries (Israel)	04-007-1A	Warm in 37 °C water bath before use
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
Pen/Strep (10,000 U/mL Penicillin, 10,000 µg/mL Streptomycin)	Gibco	15140-122
Sodium Pyruvate solution 100 mM	Biological Industries (Israel)	03-042-1B
Hepes buffer 1 M	Biological Industries (Israel)	03-025-1B
Insuline solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries (Israel)	03-050-1B	Warm in 37 °C water bath before use
Methanol	Merck	1.06009.2511	Cool to -20 °C in the freezer before use
Crystal violet	Sigma-Aldrich	120M1445	Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.
Light detergent	Alcononx	242985	Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions.
PBS	Biological Industries (Israel)	02-023-1A	Without calcium and magnesium
A2780	ECACC	93112519	Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12 mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2 mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insulin (10 µg/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2 mM).
refrigirated CO2 incubator	CARON	7404-10-3
Laminar flow cabinet	ADS Laminair	Bio12 and VSM12