Détermination de la fréquence inhibitrice optimale pour les cellules cancéreuses à l'aide de champs de traitement des tumeurs (TTFields)

Résumé

Les champs Traitement des tumeurs (TTFields) sont un moyen efficace de traitement anti-tumoral envoyé par l'application continue et non invasive de faible intensité, de fréquence intermédiaire, des champs électriques alternatifs. L' application TTFields à des lignées cellulaires en utilisant un système d'application in vitro TTFields permet la détermination de la fréquence optimale qui conduit à la plus forte réduction du nombre de cellules.

Résumé

Les champs de traitement des tumeurs (TTFields) sont une modalité de traitement efficace délivrée par l'application continue et non invasive de champs alternatifs à faible intensité (1-3 V / cm) dans la gamme de fréquences de plusieurs centaines de kHz. L'étude de TTFields dans la culture de tissus s'effectue à l'aide du système d'application in vitro de TTFields, qui permet l'application de champs électriques de fréquences et d'intensités variables aux boîtes de Petri en céramique à forte constante diélectrique (Ɛ> 5.000). Les lignées cellulaires cancéreuses plaquées sur des lamelles au fond des boîtes de Petri en céramique sont soumises à des TTFields livrés dans deux directions orthogonales à différentes fréquences pour faciliter les tests de résultats de traitement, tels que le nombre de cellules et les essais clonogènes. Les résultats présentés dans ce rapport démontrent que la fréquence optimale des TTFields à l'égard du nombre de cellules et des essais clonogènes est de 200 kHz pour les cellules ovariennes et les cellules de gliome.

Introduction

Les champs Traitement des tumeurs (TTFields) sont une modalité antimitotique pour le traitement de glioblastome et potentiellement d'autres types de cancer. Les champs sont fournis via l'application continue de faible intensité (1-3 V / cm), de fréquence intermédiaire (100-500 kHz), des champs électriques alternatifs à la région de la tumeur ^{1, 2.} L' application TTFields in vitro et in vivo a été montré inhiber à la fois la croissance de diverses lignées de cellules cancéreuses et la progression des tumeurs dans plusieurs modèles de tumeurs animales ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} essais cliniques pilotes et des études randomisées plus importantes chez les patients atteints de tumeurs solides, y compris le glioblastome et le cancer du poumon non à petites cellules, ont demonstclassé l'innocuité et l' efficacité d'application TTFields continue ^{8, 9, 10.} L'efficacité des TTFields a été trouvé pour être: (1) dépendant de la fréquence, avec des fréquences optimales spécifiques conduisant à la réduction la plus élevée dans le nombre de cellules de lignées cellulaires de différentes origines ^{1, 2, 4, 5, 6, 7;} (2) un champ électrique dépendant de l' intensité, avec un seuil minimal pour l' activité à environ 1 V / cm et plus puissants des intensités supérieures ^{1, 2, 7, 11;} (3) le renforcement lorsque la durée de traitement était plus ^5; et (4) plus élevée lorsque 2 TTFields directionnels ont été appliqués perpendiculairement à chaque othEr, par rapport aux champs électriques appliqués à partir d'une seule direction ¹ . Sur la base des résultats ci-dessus, TTFields peut être appliqué aux patients pour de longues durées en utilisant 2 ensembles de matrices de transducteurs localisés sur la peau des patients pour maximiser les intensités de champ électrique dans le lit de la tumeur ^{12 , 13} .

L'étude des effets de TTFields sur les cellules cancéreuses in vitro fournit actuellement la seule façon de déterminer la fréquence optimale à appliquer à un type de tumeur spécifique. Le test de la fréquence optimale nécessite un dispositif qui permet l'application de fréquences différentes dans la plage de 100-500 kHz et à des intensités allant jusqu'à 3 V / cm de carré de base (RMS) à la culture cellulaire. Comme l'application TTFields produit de la chaleur, le système d'application nécessite la capacité de dissiper la chaleur excessive tout en maintenant un contrôle strict de la température.

Plusieurs appareilse développé au fil des années pour permettre l'application TTFields à des cultures de cellules ^{1, 2, 5, 14, 15, 16.} Dans tous ces appareils, les électrodes utilisées sont isolés afin d'éviter les mises en garde liés à l'utilisation d'électrodes conductrices, telles que l' échange d'électrons à la surface de l' électrode et la libération d'ions métalliques toxiques dans le milieu ^1. La principale différence entre les différents isolation des systèmes d'application testés est le type de d'électrode TTFields utilisé, soit avec des électrodes constituées de fils métalliques isolés avec une couche mince d'isolant ^{2, 14, 15, 16} ou avec un matériau à forte constante diélectrique (par exemple, le magnésium niobate de plomb-plomb titanate (PMN-PT)) ^6. Alors que les électrodes fils isolés offrent une solution relativement simple et rentable pour l'application TTFields, ils sont souvent limités par la haute tension nécessaire pour atteindre des intensités de champ électrique efficace au-dessus du seuil de 1 V / cm et par la surface disponible pour le placage cellulaire, que la distance entre les électrodes est relativement faible. Les systèmes basés sur des électrodes isolées à l'aide d'une capacité de conception et de fabrication matériaux de haute constante diélectrique nécessitent spéciaux, mais ils ne nécessitent pas de haute tension et peuvent offrir une plus grande surface pour la croissance cellulaire entre les électrodes.

Le système d'application in vitro TTFields utilisée dans ce travail appartient à cette dernière catégorie de systèmes, avec l'unité de base étant une boîte de Petri (plat TTFields, voir la figure 1) , composée de haute céramique à constante diélectrique ( par exemple, PMN-PT). Deux paires d'électrodes sont imprimées perpendiculairement à l'extérieur walls d'un plat TTFields pour permettre l'application de champs électriques à partir de 2 directions. Les électrodes sont reliées à un générateur de forme d'onde sinusoïdale et d'un amplificateur, ce qui permet à une application TTFields dans la gamme de fréquences de 50 à 500 kHz. Afin de dissiper la chaleur excessive, les plats TTFields sont conservés dans un incubateur réfrigéré, avec le moyen de contrôle de température effectuée en utilisant une surveillance constante de la température de la vaisselle et des ajustements à la tension appliquée par le système. Dans la pratique, la mise en l'incubateur à une température inférieure conduirait à des intensités de champ électrique plus élevé, comme le système augmente la tension jusqu'à ce que la température de consigne à l'intérieur de la boîte est obtenue. La différence entre la température à l'intérieur de la capsule et la température de l'incubateur peut conduire à une certaine évaporation, en fonction des gradients de température; Par conséquent, les besoins du milieu de culture à remplacer toutes les 24 h pour maintenir des conditions de croissance adéquates.

Le protocole ci-dessousdécrit le processus expérimental pour optimiser l'application de fréquences TTFields aux cellules cancéreuses de sorte qu'une réduction maximale de la cellule compter et une réduction du potentiel des cellules survivantes pour former des colonies sont obtenues.

Protocole

1. TTFields in vitro Application System - plaque de base et d' entretien vaisselle

1. Rincer la vaisselle et les couvercles de plats sous l'eau courante du robinet. Rincez ensuite avec de l'eau déminéralisée et face à l'air sec vers le bas.
2. Si un agent / médicament chimiothérapeutique a été ajouté à des plats dans une expérience préalable, remplir chaque plat avec une solution de détergent légère 5% et laisser une nuit.
   1. Rincer la vaisselle à fond sous l'eau courante du robinet pour éviter toute trace de détergent dans le plat. Rincer la vaisselle et couvre plat avec de l'eau déminéralisée et le visage de l'air sec vers le bas.
3. Insérez la vaisselle propre et sec avec leurs couvertures dans des sacs de stérilisation. Seal et placer les sacs dans un autoclave, avec les plats face vers le bas. Autoclave pendant 30 minutes à non supérieure à 121 ° C.
4. Mettre l'autoclave sur un programme à sec, ouvrir partiellement la porte de l'autoclave, et sécher la vaisselle pendant 30 min.
5. Essuyez la plaque de base avec un chiffon légèrement imbibé d'éthanol à 70%.

2. Configuration de l'expérience

REMARQUE: Tous les équipements et matériaux utilisés dans ce protocole sont décrits dans la Liste des matériaux. Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées à l'intérieur d'une armoire à flux laminaire alors que des conditions stériles sont maintenues.

1. Préparez les plats et couvercles TTFields propres et stériles, comme décrit dans la section 1. Essuyez la plaque de base avec un chiffon légèrement humecté avec de l'éthanol à 70%.
2. Installez les plats TTFields avec les couvercles sur la plaque de base en appuyant doucement sur le plat et en tournant dans le sens des aiguilles d'une montre d'environ 5 mm jusqu'à ce que le bord du vaisselle se verrouille sur les trois broches de la plaque de base. Placez une lamelle stérile de 22 mm (plastique traité ou verre) au fond de chaque plat.
3. Préparez la suspension cellulaire dans un milieu de croissance complet (milieu Eagle modulé de Dulbecco pour U-87 MG et F98, RPMI pour A2780 et OVCAR-3, complété comme décrit dans Liste des matériaux).
   NOTE: Le CELes concentrations de ll dépendent du type de cellule et la durée de l'expérience, 80% de croissance cellulaire confluente -90% ne devrait pas être dépassée par la fin de l'expérience.
   MISE EN GARDE: les lignées cellulaires humaines peuvent représenter un danger biologique et doivent être manipulés avec les mesures de sécurité appropriées.
4. Placer 200 uL de suspension de cellules (habituellement 5,000-20,000 cellules dans 200 ul d'une expérience de 72 h, en fonction du temps de doublement) comme une goutte au centre de chaque lamelle et couvrir avec le couvercle plat.
5. Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ jusqu'à ce que les cellules adhèrent; une incubation d'une nuit est possible à ce stade.
6. Aspirer les fluides de la déposer à l'aide d'une pipette ou 200- 1000 pi.
7. pipette doucement 2 ml de milieu de croissance complet pour remplir chaque plat. Utiliser un embout stérile de pipette et appuyez doucement sur les bords de la lamelle afin de libérer les bulles d'air de temps en temps pris sous la diapositive.
8. Couvrir les plats avec leurs couvercles et les placer insUn incubateur de CO ₂ à 37 ° C jusqu'au début du traitement TTFields.

3. Application TTFields

1. Transférer les plaques de base avec les plats TTFields attachés à un incubateur de CO ₂ réfrigéré.
   NOTE: L' application in vitro de TTFields générera de la chaleur; Par conséquent, un incubateur réfrigéré est nécessaire pour compenser le réchauffement de la vaisselle. Les intensités plus élevées de TTFields produiront plus de chaleur et nécessiteront une température ambiante plus basse (voir le tableau 1 ). Les intensités TTFields cliniquement pertinentes sont atteintes lorsque la température de l'incubateur pour l'application TTFields se situe dans la plage de 18 à 30 ° C.
2. Connectez le connecteur femelle du câble plat à la plaque de base. Activez le générateur TTFields.
3. Démarrez le logiciel du système d'application in vitro de TTFields et sélectionnez les paramètres de l'expérience.
   1. Définissez une nouvelle expérience. Tapez le nom de l'experiment et le propriétaire de l'expérience dans l'interface utilisateur du logiciel sur l'écran d'ordinateur. Ajuster la fréquence et de la température cible pour chaque boîte ou plaque de base.
4. Démarrez l'application TTFields en utilisant le logiciel.
5. Assurez-vous que tous les plats sont branchés correctement et apparaissent en bleu clair sur le moniteur. Si un plat est entouré d'un cadre rouge (ce qui signifie qu'il ne soit pas correctement connecté), appuyez doucement vers le bas et tourner lentement avant et en arrière jusqu'à ce que les contacts sont restaurés et le plat apparaît en bleu clair.
6. Laissez les TTFields dans le système d'application en cours d' exécution in vitro jusqu'à 24 h.
7. Si l'expérience atteint son point final, arrêter l'expérience en cliquant sur le bouton FIN EXPERIMENT dans le logiciel et passez à l'étape 5. Sinon, cliquez sur l'expérience PAUSE.
8. Déconnecter le connecteur de câble plat de la plaque de base. Retirer la plaque de base avec les plats de l'incubateur dans une hotte à flux laminaire.
9. Remplacez le support dans tous plates toutes les 24 h et retourner la plaque de base à l'incubateur réfrigéré. Raccorder la plaque de base pour le générateur à l'aide du câble plat. Continuez l'expérience en cliquant sur le bouton CONTINUER.

4. Les échantillons de contrôle

Remarque: Cultiver les cellules de contrôle dans des conditions similaires aux cellules traitées TTFields, à l' exclusion TTFields l' application.

1. Des échantillons de contrôle de la plaque avec la même suspension et sur une surface similaire à celle utilisée pour plaquer des échantillons TTFields traités.
2. Placer les plats de contrôle dans un incubateur à _CO2 à 37 ° C.
3. Remplacez le support dans les plats toutes les 24 h pour répondre aux conditions de milieu plat traités TTFields.

5. Expérience Fin

1. Après avoir cliqué sur FIN EXPERIMENT, attendez que le logiciel pour récupérer tous les enregistrements du système et de sauvegarder les enregistrements sur l'ordinateur.
2. Utilisez le bouton RAPPORTS pour examiner la température, journal en cours, et la résistance files de chaque plaque de base pour vérifier que tous les plats ont été traités selon le plan expérimental.
   REMARQUE: Tous les rapports et les journaux sont enregistrés sur l'ordinateur après la fin de l'expérience et peuvent être révisées à tout moment.
3. Éteignez le générateur TTFields.
4. Déconnecter le câble plat de la plaque de base et la retirer de l'incubateur.
5. Pour retirer un plat en céramique, presse vers le bas et tourner l'antenne dans le sens antihoraire pour le déverrouiller de la plaque de base.
6. Prenez la vaisselle dans une hotte à flux laminaire et aseptiques retirer les lamelles. les transférer vers stériles boîtes de Petri contenant du milieu frais ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour plus d'inspection et d'évaluation.

6. Evaluation de l'effet de TTFields

NOTE: Les effets de TTFields peuvent être déterminées de plusieurs façons. Utiliser une ou plusieurs des méthodes suivantes pour comparer les cellules traitées à des cellules témoins non traitées:

1. Nombre de cellules
   1. Retirez le milieu / PBS de chaque plat contigu.
   2. Ajouter 0,5 ml de trypsine / EDTA à 0,25% à chaque plat et incuber pendant 10 minutes ( c.-à-d., Jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher de la surface de la lamelle) à 37 ° C dans un incubateur de CO ₂ .
   3. Ajouter 0,5 ml du milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine et ré-suspendre les cellules en faisant pipeter doucement vers le haut et vers le bas.
   4. Comptez les cellules en utilisant une technique de comptage de cellules standard qui est compatible avec le dépouillement de petites concentrations cellulaires ( c.-à-d. Environ 20.000 cellules / mL).
2. Dosage clonogène
   1. Placer un nombre similaire de cellules (100 à 500 cellules par plat) de chaque plat sur de nouvelles boîtes de Petri stérile ou des plaques à 6 puits contenant 2 ml de milieu de croissance complet frais.
   2. Incuber dans un incubateur de CO ₂ à 37 ° C pendant 1 à 3 semaines (selon les propriétés de chaque lignée cellulaire) jusqu'à formation de colonies constituées de ~ 50 cellules. Évaluer la cellulenombre par colonie par microscopie optique.
   3. Retirez le support et rincer avec du PBS.
   4. Retirez le PBS et ajouter du méthanol glacé (1 ml). Incuber à -20 ° C pendant 10 minutes ou plus.
   5. Retirez le méthanol.
   6. Ajouter une solution de cristal violet (0,1% p / v dans 25% v / v de methanol dans de l'eau) et incuber pendant 20 min.
      ATTENTION: Le cristal violet est un cancérigène potentiel; utiliser des gants tout en travaillant avec du cristal violet.
   7. Retirez le cristal violet, laver 3 fois avec de l'eau déminéralisée et de l'air sec.
   8. Compter les colonies formées dans chaque plat.

Résultats

Les résultats après l'application TTFields lors de la numérisation des fréquences différentes peuvent être quantifiés en fonction des différents tests, tels que le nombre de cellules, les dosages colorimétriques, des dosages clonogéniques et des examens sur les changements dans le nombre de cellules qui envahissent l'aide d'une chambre de Boyden placé à l'intérieur d'un TTFields spéciaux à paroi élevée boîte de culture cellulaire. planification expérimentale minutieuse basée sur le temps de doublement des cellules prédéterminées permettra aux cellules d'atteindre le nombre maximal d'événements mitose pendant la durée du traitement, maximisant ainsi les résultats du traitement.

La figure 2 illustre un résultat d' analyse de fréquence typique pour un comptage de cellules moyen (nombre de cellules) et de dosage clonogénique de A2780 ( par exemple, des cellules cancéreuses d' ovaire humain, figure 2A) ⁷ et F-98 ( à savoir, des cellules de gliome de rat;« > Figure 2B) ¹ traité avec deux TTFields directionnels (gamme de fréquences: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm, et la température de l' incubateur.: 18 ° C) Les résultats démontrent une réduction significative dans les comptages de cellules à toutes les fréquences appliquée , avec la réduction maximale à 200 kHz pour toutes les lignées cellulaires testées (ANOVA à une voie avec comparaison multiple). la fréquence optimale conduisant à la plus forte réduction du potentiel clonogénique a été le même pour les deux cellules A2780 et F98 (figures 2B et C) . le coefficient de corrélation de Pearson entre le nombre de cellules et l'effet clonogénique à chaque fréquence était 0,967 (p = 0,002) et 0,755 (p = 0,083) pour A2780 et F98, respectivement.

La figure 3 montre un résultat d' analyse de fréquence pour le comptage de cellules moyen pour OVCAR-3 (c. -à- cellules cancéreuses d' ovaire humain, figure 3A) et U-87 MG (soit des cellules de gliome humain; Figure 3B) des cellules traitées avec deux directions de TTFields à différentes intensités (RMS: 1,7, 1,3 et 1,0 V / cm, respectivement, et la température d'incubation: 18 ° C, 24 ° C et 28 ° C, respectivement). Les résultats montrent que bien qu'il y ait encore une réduction significative du nombre de cellules OVCAR-3 après traitement avec / cm TTFields 1,3 V (température de l'incubateur: 24 ° C), l'effet est relativement faible par rapport aux résultats obtenus lorsque les cellules ont été traitées avec 1,7 V / cm (température de l'incubateur: 18 ° C). U-87 cellules MG traitées avec / cm TTFields 1,0 V (température de l'incubateur: 28 ° C) montrent aussi une tendance similaire dans la réduction du nombre de cellules que lorsqu'ils sont traités avec 1,7 V / cm, mais l'effet n'a pas été significative à des intensités plus faibles .

figurE 1 . Les plats TTField ont été installés sur une plaque de base et sont connectés au câble de commande TTFields plat. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 . Numérisations de fréquence pour la détermination de la fréquence inhibitrice TTFields optimale pour les cellules A (A) A2780 et (B) F98. Les cellules ont été traitées pendant 72 h avec TTFields de différentes fréquences (1,7 V / cm et 100-500 kHz). L'effet du traitement TTFields a été estimé en utilisant le nombre de cellules et les analyses clonogènes. La flèche indique la fréquence optimale. Les résultats représentent des moyennes ± SD basées sur au moins 6 répétitions pour chaque fréquence testée. ( C ) Des images représentatives de la s clonogénique urvival des cellules A2780 après traitement TTFields à diverses fréquences. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3. Balayages de fréquence pour la détermination de la fréquence d' inhibition optimale de TTFields pour (A) OVCAR-3 et (B) cellules U-87 MG. Les cellules ont été traitées pendant 72 h avec TTFields de différentes fréquences (100 à 500 kHz) et les intensités (OVCAR-3: 1,3 et 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 et 1,7 V / cm). L'effet du traitement TTFields a été estimée à l'aide du nombre de cellules. La flèche indique la fréquence optimale. Les résultats représentent la moyenne ± SD à base d'au moins 6 réplicats de chaque fréquence testée.pg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Incubateur température ambiante	TTFields intensités attendues
(° C)	(V / cm RMS)
18	1,62
19	1,55
20	1,48
21	1,41
22	1.33
23	1,26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0,97
28	0,9
29	0,83
30	0,76

Tableau 1. Température ambiante de l'incubateur et intensités TTField prévues dans le plat TTFields.

Discussion

TTFields sont une modalité anti-tumorale émergente en fonction de l'application continue des champs électriques alternatifs correctement réglés ^{1, 2, 8, 9, 10, 17.} Assurer une efficacité maximale anti-tumorale est un résultat souhaitable pour toutes les modalités de traitement. Ainsi, le « combat » pour chaque pour cent supplémentaire d'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses peut avoir un effet significatif sur les résultats cliniques à long terme pour les patients. Ceci est dû à la nature continue de l'application nécessaire TTFields et l'effet cumulatif résultant. Maximiser l' application TTFields peut être obtenue de plusieurs façons: (1) l' augmentation de l'intensité de champ électrique ^{1, 7,} (2) la durée du traitement d'allongement ^5, (3) trouver le plus efficace Combinatiavec d' autres modalités de traitement ^{18, 19,} et (4) définissant la fréquence optimale ^{1, 2, 4, 6, 7.} La maximisation de l'intensité de champ électrique au niveau du site de la tumeur est obtenue grâce à l'optimisation de l'emplacement des matrices sur la peau du patient; cela permet la livraison de l'intensité du champ maximal à la tumeur en fonction de l'anatomie individuelle du patient ^20. L' allongement de la durée de traitement repose principalement sur l' observance des patients avec un traitement (pendant au moins 18 h par jour) ^17. Trouver la bonne combinaison avec d' autres thérapies et déterminer la fréquence optimale dépend en grande partie sur les résultats in vitro, car aucun des marqueurs validés pour les résultats du traitement TTFields sont actuellement disponibles. Dans ce travail, nous avons décrit la p expérimentaleROCÉDURES nécessaires pour déterminer la fréquence TTFields optimale pour les lignées de cellules cancéreuses à l' aide du système d'application in vitro TTFields. Les méthodes décrites ici peuvent potentiellement être utilisées pour sélectionner la combinaison d'autres modalités de traitement du cancer (par exemple, les agents de chimiothérapie ou irradiation) avec TTFields et de déterminer la fréquence optimale pour l' administration TTFields pour chaque traitement combiné spécifique.

Conformément aux publications précédentes, les résultats présentés ici démontrent que la fréquence optimale pour le traitement des deux cellules gliales et les cellules cancéreuses de l' ovaire est de 200 kHz ^{1, 7.} Dans ce travail, nous avons démontré pour la première fois que la fréquence TTFields optimale pour réduire le potentiel clonogénique est associé à la fréquence qui conduit à l'effet cytotoxique maximale. Les méthodes utilisées dans ce travail pour quantifier les effets de TTFields ( par exemple, cytotoxiques et clonogénique) unNe sont que deux des nombreux tests d'extrémité standard possibles pour évaluer les résultats du traitement. Les tests de résultats de traitement supplémentaires comprennent: (1) la fixation, la coloration et le montage des lamelles sur lesquelles les cellules sont plaquées au microscope pour la visualisation des structures intracellulaires; (2) effectuer des essais d'extraits de protéines et d'ARN, soit à partir des plats TTFields eux-mêmes, soit après avoir transféré le lamelle à un nouveau plat jetable; Et (3) des cellules de trypsinisation colorées pour une analyse de cytométrie en flux.

Une planification expérimentale minutieuse aura une incidence sur les résultats du traitement après la livraison de TTFields. Les étapes clés consistent à s'assurer que la prolifération cellulaire tout au long de l'expérience ne mène pas à une prolifération excessive et à l'intensité de champ électrique appropriée, car des intensités trop élevées lorsqu'elles sont appliquées à des lignées cellulaires sensibles entraîneront aussi peu de cellules pour les essais requis pour déterminer La fréquence optimale. À l'inverse, TTFields appliqué à très faible intensitésur des lignées de cellules moins sensibles se traduira par de petits effets qui peuvent être masqués par des variations inhérentes. Les journaux de traitement doivent être examinées pour obtenir des informations précieuses sur la stabilité de la température, les courants électriques et de résistance pour chaque plat tout au long de l'expérience. Remplacement des plats défectueux au début du traitement et à l'exclusion des données à partir d'un plat qui ne répond pas aux paramètres de traitement souhaitables minimisera la variabilité entre les réplicats.

En résumé, TTFields sont une modalité de traitement anticancéreux émergents qui a déjà démontré son efficacité et de la sécurité dans les milieux cliniques ^{8, 9, 10.} TTFields test dans un cadre in vitro en utilisant les protocoles décrits ici peuvent permettre l'optimisation des paramètres de traitement TTFields dans le milieu clinique et peut élargir notre compréhension du mécanisme d'action sous - jacente.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
inovitro system and software	Novocure	ITG1000 and IBP1000	Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.
Sterilization bags	Westfield medical	24882
Plastic cover slides	Thermo Scientific (NUNC)	174977	Pre treated and sterilized
Glass cover slides	Thermo Scientific (Menzel-Gläser)	CB00220RA1	Sterilize if necessary
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Biological Industries (Israel)	01-055-1A	Warm in 37 °C water bath before use
RPMI 1640	Gibco	21875-034	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries (Israel)	04-007-1A	Warm in 37 °C water bath before use
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
Pen/Strep (10,000 U/mL Penicillin, 10,000 µg/mL Streptomycin)	Gibco	15140-122
Sodium Pyruvate solution 100 mM	Biological Industries (Israel)	03-042-1B
Hepes buffer 1 M	Biological Industries (Israel)	03-025-1B
Insuline solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries (Israel)	03-050-1B	Warm in 37 °C water bath before use
Methanol	Merck	1.06009.2511	Cool to -20 °C in the freezer before use
Crystal violet	Sigma-Aldrich	120M1445	Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.
Light detergent	Alcononx	242985	Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions.
PBS	Biological Industries (Israel)	02-023-1A	Without calcium and magnesium
A2780	ECACC	93112519	Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12 mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2 mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insulin (10 µg/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/mL), sodium pyruvate (1 mM) and glutamine (2 mM).
refrigirated CO2 incubator	CARON	7404-10-3
Laminar flow cabinet	ADS Laminair	Bio12 and VSM12